基于網絡藥理學的山豆根調控白細胞跨內皮遷移通路改善急性咽炎的作用機制

黨兆巖，劉 暢，何倩倩，俸婷婷，權 偉，董 秀，周 英,3

(1.貴州中醫藥大學藥學院/藥食兩用資源應用與開發研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州三力制藥股份有限公司，貴州 安順 561100；3.貴州省藥食同源植物資源開發工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025)

山豆根(SophoratonkinensisGagnep)是槐屬豆科植物山豆根的干燥根與根莖的統稱，目前廣泛用于治療咽嚨腫痛、牙齦腫脹和病毒性肝炎等[1]。其主要成分為三萜類化合物、黃酮和喹啉利啶生物堿。藥理研究表明，山豆根具有多種藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、抑制胃酸分泌，等等[2]。山豆根常用于治療炎癥性疾病，包括咽炎、扁桃體炎等。最近的研究表明，從山豆根中分離得到的黃酮類化合物苦參素B和6，8-二戊烯基-7，4′-二羥基黃烷酮具有抗炎作用[3]。越來越多的證據支持山豆根治療炎癥性疾病，以及作為一種天然藥物來衍生治療炎癥藥物制劑[4]。

急性咽炎是咽部黏膜和周圍淋巴組織的炎癥，往往是由各種病毒或細菌感染所引起的。急性咽炎是一種非常常見的疾病，通常是良性的[5]。急性咽炎相關的咽痛、發燒和咽部異物感會令人感到不適[6]。導致喉嚨痛的非傳染性因素非常多，包括物理化學因素(如吸煙、打鼾、喊叫、吸毒)和環境因素(如污染、溫度、濕度)[7]。急性咽炎的模型通常是使用氨水、辣椒素等刺激物建立的，這些刺激物被用來模擬環境污染或不健康的人類生活方式。目前急性咽炎的臨床治療主要圍繞糖皮質激素、抗生素和非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的使用。然而，長期使用阿司匹林或地塞米松等藥物治療可能會導致胃黏膜、肝臟或腎臟損傷，以及其他不可預見的副作用。研究表明，許多中藥對急性咽炎有有益的作用，有可能減緩過度的炎癥進展，恢復咽喉組織部位的穩態[8-9]。

本研究首先通過中藥網絡藥理學方法，預測山豆根改善急性咽炎的潛在成分、作用靶點和分子通路，接著利用動物實驗和熒光定量PCR技術實驗進行進一步的驗證，闡明山豆根改善急性咽炎的潛在機制，以期為山豆根改善急性咽炎的作用機制提供方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥材與試劑SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量(180±20) g，購于西南醫科大學實驗動物中心，實驗動物合格證號SYXK(川)2018-17。動物實驗方案符合貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準要求，且實驗均按照相關指導原則和規定進行。

山豆根，貴州三力制藥股份有限公司提供，經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為豆科越南槐(SophoratonkinensisGagnep)的干燥根及根莖。稱取山豆根1 000 g，置2 000 mL圓底燒瓶中，以10倍量、8倍量、8倍量水回流提取3次，每次1 h，合并3次濾液，濃縮得浸膏，低溫保存備用。白細胞介素6(IL-6，ZC36404-2106A28)、白細胞介素10(IL-10，ZC36379-2106A19)、前列腺素E2(PEG2，ZC37100-2106A21)檢測試劑盒，上海茁彩生物科技有限公司，總RNA提取試劑盒(W9908)、逆轉錄試劑盒(W9813)，熒光定量試劑盒(W9611)，天根生化科技(北京)有限公司，水合氯醛(0616A20)，北京市雷根生物技術有限公司。

1.2 儀器、數據庫及分析軟件Multlskan Mk3酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)，數碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業集團)，N60系列超微量分光光度計(德國IMPLEN)，CFX Connect三通道梯度熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；UniProt數據庫(https：// www.uniprot.org /)；GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)；OMIM數據庫(http：//www.omim.org/)；Venny2.1.0數據庫(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；Metascape數據庫(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；STRING數據庫(https：//string-db.org/)；Swiss Target Prediction數據庫(https：//www.sib.swiss/)；the Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數據庫(http：//www.genome.jp/kegg/)；bioinformatics數據庫(http：//www.bioinformatics.com.cn/)；Cytoscape3.8.2軟件；GraphPad Prism 6.0軟件。

