腹部推拿對潰瘍性結腸炎大鼠腸道炎癥及脊髓背角AKT蛋白表達的影響

方佳鈺，黃紅葉，王曉華，陳水金，江煜，陳樂春，張幻真，陳進城，林志剛

1.福建中醫藥大學，福建 福州 350100；2.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003；3.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州350003

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，是引起腹痛、腹瀉的臨床常見病之一，屬現代難治性疾病[1-2]。腹部推拿治療UC效果顯著，能改善腹瀉、便血、腹痛等癥狀，具有安全、無不良反應等優勢[3-5]，但其作用機制尚不明確。研究表明，脊髓背角蛋白激酶B（AKT）能通過磷酸化調控UC發生發展[6]。本實驗通過觀察腹部推拿對UC 模型大鼠腸道炎癥及脊髓背角AKT、p-AKT表達的影響，探討腹部推拿治療UC的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠50只，體質量150～160 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心，溫度20～26 ℃，相對濕度45%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。實驗過程嚴格遵守動物倫理原則，并經福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（FJTCM IACUC 2021046）。

1.2 主要試劑與儀器

AKT抗體、p-AKT抗體、HRP標記山羊抗兔IgG（南京Bioworld公司，貨號分別為BS1810、BS4007、BS13278），美沙拉嗪片（佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號210907），HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號G1120）。自制大鼠腹部推拿固定器（專利號ZL201821139321.X），AVANTI J-15R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司），Tetra型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），Gene Pulser Xcell型電轉儀（美國Bio-Rad公司），Gel Doc XR+型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），Gel Doc EZ型成像及分析軟件（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組及造模

大鼠單籠適應性飼養7 d，按隨機數字表法分為正常組、模型組、推拿組和美沙拉嗪組，正常組11只，其余每組13只。參照Poulsen[7]方法，采用5%葡聚糖硫酸鈉溶液（避光配制）自由飲用7 d誘導UC大鼠模型，正常組飲用蒸餾水。

1.4 干預

推拿組造模第2日開始進行腹部推拿干預，干預前將大鼠置于自制腹部推拿固定器10 min適應環境。操作者左手置于腹部推拿固定器尾端，防止大鼠向后退離，右手食指進行摩腹手法操作（見圖1），將食指指腹置于“關元”，按“關元-帶脈（右）-鳩尾-帶脈（左）”順序[8-9]做逆時針節律性推拿，頻率120次/min，每次10 min，每日1次，共15次。推拿結束后大鼠單獨靜置1 min。美沙拉嗪組造模第2日起予0.035 g/mL美沙拉嗪藥液灌胃，給藥體積2 mL/100 g，連續15 d。正常組和模型組大鼠俯臥位束縛于固定器中10 min，不予腹部推拿治療。

圖1 大鼠腹部推拿演示

1.5 一般狀況觀察

每日觀察大鼠精神狀態、毛發色澤、糞便改變情況等。

1.6 疾病活動指數評分

第1、3、6、9、11、14、16日，參照文獻[10]進行疾病活動指數（DAI）評分，包括體質量減輕程度、糞便性狀、糞便隱血情況。DAI評分=（體質量下降評分+糞便性狀評分+糞便隱血評分）÷3。評分標準見表1。

表1 DAI評分標準

1.7 HE染色

實驗結束后，大鼠腹腔注射1.25 g/kg烏拉坦麻醉后，頸椎脫臼處死，取距肛門5～8 cm處結腸組織，生理鹽水沖洗，置于10%中性福爾馬林溶液中固定，經脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）后，常規HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結腸組織病理變化。

1.8 Western blot檢測

取脊髓背角，加入裂解液（組織∶裂解液=1∶12.5），冰上裂解30 min，超聲勻漿，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。經10%SDS-PAGE后，將蛋白轉至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，分別加入AKT一抗（1∶500）、p-AKT 一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜，加入HRP標記二抗，常溫孵育1 h，采用ECL發光試劑顯影，凝膠成像系統成像，用Image Lab軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 腹部推拿對模型大鼠一般情況的影響

實驗過程中，模型組大鼠因服用葡聚糖硫酸鈉溶液造模致長期嚴重腹瀉死亡2只，美沙拉嗪組大鼠死亡2只，可能是美沙拉嗪的不良反應導致，空白組和推拿組均無死亡。

正常組大鼠活潑喜動，皮毛順滑光亮，形體勻稱豐盈，大便為深褐色顆粒狀，無便隱血，肛周清潔，體質量穩步增加，狀態良好；模型組大鼠倦怠少動，皮毛黯淡干枯，形體瘦削，縮背扎堆，糞便稀溏，可見膿血，肛周污穢黏膩，體質量緩慢增長甚至下降，狀態萎靡；推拿組大鼠整體狀態逐漸向好，皮毛光澤恢復，無膿血便，肛周較清潔，活躍多動；美沙拉嗪組大鼠狀態逐漸恢復，皮毛光澤度有所改善，但毛發顏色整體發黃。見圖2。

