基于FKN/CX3CR1信號通路的壯骨止痛解郁方抗類風濕關節炎伴抑郁癥作用機制研究

劉檢，藺曉源，趙洪慶，楊蕙，周梓洋，劉平安，3，王宇紅，4

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學科技創新中心，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中醫學國內一流建設學科，湖南 長沙 410208；4.抑郁類疾病中醫藥防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙410208

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性自身免疫性疾病，臨床主要表現為晨僵、滑膜炎、對稱性關節腫痛[1]。RA所致軀體損傷、生理功能受限等反應會導致患者產生精神癥狀，其中以抑郁最為常見。中國大陸RA發病率為0.42%，患者人數約500 萬[2]，其中40%～60%伴有不同程度的抑郁癥狀[3-4]。RA 伴抑郁癥（rheumatoid arthritis accompanied by depression，RAD）發病隱匿，病情反復，嚴重影響患者生活質量和身心健康，故研究RAD的發病機制及防治藥物具有重要意義。

目前RAD發病機制尚未明確。研究顯示，RA狀態下，外周炎性因子水平升高，血腦屏障被破壞，炎性因子進入中樞后，通過FKN/CX3CR1信號通路導致小膠質細胞異常活化，損傷海馬神經元，進而誘發抑郁[5-7]。RAD屬中醫學“痹證”“郁證”范疇，為虛實夾雜之證，具有“虛、瘀、郁”的病機特點。課題組立補腎祛寒、活血通絡、疏肝解郁治法，擬壯骨止痛解郁方。前期研究發現，壯骨止痛解郁方能明顯改善RAD 模型大鼠抑郁癥狀，其機制可能與調節FKN/CX3CR1信號通路有關[8]，但具體機制仍有待闡明。因此，本研究建立細胞共培養體系并模擬RAD環境的體外細胞模型，基于FKN/CX3CR1信號通路進一步探討壯骨止痛解郁方防治RAD的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠3只，受孕16～18 d；SPF級SD大鼠4只，雌雄各半，新生3～4 d；SD大鼠8只，雌雄各半，體質量180～220 g，均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。本實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審批（HN-ZYFY-2021-12-10）。

1.2 細胞

大鼠滑膜細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CP-R083。大鼠腦微血管內皮細胞，武漢原生原代生物醫藥科技有限公司，貨號RAT-CELL-0039。

1.3 藥物

壯骨止痛解郁方（補骨脂15 g，淫羊藿10 g，枸杞子15 g，女貞子15 g，狗脊10 g，骨碎補10 g，姜黃10 g，川牛膝10 g，貫葉連翹15 g，人參10 g、柴胡10 g），飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。按前期方法[9-10]制備壯骨止痛解郁方含藥血清，分裝，-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、神經基礎培養基、B27、GlutaMAX，美國Gibco 公司，批號分別為2176377、2186948、2283823、3 140584；趨化因子C-X3-C-基元受體1（CX3CR1）阻斷劑AZD8797，美國MCE公司，貨號HY-13848；閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）、腺苷A2A受體（A2AR）、CX3CR1抗體，美國Affinity 公司，貨號分別為AF5145、DF7504、DF6482、DF2325；谷氨酸受體2A（NR2A）、谷氨酸受體2B（NR2B）抗體，美國Proteintech公司，貨號分別為28525-1-AP、21920-1-AP；腫瘤壞死因子（TNF）-α、類風濕因子（RF）、趨化因子Fractalkine（FKN）ELISA 試劑盒，江蘇菲亞公司，貨號分別為FY3056-A、FY3768-A、FY10176-A。二氧化碳細胞培養箱（美國Thermo 公司，型號HERAce112401），細胞成像分析系統（廣州明美科技有限公司，型號MSX），細胞電阻儀（美國Millipore公司，型號ERS-2），超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司，型號LSM800）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

取受孕16～18 d的SD大鼠，戊巴比妥鈉麻醉，取胎鼠，參照文獻[11]方法分離胎鼠海馬組織，經消化、離心后，用無血清培養基（含96%神經基礎培養基、2%B27、1%GlutaMAX和1%雙抗）重懸，將細胞接種至24孔培養板中，每隔3 d半量換液，備用。同時參照課題組前期方法[12]培養原代小膠質細胞，備用。

