芍藥內酯苷對人卵巢癌多藥耐藥的逆轉作用

韓 立，郭曉娟，杜瑞娟，陳 怡，費慶林，郭克磊，卞 華

(1.南陽理工學院張仲景國醫國藥學院，2.南陽理工學院，河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室，河南 南陽 473004)

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，以上皮性卵巢癌居多[1]。外科手術結合基于鉑類的化療或者不宜手術的患者直接進行化療是目前卵巢癌的治療方式。然而，化療導致的腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)始終是臨床腫瘤治療難以逾越的障礙。

MYC(也稱為c-myc)是編碼轉錄因子的調節基因或原癌基因家族第一個發現的基因，該基因家族還包括l-myc(MYCL)和n-myc(MYCN)。MYC高表達可促進卵巢癌的發展、浸潤和轉移，并與CDK4/6抑制劑單藥治療復發性卵巢癌的臨床療效差密切相關[2]。此外，MYC可通過直接與程序性死亡蛋白-1(programmed death 1，PD-1)啟動子結合而調控其表達，MYC激活可促進PD-1表達，抑制MYC則抑制PD-1表達，增強腫瘤對抗PD1免疫治療的敏感性，表明MYC本身可作為抗腫瘤治療的一個重要靶點[3]。WW結構域E3泛素連接酶1(WW domain-containing ubiquitin E3 ligase 1，WWP1)高表達與卵巢癌預后差密切相關[4]。有研究表明，MYC通過直接靶向WWP1，促進腫瘤MDR[5]。因此，靶向MYC和WWP1開發逆轉MDR藥物對于臨床腫瘤的治療具有重要意義。

芍藥內酯苷(albiflorin，AL)是芍藥、牡丹皮等中藥的活性成分之一，具有治療認知功能障礙和鎮痛等作用[6-7]。有研究發現，AL對肝癌HepG2細胞增殖和侵襲有抑制作用[8]。此外，AL可抑制藥物跨膜轉運模型細胞MDCK-MDR1中ATP結合盒亞家族B成員1(ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1)編碼的泵藥蛋白P-糖蛋白( P-glycoprotein，P-gp)表達[9]，具有潛在的腫瘤耐藥逆轉作用。因此，本研究旨在探討AL對卵巢癌的耐藥逆轉作用及其對MYC、WWP1的影響，為AL開發作為腫瘤耐藥逆轉劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥物注射用順鉑(20mg，8L012A88)，齊魯制藥有限公司；MYC抑制劑MYCi975(純度98.95%，S8906)，美國Selleck Chemicals公司；芍藥內酯苷(純度≥98.0%，HY-N0037)，美國MCE公司。

1.2 主要試劑與儀器SPARKeasy 總RNA快速提取試劑盒(AC0205，山東思科捷生物技術有限公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒(K1662，美國Thermo Fisher)，QuantiNova SYBR Green PCR 試劑盒(208054，美國QIAGEN)，MinuteTM總蛋白提取試劑盒(SN001，美國Invent Biotechnologies公司)，HRP直標GAPDH鼠單抗(HRP-60004，PROTEINTECH)，Pierce Rapid Gold BCA蛋白濃度檢測試劑盒(A53225，美國Thermo Fisher)，Kemix速溶快速封閉顆粒(KSF0101)、ECL超敏化學發光試劑盒(KE0102-100，密碼子(中國)生物科技公司)，優級胎牛血清(CTCC-002-001)、RPMI1640培養基(CTCC-002-006，浙江美森細胞科技有限公司)，羅丹明123(R8004，Sigma公司)，CCK-8試劑盒(BS350B，蘭杰柯科技有限公司)，MYC兔單抗(ab32072)、WWP1兔多抗(ab43791)、P-gp兔單抗(EPR10364-57，Abcam公司)，HRP標記羊抗兔二抗(5220-0336，美國KPL)。實時熒光定量PCR儀(ABI ViiA7，賽默飛世爾公司)，流式細胞儀(FACSCelesta，BD公司)，凝膠化學發光成像系統(Tanon-5200，上海天能公司)，全功能酶標儀(Synergy H1，美國BioTek公司)。

1.3 細胞培養和MYC敲低細胞株構建293T細胞、人卵巢癌順鉑敏感SKOV3細胞及其耐順鉑SKOV3/DDP細胞購自浙江美森細胞科技有限公司，于37 ℃、5% CO2條件下培養在含10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 kU·L-1的RPMI 1640培養基中。SKOV3/DDP細胞在培養過程中加入2 μmol·L-1的順鉑維持耐藥性。細胞每3 ～4 d胰蛋白酶消化傳代1次。