1.3 山豆根改善急性咽炎的網絡藥理學研究

1.3.1獲取山豆根有效活性成分和候選作用靶點 利用TCMSP獲取山豆根的活性成分。以“山豆根”為檢索詞，依據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選收集。將所得活性成分在Swiss Target Prediction中篩選得到山豆根相關靶點，利用UniProt數據庫校正靶點基因名，限定物種為“Homosapiens”，獲取山豆根有效活性成分對應的作用靶點。

1.3.2構建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點”網絡 利用Genecards數據庫(相關性評分≥1.0)和OMIM數據庫，以“acute pharyngitis”檢索急性咽炎潛在靶點，合并去除重復后，收集急性咽炎相關靶點。利用韋恩圖獲取山豆根和急性咽炎的共同靶點，并通過Venny軟件繪制韋恩圖顯示。通過Cytoscape軟件構建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點”網絡。

1.3.3構建蛋白相互作網絡 利用String數據庫構建靶標蛋白相互作用(protein-proteininteraction，PPI)。將“1.3.2”獲取的交集靶點導入String數據庫，限定物種“Homosapiens”，并以置信度≥0.9，獲取靶點網絡。將其導入Cytoscape軟件中優化PPI。利用bioinformatics顯示PPI網絡中排名前20的核心蛋白靶點。

1.3.4通路和功能富集的分析 為進一步研究山豆根改善急性咽炎機制，利用Metascape對獲得的靶標進行GO富集分析和KEGG通路分析。然后把山豆根活性成分、靶點以及排名前20的KEGG通路等數據導入Cytoscape軟件中，構建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點-通路”網絡。

1.4 山豆根改善急性咽炎的作用機制

1.4.1建立大鼠急性咽炎模型 60只SPF級SD大鼠，♀♂各半，適應性喂養1周，隨機分為6組，每組10只，空白組(KB，蒸餾水)，模型組(MX)，阿莫西林陽性藥組(YX，0.20 g·kg-1)，山豆根低劑量組(DJ，2.16 g·kg-1)，山豆根中劑量組(ZJ，8.64 g·kg-1)，山豆根高劑量組(GJ，34.65 g·kg-1)。除空白組外，用喉頭噴霧器將10%氨水向各組大鼠咽部噴霧(散布面積150 mm2)，上、下午各1次，每次3下，連續3 d，使咽部黏膜因急性刺激而充血腫脹，形成急性炎癥，建立大鼠急性咽炎模型[10]。造模3 d后，各組灌胃給予相應劑量藥液，每天1次，連續7 d。各組禁食不禁水12 h，處死前記錄體質量，腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，取血清、咽部組織測定各項指標。

1.4.2咽部病理組織學變化及血清指標檢測 咽部組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡觀察咽部組織病理形態變化。腹腔主動脈取血，血液于4 ℃靜置1 h，析出血清，4 ℃，3 500 r·min-1離心15 min，按照試劑盒方法檢測血清中IL-6、IL-10、PEG2的含量。

1.4.3熒光定量PCR法檢測白細胞跨內皮遷移信號通路關鍵基因的表達 提取大鼠咽部組織總RNA，使用cDNA第一鏈合成預混試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測白細胞跨內皮遷移信號通路關鍵基因的表達，以GAPDH作為內參。采用SYBRGreenMaster(Rox)(Roche)在伯樂熒光定量PCR儀器上完成操作，每組實驗生物學重復3次。利用Primer 3在線軟件(https；//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計整合素亞基β1(integrin subunit β1，ITGB1)，蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PRKCα)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基δ(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-Kinase catalytic subunit delta，PIK3CD)，蛋白質酪氨酸激酶2(protein tyrosine Kinase 2，PTK2)，整合素亞基β2(integrin subunit beta 2，ITGB2)，蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PRKCB)，蛋白質酪氨酸磷酸酶非受體11型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11，PTPN11)，整合素亞基α4(integrin subunit α4，ITGA4)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit α，PIK3CA)，GAPDH引物(Tab 1)。熒光定量PCR數據利用公式2-ΔΔCT進行計算。

Tab 1 Primer sequence

2 結果

2.1 獲取山豆根有效活性成分和候選作用靶點在TCMSP數據庫共獲得79個山豆根有效成分。根據OB≥30%和DL≥0.18共篩選21種潛在的有效成分，編號為S1-S21(Tab 2)。在Swiss Target Prediction中篩選后，用UniProt數據庫校正共得到509個作用靶點。

Tab 2 The 21 active ingredients of Sophora tonkinensis Gagnep and number of corresponding targets