2.2 造模、分組及給藥

大鼠滑膜細胞用含10%FBS、1%雙抗的滑膜細胞培養基置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞，按1×105個/mL接種至6孔板，每孔1.5 mL，繼續培養24 h。將細胞分為正常組、模型組、CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組。除正常組外，其余3組予1 μg/mL脂多糖（LPS）誘導炎癥模型，CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組造模同時分別加入1 μmol/L AZD8797和10%壯骨止痛解郁方含藥血清，置于培養箱繼續培養24 h。收集模型組細胞培養液，1 500 r/min離心10 min，上清液置于-20 ℃冰箱保存備用。

為探索RAD環境對小膠質細胞和海馬神經元的影響，參照文獻[13]，采用Transwell共培養法，將腦微血管內皮細胞接種至小室內側，原代小膠質細胞接種至小室外側，海馬神經元接種至6孔板底部，將小室置于接種神經元的6孔板中構建共培養體系（見圖1），設正常組、模型組、CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組，除正常組外，其余3組采用模型組滑膜細胞上清液聯合100 μmol/L 皮質酮加入小室內側干預24 h，CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組造模同時分別加入1 μmol/LAZD8797和10%壯骨止痛解郁方含藥血清，置于培養箱繼續培養24 h。

圖1 RAD環境下體外共培養體系模擬

2.3 檢測指標

2.3.1 細胞形態學觀察

各組細胞經造模及藥物處理后，采用細胞成像分析系統分別觀察滑膜細胞、腦微血管內皮細胞、小膠質細胞及海馬神經元形態變化。

2.3.2 細胞因子檢測

收集各組滑膜細胞培養液，3 000 r/min離心5 min，取上清液，參照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、RF和FKN含量。

2.3.3 跨內皮細胞電阻檢測

共培養體系經造模及藥物處理24 h后，采用電阻儀測量電阻，計算跨內皮細胞電阻（TEER）。嚴格按儀器說明書操作，每個小室測量3次，并計算平均值。TEER=（測量電阻值-空白電阻值）÷有效膜面積。

2.3.4 免疫熒光染色

共培養體系經造模及藥物處理24 h后，采用4%細胞固定液固定30 min，0.25%TritonX-100通透15 min，5%BSA封閉30 min，腦微血管內皮細胞加入兔抗大鼠Occludin、ZO-1一抗（均為1∶100），小膠質細胞加入兔抗大鼠CX3CR1、A2AR一抗（均為1∶100），海馬神經元加入兔抗大鼠NR2A、NR2B一抗（均為1∶100），4 ℃避光孵育過夜，預冷PBS洗滌5次，加入FITC標記山羊抗兔二抗（1∶200），37 ℃避光孵育30 min，預冷PBS洗滌4次，加入DAPI工作液，室溫避光孵育20 min，預冷PBS洗滌3次，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，計算熒光強度。

2.3.5 尼氏染色

共培養體系經造模及藥物處理24 h后，棄去孔內液體，預冷PBS潤洗2次，海馬神經元用4%細胞固定液固定30 min，0.25%TritonX-100 通透15 min，加入FITC-FJB 工作液100 μL，4 ℃避光孵育1 h，棄去液體，預冷PBS潤洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察突觸可塑性變化。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 壯骨止痛解郁方對滑膜細胞、腦微血管內皮細胞、小膠質細胞及海馬神經元形態的影響

模型組滑膜細胞明顯受損，細胞折光率降低，胞體裂解；壯骨止痛解郁方組滑膜細胞損傷減輕，細胞形態正常。模型組腦微血管內皮細胞邊界模糊，典型“鋪路石樣”特征消失；壯骨止痛解郁方組腦微血管內皮細胞形態有所恢復，細胞結構完整。模型組小膠質細胞明顯激活，胞體增大，突起變短，細胞分支減少，呈阿米巴樣；壯骨止痛解郁方組小膠質細胞激活減少，細胞分支明顯增多。模型組海馬神經元樹突及樹突棘數量減少，突觸可塑性明顯損傷；壯骨止痛解郁方組海馬神經元形態及突觸可塑性損傷均有不同程度減輕。見圖2～圖5。