設計合成靶向MYC的ShRNA序列(如Tab 1所示)克隆入pLKO.1載體，挑選陽性克隆測序驗證后，感染293T細胞，用puromycin篩選基因組穩定整合靶向MYC-shRNA序列的細胞。繼續培養293T細胞48 h，收集含有慢病毒顆粒的上清液。采用收集的上清液轉染至SKOV3/DDP細胞，繼續用puromycin篩選，構建MYC穩定敲低的shMYC-SKOV3/DDP細胞株。收取部分細胞提取總RNA和蛋白，驗證MYC敲低效果。

1.4 細胞毒性檢測取對數生長期的SKOV3/DDP和SKOV3細胞，以及shMYC-SKOV3/DDP細胞，分別接種96孔板，每孔100 μL，含5 000個細胞。對于AL單用的細胞毒性檢測，細胞貼壁后加入不同濃度AL，溶劑加入含細胞孔作為陰性對照，無細胞培養基作為背景對照。AL的耐藥逆轉作用檢測分組為：各孔加入不同濃度的順鉑，或者AL聯用順鉑。同時增加MYC抑制劑MYCi975單用或聯用順鉑組。各組細胞48 h后加入10 μL CCK-8，繼續孵育2 h。酶標儀檢測450nm處每孔吸光度值(A)，各孔吸光度值減去背景值，計算細胞存活率，細胞存活率/%=(A實驗-A背景)/(A對照-A背景)×100%。根據細胞存活率計算順鉑或者AL聯用順鉑的半數抑制濃度(median inhibitory concentration，IC50)。

1.5 P-gp功能檢測取對數生長期的SKOV3/DDP細胞，分為AL 25、50、100 μmol·L-1組，并設空白對照和陽性對照MYCi975組。另取shMYC-SKOV3/DDP細胞，比較其與SKOV3/DDP細胞P-gp功能的差異。細胞處理48 h后，胰酶消化并加入終濃度為0.5 mg·L-1的羅丹明123(rhodamine 123，Rho123)。在細胞培養環境下繼續孵育60 min，冰PBS洗滌3次后，重懸于0.5 mL冰 PBS中，立即采用流式細胞儀檢測。FACS Diva軟件分析羅丹明123的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.6 芍藥內酯苷對SKOV3/DDP耐藥相關基因表達的影響取對數生長期的SKOV3/DDP細胞，接種于12孔板，藥物分組和培養條件同1.5。加藥孵育48 h后，按照總RNA快速提取試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用熒光定量PCR擴增各目的基因，引物序列如Tab 1所示。以GAPDH為內參基因，采用2-△△Ct法計算各藥物處理組MYC、WWP1和MDR1 mRNA相對于對照組表達量的變化，其中ΔΔCt=(Ct目標基因- Ct內參基因)處理組-(Ct目標基因- Ct內參基因)對照組。

Tab 1 shRNA sequence for MYC and primers for MYC，WWP1，MDR1 and GAPDH

1.7 芍藥內酯苷對SKOV3/DDP耐藥相關蛋白表達的影響SKOV3/DDP細胞處理和分組同“1.5”，孵育48 h后，棄去培養基，蛋白裂解液裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜。Kemix快速封閉液封閉，加入MYC、WWP1、P-gp蛋白一抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入對應HRP標記兔二抗室溫孵育2 h，在凝膠成像分析系統中進行化學發光顯影。HRP直標GAPDH鼠單抗直接孵育2 h，化學發光檢測GAPDH條帶。ImageJ軟件分析成像蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值計算各條帶相對比值，以各藥物處理組相對比值除以空白對照組相對比值計算蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 芍藥內酯苷對SKOV3和SKOV3/DDP 細胞存活率的影響Fig 1結果顯示，25、50和100 μmol·L-1AL作用于SKOV3和SKOV3/DDP細胞48 h，對兩種細胞的毒性均較低。25 μmol·L-1AL處理后，兩種細胞的存活率均在90%以上。因此，該濃度作為后續耐藥逆轉試驗的聯合用藥濃度。