2.2 急性咽炎潛在靶點的收集通過GeneCards數據庫(相關性評分≥1.0)和OMIM獲取急性咽炎相關的靶點，合并剔除重復值后共獲得2 167個急性咽炎潛在靶點。

2.3 構建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點”網絡將收集的509個山豆根潛在靶點與急性咽炎的2 167個潛在靶點相匹配，運用韋恩圖得到山豆根急性咽炎共同靶點數目194個，同時利用Venny2.1軟件繪制韋恩圖(Fig 1)。

將共同靶點導入Cytoscape3.8.2軟件，構建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點”網絡(Fig 2)。此網絡有206個節點，包括山豆根(橙色的三角形)、急性咽炎(黃色的圓形)、山豆根21個活性成分(藍色的V形)、194個山豆根和急性咽炎的共同靶點節點(綠色的菱形)和1 071條邊。其中異鼠李素(S2)、醉茄素(S6)、大豆皂苷E(S9)、山奈酚(S20)、槲皮素(S21)是山豆根改善急性咽炎的關鍵活性成分，與100個靶點直接相關(Tab 2)。

Fig 1 Venn diagram of common target of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

2.4 PPI網絡的構建與分析將194個共同靶標導入String數據庫，限定物種“Homosapiens”，并以置信度≥0.9進行過濾。將其導入Cytoscape3.8.2軟件構建優化PPI網絡有145個節點(隱藏離散節點)代表所有預測靶標(Fig 3)，邊線508條，代表靶標之間的相互聯系。其中綜合數值評分>0.95的相互作用蛋白有AKT1-HSP90AA1、AKT1-MTOR、CCNB1-CDK2、CCNB1-CDK1、CCND1-CDK2等280個，這些蛋白間的相互作用在PPI中占有重要地位。對PPI網絡進行分析，根據連接度、介度與緊密度確定網絡中關鍵核心靶點，利用bioinformatics可視化PPI網絡中排名前20的關鍵核心靶點，繪制核心靶點水平條形圖(Fig 4)。

2.5 通路和功能富集的分析為深入研究山豆根改善急性咽炎的作用機制，本研究利用Metascape平臺對山豆根和急性咽炎194個共同靶標進行GO富集和KEGG通路分析。共得到2 394個GO富集條目，包括2 058個生物學過程條目，208個分子功能和128個細胞成分條目。在生物學過程方面，山豆根改善急性咽炎主要涉及cellular response to nitrogen compound信號通路(GO：1901699)、：response to drug(GO：0042493)、positive regulation of protein phosphorylation(GO：0001934)等。在細胞成分中主要涉及postsynapse(GO：0098794)、membraneraft(GO：0045121)等。分子功能富集主要涉及protein kinase activity(GO：0004672)、neurotransmitter receptor activity(GO：0030594)、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity(GO：0004714)等。根據P<0.05，篩選出排名前10個GO富集條目，并利用bioinformatics進行可視化(Fig 5)。

通過KEGG通路分析，共富集到344條信號通路。山豆根改善急性咽炎主要涉及白細胞跨內皮遷移信號通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號通路、癌癥中的轉錄失調等。根據P<0.05，篩選出排名前20的通路，并利用bioinformatics進行可視化(Fig 6)。

2.6 構建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點-通路”網絡最后將山豆根的有效成分、山豆根和急性咽炎的共同靶標和排名前20的KEGG信號通路等數據結果導入Cytoscape 3.8.2軟件，構建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶點-通路”網絡(Fig 7)。該網絡有226個節點，其中包括山豆根(紅色六邊形)，急性咽炎(橙色正方形)，山豆根21個活性成分(紫色V形)，194個山豆根與急性咽炎的共同靶標(綠色菱形)，排名前20信號通路(桃紅色三角形)和1 041條邊。該網絡圖直觀地體現山豆根通過多成分、多靶點和多通路改善急性咽炎的作用機制。

Fig 2 “Sophora tonkinensis Gagnep-acute pharyngitis-effective components-target”network

Fig 3 Sophora tonkinensis Gagnep to improve potential target interaction network of acute pharyngitis

Fig 4 Horizontal bar chart of core targets

Fig 5 The biological process of GO enrichment histogram in top 10 intersecting targets of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

Fig 6 Analysis of top 20 KEGG pathways in intersection target of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