圖2 各組滑膜細胞形態（×100）

圖3 各組腦微血管內皮細胞形態（×100）

圖4 各組小膠質細胞形態（×100）

圖5 各組海馬神經元形態（×100）

3.2 壯骨止痛解郁方對滑膜細胞上清液腫瘤壞死因子α、類風濕因子、趨化因子Fractalkine含量的影響

與正常組比較，模型組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN含量明顯增加（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN 含量明顯減少（P<0.01，P<0.05）。見表1。

表1 各組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN含量比較（）

表1 各組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN含量比較（）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3 壯骨止痛解郁方對腦微血管內皮細胞跨內皮細胞電阻的影響

與正常組比較，模型組腦微血管內皮細胞TEER明顯減小（P<0.01）；與模型組比較，壯骨止痛解郁方組腦微血管內皮細胞TEER 明顯增大（P<0.01）。見表2。

表2 各組腦微血管內皮細胞TEER比較（，Ω/cm2）

表2 各組腦微血管內皮細胞TEER比較（，Ω/cm2）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

3.4 壯骨止痛解郁方對腦微血管內皮細胞、小膠質細胞及海馬神經元蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組腦微血管內皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，壯骨止痛解郁方組腦微血管內皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達明顯升高（P<0.01）。結果見圖6、表3。

圖6 各組腦微血管內皮細胞Occludin、ZO-1蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

表3 各組腦微血管內皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達比較（，熒光強度）

表3 各組腦微血管內皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達比較（，熒光強度）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

與正常組比較，模型組小膠質細胞CX3CR1、A2AR 蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，CX3CR1 阻斷劑和壯骨止痛解郁方組小膠質細胞CX3CR1、A2AR 蛋白表達明顯降低（P<0.01，P<0.05）。見圖7、表4。

圖7 各組小膠質細胞CX3CR1、A2AR蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

表4 各組小膠質細胞CX3CR1、A2AR蛋白表達比較（，熒光強度）

表4 各組小膠質細胞CX3CR1、A2AR蛋白表達比較（，熒光強度）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

與正常組比較，模型組海馬神經元NR2A、NR2B蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，CX3CR1阻斷劑和壯骨止痛解郁方組海馬神經元NR2A、NR2B 表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見圖8、表5。

表5 各組海馬神經元細胞NR2A、NR2B蛋白表達比較（，熒光強度）

表5 各組海馬神經元細胞NR2A、NR2B蛋白表達比較（，熒光強度）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖8 各組海馬神經元NR2A、NR2B蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

3.5 壯骨止痛解郁方對海馬神經元突觸可塑性的影響

與正常組比較，模型組海馬神經元尼氏小體數量明顯減少，樹突和樹突棘分支斷裂，神經網絡完整性降低；與模型組比較，CX3CR1阻斷劑和壯骨止痛解郁方組海馬神經元尼氏小體數量明顯增多，神經網絡豐富度提高，同時樹突和樹突棘分支斷裂情況明顯改善。見圖9。

圖9 各組海馬神經元突觸可塑性比較（尼氏染色，×100）

4 討論

痹證有行痹、痛痹、著痹等分型，其關節腫大、僵硬、變形等癥狀與中醫學“尪痹”相符，為虛實夾雜之證。《證治準繩》有“痹病有風、有濕、有寒、有熱……皆標也；腎虛，其本也”。在腎虛基礎上，氣血不運、瘀血留滯為痹證的病理關鍵[14]。RA病機可用“虛、瘀”概括，多為腎虛血瘀。郁證病始在肝，與腦相關，若情志不遂，肝郁失疏，氣血運行不暢，則瘀結于內，不得宣泄，上犯清竅，神明失用，發為抑郁，故郁證病機可用“瘀、郁”概括[15]。又肝腎同源，腎通于腦，尪痹之腎虛血瘀可致元神失養，產生郁證；郁證之肝郁氣滯又可加重尪痹之腎虛血瘀。故尪痹與郁證互為因果，相兼為病。本課題組基于RAD病機特點，立補腎祛寒、活血通絡、疏肝解郁治法，創壯骨止痛解郁方，該方以壯骨止痛方合百事樂方化裁而成[16-17]。方中補骨脂溫腎助陽為君；臣以淫羊藿助君藥溫補腎陽，又有強筋健骨之功，柴胡疏肝理氣，姜黃活血行氣，主治血瘀氣滯諸癥，狗脊補肝腎、強腰膝；佐以枸杞子、女貞子滋補肝腎陰精，助肝腎之陽化生，貫葉連翹活血解郁，骨碎補續傷止痛、通經活絡，補中寓通，補而不滯；人參功善補氣、安神，用為佐藥；伍以川牛膝逐瘀通經，且引藥下行增強藥效，為使藥。全方共奏補腎祛寒、活血通絡、疏肝解郁之效。