Fig 1 Effect of albiflorin on survival rate of SKOV3 and

2.2 芍藥內酯苷對 SKOV3/DDP 細胞的耐藥逆轉作用Tab 2結果顯示，shMYC-SKOV3/DDP細胞對順鉑的IC50為(5.74±0.26) mg·L-1，與SKOV3/DDP細胞相比明顯下降，提示敲低MYC可以逆轉SKOV3/DDP細胞的耐藥性。8 μmol·L-1MYCi975聯用順鉑后，順鉑對SKOV3和SKOV3/DDP細胞的IC50均明顯下降，提示其可能兼具抗腫瘤和逆轉腫瘤耐藥作用。SKOV3/DDP細胞經25 μmol·L-1AL聯用順鉑處理后，對順鉑的IC50從(14.46±0.44) mg·L-1降為(4.92±0.19) mg·L-1，表明其具有耐藥逆轉作用。

Tab 2 Effects of albiflorin on SKOV3/DDP cell

2.3 芍藥內酯苷對P-gp功能的抑制作用Fig 2 A和C結果顯示，與正常SKOV3/DDP細胞相比，shMYC-SKOV3/DDP細胞峰右移，MFI增加，表明敲低MYC可抑制P-gp功能。Fig 2 B和D結果顯示，SKOV3/DDP細胞經AL處理后，隨著AL濃度增加，峰逐漸右移，MFI逐漸增加，提示AL對P-gp功能的抑制具有濃度依賴性(P<0.01)。MYCi975抑制P-gp功能作用強于AL 50 μmol·L-1組，弱于AL 100 μmol·L-1組。

Fig 2 P-gp function changes after SKOV3/DDP cells knocked-down MYC or treated with different A：Histogram Overlay of SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells treated with Rho123;B：Histogram Overlay of SKOV3/DDP cells treated with albiflorin and Rho123;C：Comparison of Rho123 MFI in SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells;D：Comparison of Rho123 MFI in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin.##P<0.01 vs SKOV3/DDP group，**P<0.01 vs control group，ΔΔP<0.01 vs AL 100 μmol·L-1 group.

2.4 芍藥內酯苷對ABCB1、MYC和WWP1基因表達的影響Fig 3結果顯示，與正常SKOV3/DDP細胞相比，MYC敲低后，shMYC-SKOV3/DDP細胞中MYC、WWP1和ABCB1 mRNA均明顯下調(P<0.01)，提示敲低shMYC-SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性增加可能與抑制MYC、WWP1和ABCB1 mRNA表達有關。SKOV3/DDP細胞中MYC、WWP1和ABCB1 mRNA表達隨AL濃度增加而下降(P<0.05，P<0.01)，100 μmol·L-1AL組對ABCB1和WWP1 mRNA的抑制作用與MYCi975相當(P>0.05)。

2.5 芍藥內酯苷對P-gp、MYC和WWP1蛋白表達的影響Fig 4 結果顯示，與正常SKOV3/DDP細胞相比，MYC敲低后，shMYC-SKOV3/DDP細胞中MYC、WWP1和P-gp蛋白表達幾乎完全被抑制，提示敲低MYC后，shMYC-SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性增加可能與抑制MYC、WWP1、和P-gp蛋白表達有關。SKOV3/DDP細胞中，隨著AL濃度增高，對MYC、WWP1和P-gp蛋白表達的抑制作用逐漸增強。100 μmol·L-1AL組對ABCB1、WWP1 和MYC蛋白的抑制作用與MYCi975相當。

3 討論

鉑類藥物用于卵巢癌化療已有40多年歷史，至今仍是卵巢癌的一線治療藥物之一，顯示了鉑類藥物抗腫瘤的臨床有效性，但MDR的產生限制了其療效。腫瘤對鉑類耐藥的機制較多，例如泵藥蛋白增加導致瘤細胞內藥物濃度下降、瘤細胞對DNA損傷的修復能力增強等，不同的耐藥機制又彼此影響，增加了MDR的復雜性。其中，P-gp是重要的泵藥蛋白之一，其高表達亦是卵巢癌對鉑類藥物耐藥的重要原因[10]。自從上個世紀七十年代發現P-gp以來，研究人員一直沒有停止以P-gp為靶點開發逆轉腫瘤MDR的藥物，但至今仍無一種P-gp抑制劑批準用于臨床，這些藥物大多因人體毒性或臨床療效不理想而止步于臨床試驗階段[11]。因此，探尋P-gp表達增高，導致MDR的深層機制和/或開發高效、低毒的抑制劑一直是科研人員努力的方向。