2.7 白細胞跨內皮遷移信號通路信號通路基因篩選在篩選的排名前20的通路進行篩選與急性咽炎相關的通路，主要有IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、NF-kappa B 信號通路(NF-kappa B signaling pathway)和白細胞跨內皮遷移信號通路(leukocyte transendothelial migration)等。山豆根中主要活性成分異鼠李素、醉茄素、大豆皂苷E、山奈酚、槲皮素等作用于白細胞跨內皮遷移信號通路11個靶點ITGB1，PRKCA，PIK3CD，PTK2，ITGB2，PRKCB，PTPN11，ITGA4，PIK3CA等。

2.8 山豆根對急性咽炎大鼠體質量及血清IL-6、IL-10、PEG2水平的影響向大鼠咽部噴霧10%的氨水造模觀察，模型組大鼠相較空白組活動量減低，毛色無光、行動低迷、精神不振、飲食量減少，說明造模成功；各給藥組大鼠的癥狀均輕于模型組大鼠。與空白組相比，造模后，模型組大鼠體質量明顯降低(P<0.01)，血清 IL-6、PEG2水平明顯升高(P<0.01)，IL-10水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，山豆根低劑量組大鼠體質量明顯升高(P<0.05)，山豆根高、中、低劑量組大鼠血清 IL-6水平均明顯降低(P<0.01)，山豆根低、中、高劑量組大鼠血清IL-10含量均明顯升高(P<0.01)，山豆根低、高劑量組大鼠血清PEG2含量均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，相較模型組，山豆根低劑量組大鼠血清IL-6、PEG2含量最低，IL-10含量最高(Tab 3)，效果最優。

2.9 大鼠咽部組織病理組織學觀察與空白組相比，模型組固有層和黏膜層病理變化明顯，炎性細胞浸潤明顯，固有層有明顯的水腫現象，陽性藥組固有層和黏膜層無明顯病理變化，山豆根低劑量組固有層和黏膜層病理有輕微變化，炎性細胞浸潤較輕，固有層水腫現象較輕，山豆根中高劑量組相較模型組固有層和黏膜層病理變化較輕，但相較于山豆根低劑量組病理變化較為嚴重，山豆根低劑量組咽部組織細胞著色較為均勻，細胞形態基本正常，炎性細胞浸潤情況明顯減輕(Fig 8)。

Fig 7 “Sophora tonkinensis Gagnep-acute pharyngitis-effective components-target-pathway”network

Tab 3 Comparison of levels of IL-6,IL-10,PEG2 in pharyngeal tissues of

Fig 8 Pathological morphology of pharyngeal tissues of rats(HE staining,×200)KB:blank group；MX:model group；YX:positive drug group；DJ:Sophora tonkinensis Gagnep low-dose group；ZJ:Sophora tonkinensis Gagnep middle-dose group；GJ:Sophora tonkinensis Gagnep high-dose group.

2.10 咽部組織ITGA4、ITGB1、ITGB2、PIK3CA、PIK3CD、PRKCA、PRKCB、PTK2、PTPN11 mRNA的表達水平與模型組相比，山豆根低劑量組可明顯下調ITGB1、ITGB2、PIK3CA、PIK3CD、PRKCA、PRKCB、PTPN11 mRNA 的表達量(P<0.05或P<0.01)，山豆根低劑量組對ITGA4、PTK2 mRNA的表達無明顯影響，與模型組相比，山豆根空白組對ITGB1、PRKCA、PRKCB mRNA 的表達無明顯影響(Fig 9)。綜上，山豆根可能通過下調ITGB2、PIK3CA、PIK3CD和PTPN11基因表達，從而減輕急性咽炎大鼠的咽部組織的炎癥反應。

Fig 9 Expression of leukocyte transendothelial migration genes in pharyngeal 1:blank group；2:model group；3:Sophora tonkinensis Gagnep low-dose group.*P<0.05，**P<0.01 vs blank group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group

3 討論

本研究通過氨水誘導的大鼠急性咽炎模型評價山豆根對咽炎的影響，實驗數據顯示，山豆根低中高劑量組都可以緩解急性咽炎相關癥狀，其中山豆根低劑量組效果最佳，模型組癥狀如減少飲食，減少活動量，口腔抓撓，咳嗽，唾液分泌，咽部腫脹[11]，山豆根低劑量組則癥狀較輕，還可以減輕黏膜增生，細胞浸潤和血管擴張等(Fig 8-DJ)。提示山豆根能有效改善氨水導致的急性咽炎大鼠模型。減少腺體肥大和粘膜增厚的發生，減輕氨性咽部相關癥狀。