抑郁癥與免疫系統疾病關系密切，抑郁癥能激活炎癥因子，加重RA患者疼痛，并進一步加重抑郁癥狀，形成惡性循環，從而影響疾病預后。在RA過程中，激活的T細胞可刺激巨噬細胞產生大量TNF-α等致炎因子，促使滑膜細胞過度增殖，進而損傷骨關節，還可促進RF、FKN產生[18]。臨床研究顯示，RA患者外周血和滑膜組織TNF-α、FKN含量明顯增加，腦微血管內皮細胞RhoA表達上調，Claudin-5和Occludin表達下調，血腦屏障結構受損、通透性增加，提示RA誘發的全身性慢性炎癥可破壞血腦屏障完整性，致使外周炎癥因子進入腦內并對大腦進行免疫刺激，誘發中樞神經炎癥[19]。FKN是一種趨化因子，其唯一受體CX3CR1是一種跨膜高親和力受體，可介導FKN黏附和遷移，主要位于單核巨噬細胞和小膠質細胞膜上。RA狀態下，高水平TNF-α破壞腦微血管內皮細胞完整性，使血腦屏障通透性增加，同時外周FKN表達和釋放增加，大量外源性FKN進入腦內。一方面，與小膠質細胞膜上的CX3CR1結合后分泌腺苷，再與其受體A2AR結合，促進D-絲氨酸釋放，激活N-甲基-D-天冬氨酸并促進Ca2+流入神經元細胞內，抑制長時程增強，影響突觸可塑性[20-21]；另一方面，FKN可直接促進小膠質細胞活化，放大炎癥反應，造成海馬神經元結構、功能及突觸可塑性損傷，最終引發抑郁癥[22]。因此我們推測，FKN/CX3CR1信號通路在RAD過程中起“橋接”作用，通過外周和中樞免疫透過血腦屏障，將RAD疾病進展相關的滑膜細胞-腦微血管內皮細胞-小膠質細胞-海馬神經元4種細胞串聯起來。

本研究結果顯示，壯骨止痛解郁方能有效改善大鼠滑膜細胞形態損傷，抑制細胞因子TNF-α、RF、FKN釋放，保護腦微血管內皮細胞形態，增加TEER，并上調腦微血管內皮細胞結構蛋白Occludin、ZO-1表達，提示壯骨止痛解郁方可能通過調節滑膜細胞FKN釋放，進而改善腦微血管內皮細胞形態、結構和屏障功能損傷。進一步研究發現，壯骨止痛解郁方和CX3CR1阻斷劑AZD8797均能顯著抑制小膠質細胞過度激活，下調CX3CR1和A2AR蛋白表達，說明壯骨止痛解郁方可能通過調控CX3CR1這一關鍵靶點，進而抑制FKN 介導的小膠質細胞異常活化。通過檢測CX3CR1下游信號發現，壯骨止痛解郁方和CX3CR1阻斷劑AZD8797均能有效緩解海馬神經元形態及突觸可塑性損傷，同時顯著下調突觸可塑性相關蛋白NR2A、NR2B表達，提示壯骨止痛解郁方可能通過調控FKN/CX3CR1信號通路改善海馬突觸可塑性損傷，進而發揮抗RAD作用。本實驗結果與前期動物實驗結果[8]一致，亦再次佐證壯骨止痛解郁方抗RAD作用可能與調節FKN/CX3CR1信號通路有關。

綜上所述，壯骨止痛解郁方能減少RA狀態下的滑膜細胞TNF-α、RF、FKN釋放，保護腦微血管屏障，抑制小膠質細胞激活，通過抑制FKN/CX3CR1信號通路發揮對突觸可塑性損傷的保護作用，從而防治RAD。