從包括中藥在內的天然產物中篩選低毒性、多靶點和具有良好耐受性的MDR逆轉劑逐漸成為研究重點和熱點。作為一種來源于中藥的天然成分，AL以超過臨床3 000倍的劑量給予比格犬，未引起任何明顯的毒性反應，證明其具有極高的安全性[12]。AL治療認知功能障礙、鎮痛、抗癌等作用與其調控p38 MAPK、AKT、NF-kB 等信號通路有關，表明其藥理作用具有多通路、多靶點調控特點[6-8]。我們前期研究發現，方中包括芍藥的桂枝茯苓丸可通過抑制PI3K/AKT通路、異黏蛋白(metadherin，MTDH)和誘導PTEN表達逆轉卵巢癌MDR[13-14]，本課題研究AL逆轉卵巢癌MDR的作用機制，旨在為桂枝茯苓丸逆轉MDR進一步提供實驗基礎。

Fig 3 Effect of albiflorin on ABCB1，MYC and WWP1 mRNA expression The relative mRNA level for ABCB1，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells;B，C and D.The relative mRNA levels of ABCB1，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin.##P<0.01 vs SKOV3/DDP group;*P<0.05，**P<0.01 vs control group，ΔΔP<0.01 vs AL 100 μmol·L-1 group.

Fig 4 Effect of albiflorin on P-gp，MYC and WWP1 protein expression A：Western blot results for P-gp，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP and shMYC-SKOV3/DDP cells;B：Western blot results for P-gp，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin;C，D and E：The relative protein expressions levels of P-gp，MYC and WWP1 in SKOV3/DDP cells treated with albiflorin.*P<0.05，**P<0.01 vs control group.

MYC是調控P-gp表達的一個上游靶點，可能通過多種途徑調控P-gp表達。E3 泛素連接酶在泛素化級聯的最后一步發揮關鍵作用，通過特異性結合底物蛋白來確定哪種蛋白質被泛素化。WWP1是一種是HECT(homologous to E6AP C-terminus)類E3泛素連接酶，是一個重要的抗腫瘤藥物作用靶點[15]。MYC高表達直接上調其靶基因WWP1表達，促進磷酸酶和張力蛋白類似物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)多聚泛素化，從而抑制PTEN的二聚化、膜募集和腫瘤抑制功能，進一步激活PI3K/AKT通路，調控P-gp，促進腫瘤MDR[5]。另有研究表明，核內小RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12)亦是MYC的靶基因，MYC抑制SNHG12表達，進而抑制P-gp表達，增強鼻型NK/T細胞淋巴瘤細胞對順鉑的敏感性[16]。

MYCi975是特異性MYC抑制劑，8 μmol·L-1即可明顯抑制MYC的表達[17]，因此本研究中選擇此濃度作為MYC抑制的陽性對照濃度。Rho123是經典P-gp底物，用于P-gp功能評估，在本研究中作為P-gp功能指示劑[18]。本研究發現，AL聯用順鉑可明顯降低SKOV3/DDP細胞的耐藥性，減弱P-gp的泵藥作用。同時，采用shRNA敲低MYC表達后，SKOV3/DDP細胞的耐藥性下降，P-gp泵藥作用同時減弱。經比較，AL的耐藥逆轉和對P-gp功能的抑制作用與MYCi975抑制和MYC敲低效果均類似。為進一步探討AL逆轉耐藥的機制，考察了AL對ABCB1/P-gp、MYC和WWP1基因和蛋白表達的影響。結果發現，AL可明顯抑制ABCB1/P-gp、MYC和WWP1基因和蛋白表達。AL對這些基因的抑制作用同樣與MYCi975抑制和MYC敲低效果類似。這些結果表明，AL對SKOV3/DDP細胞的耐藥逆轉作用與減弱P-gp功能，抑制ABCB1/P-gp、MYC和WWP1基因和蛋白表達有關。值得注意的是，中晚期腫瘤患者多受癌痛折磨，AL本身具有鎮痛作用[6]，其作為化療輔助用藥在逆轉腫瘤耐藥性，降低化療藥物劑量的同時，預期可以減輕患者的痛苦。

本研究為AL作為耐藥逆轉劑用于卵巢癌的治療提供了實驗基礎，同時對于腫瘤耐藥逆轉劑的開發提供了一種潛在的新策略，對臨床腫瘤的治療具有重要意義。然而，25 μmol·L-1AL聯用順鉑的逆轉耐藥作用雖然與8 μmol·L-1MYCi975聯用順鉑的作用相近，但前者對ABCB1/P-gp、MYC和WWP1以及P-gp功能的抑制作用明顯弱于后者，提示AL可能還有其他潛在的逆轉耐藥調控機制，有待進一步研究驗證。