本實驗數據顯示，氨水噴灑可逆轉組織損傷所誘導的促炎細胞因子IL-6的上調。山豆根降低COX-2和5-LOX的表達，進一步減少炎性細胞因子PGE2的產生。作為促炎和炎癥細胞因子(白細胞介素-6)產生的主要調節因子，白細胞跨內皮遷移信號通路的激活是宿主細胞對氨誘導的組織損傷反應的標志。目前研究表明，山豆根可通過激活白細胞跨內皮遷移信號通路，減輕組織損傷所致的咽炎大鼠炎癥反應[11]。

炎癥是身體組織對有害刺激(如病原體)的復雜生物反應的一部分。它是一種保護性反應，涉及白細胞、血管和分子介質，目的是消除細胞損傷的最初原因，并啟動組織修復。炎癥受到身體的嚴格調控，與白細胞短暫穿過血管壁有關，這一過程被稱為跨內皮細胞遷移(TEM)。白細胞的外滲是(病理)生理過程所必需的，包括T淋巴細胞的遷移以進行免疫監視，急、慢性炎癥反應中活化的淋巴細胞和粒細胞的募集，以及造血祖細胞的歸巢和動員[12]。

編碼β-2整合素家族的ITGB2基因介導白細胞與內皮細胞的黏附和向炎癥部位的遷移，此外，它還參與了中性粒細胞的細菌識別和由外向內的信號傳遞[13]，受影響患者的突出臨床特征是反復的細菌感染，主要局限于皮膚和黏膜表面，就好像急性咽炎中咽部的紅腫熱痛等。細胞的增殖、存活、分化、遷移和凋亡等過程都受酪氨酸磷酸化的調控，酪氨酸磷酸化又受蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)的調控，調節著多種細胞過程。PTKs的表達改變和突變與多種形式的癌癥和炎癥有關[14]。從以往來看，PTP被視為負面調節因子，因為它們有能力逆轉PTK的影響，PTK通常啟動信號級聯反應。炎癥是蛋氨酸的表型特征之一，幾個基因變異在表型上表現出多效性的遺傳關聯，而其中PTPN11是幾個變異基因中的一個。PI3K是一類脂質激酶，在控制細胞增殖、細胞死亡、運動和細胞入侵等信號通路中起重要作用。PIK3CA或PIK3CD的基因擴增可誘導白細胞跨內皮遷移信號通路的下游激活。活躍的白細胞跨內皮遷移信號通路的作用被認為與炎性微環境有關[15]。白細胞跨內皮遷移信號激活與微環境中炎癥細胞(如CD8中T淋巴細胞)的聚集有關，而環氧合酶2(通常也存在于該途徑的激活)可以調節PEG2的合成，導致某些T細胞通過其PEG2受體聚集[16]。山豆根明顯降低ITGB2、PIK3CA、PIK3CD和PTPN11基因的表達水平，涉及白細胞跨內皮遷移等途徑的關鍵基因，抑制炎癥的發生,對氨性急性咽炎起到保護的作用。

山豆根還可能通過與靶點結合抑制人白細胞分化抗原的表達，抑制Toll樣受體4信號通路、NF-kappa B信號通路和有絲分裂素激活蛋白激酶信號通路，抑制促炎介質的產生，白細胞跨內皮遷移通路介導了NF-kappa B通路的激活[17]，NF-kappa B信號通路是細胞中重要的轉錄調節通路，作為炎癥發生的一條重要途徑，是炎癥和抗炎的核心，是參與機體炎癥反應的主要通路之一[18]。山豆根中ATF3不僅阻止NF-kappa B與促炎癥細胞因子的基因啟動子的結合，而且還可以通過與NF-kappa B的p65亞單位的直接物理結合來阻止NF-kappa B的轉位進入細胞核。因此，山豆根可能調控NF-kappa B信號通路從而產生抗急性炎作用，包括在氨性刺激后觀察到的抗急性咽炎作用。因此，山豆根可能抑制了NF-kappa B的轉位，并在轉錄水平上抑制了致炎細胞因子的表達[4]。

綜上所述，山豆根低劑量組具有明顯的抗炎作用，保護黏膜組織完整性，改善咽炎癥狀。山豆根能夠降低炎癥因子的含量，減少氨性損傷大鼠的促炎細胞因子和炎性介質的表達有關。山豆根可抑制白細胞跨內皮遷移通路關鍵基因表達，減輕急性咽炎造成的炎細胞浸潤。山豆根作為一種治療咽炎等上呼吸道炎癥的藥物可能具有很大的臨床潛力。