圖2 各組大鼠一般情況示例

2.2 腹部推拿對模型大鼠疾病活動指數評分的影響

與正常組比較，模型組大鼠第3日起DAI評分明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，推拿組和美沙拉嗪組大鼠第9日起DAI評分明顯降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠DAI評分比較（，分）

表2 各組大鼠DAI評分比較（，分）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.3 腹部推拿對模型大鼠結腸組織病理形態的影響

正常組大鼠結腸黏膜上皮細胞完整、排列整齊，杯狀細胞豐富，無充血、水腫，腺體結構完整，無潰瘍形成，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠結腸上皮細胞破損、排列紊亂，黏膜充血、水腫，腺體破壞，杯狀細胞明顯減少，伴大量炎性細胞浸潤，部分區域有潰瘍形成，部分出現增厚黏連，腸管變形；推拿組和美沙拉嗪組大鼠結腸組織病變有不同程度改善，黏膜上皮損傷有所修復，充血、水腫明顯減輕，腺體、杯狀細胞增多，排列較整齊，炎性細胞浸潤明顯減少。見圖3。

圖3 各組大鼠結腸組織形態（HE染色，×100）

2.4 腹部推拿對模型大鼠脊髓背角蛋白激酶B 表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，推拿組和美沙拉嗪組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達明顯降低（P<0.05）。各組大鼠AKT蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白免疫印跡

圖5 各組大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白表達比較（，每組6只）

3 討論

UC 屬中醫學“腸澼”“泄瀉”“痢疾”等范疇。《素問·太陰陽明論篇》有“食飲不節，起居不時者，陰受之……陰受之則入五藏……入五藏則?滿閉塞，下為飧泄，久為腸澼”，指出UC的主要病因是飲食沒有節制，作息不規律。中醫認為，中焦為人體氣機樞紐，是后天之本。中焦氣機通暢，升清降濁，則上下臟腑得以溝通，人體得以康健，正氣存內，邪不可干[11]。本實驗采用腹部推拿手法主要為水平方向的腹部摩法，《摩腹運氣圖考》記載：“摩腹之法，能通和上下，分理陰陽，去舊生新，補不足，瀉有余。”可見摩腹具有清腸溫中補虛的作用，通過該手法的調理，能達到通腑瀉濁的目的。目前，推拿已應用于UC的治療，能有效改善患者腹瀉、腹痛癥狀[3]。

本實驗以大鼠為研究對象，以腹部推拿為干預手法。臨床腹部推拿多以掌面為干預接觸面，但因大鼠身體和肢爪較小，故本實驗在干預時以食指指腹模擬臨床，便于進行推拿手法的操作。

DAI評分結果顯示，腹部推拿能有效改善UC模型大鼠腹瀉、便血等癥狀，表明腹部推拿手法對模型大鼠已受損的腸道功能有一定恢復作用。且推拿組DAI評分與美沙拉嗪組無顯著差異。在大鼠飼養和糞便采集過程中發現，美沙拉嗪組大鼠毛發發黃，進行便隱血試紙檢測時試紙出現棕褐色黃染情況，可能是美沙拉嗪藥物的不良反應所致。且在實驗過程中推拿組大鼠無死亡情況，美沙拉嗪組大鼠有2只死亡，可見腹部推拿具有安全、無不良反應的優勢。HE染色結果也顯示，模型大鼠結腸上皮細胞破損，黏膜充血、水腫，有大量炎癥細胞浸潤及潰瘍形成。推拿組大鼠結腸黏膜損傷明顯減輕，炎性細胞浸潤有所減少，說明腹部推拿治療能改善大鼠結腸組織病理損傷。

當結腸受到炎癥刺激時，脊髓內的興奮性神經遞質如腦源性神經營養因子、P物質等從初級傳入神經元集中釋放到脊髓背角，并與各自受體結合，促進信號轉導，最終導致內臟高敏感[12]。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，可通過催化自身絲氨酸473（Ser473）和蘇氨酸（Thr308）位點的磷酸化而被激活，只有在這2個位點磷酸化后，AKT才能被充分激活[13]。研究發現，AKT活化與UC發生發展密切相關，電針能通過抑制AKT磷酸化緩解UC大鼠腸道癥狀[14]。進一步研究發現，結腸炎癥發生后，脊髓背角AKT被激活，從而介導后續一系列級聯反應，調控結腸炎的發生發展[6]。本研究結果顯示，模型組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達明顯升高，與上述研究結果[6]一致。經腹部推拿干預后，脊髓背角p-AKT蛋白表達明顯降低，表明腹部推拿能抑制模型大鼠脊髓背角AKT磷酸化，從而減輕炎癥級聯反應。

綜上，腹部推拿能改善UC模型大鼠腹瀉、便血等腸道炎癥癥狀，并可能通過抑制脊髓背角AKT磷酸化發揮抑制腸道炎癥作用，其通過哪些途徑調控AKT及具體作用靶點有待后續進一步研究。