基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討肝積方治療肝細胞癌作用機制

王玨，張春蕾，楊銘，楊悅，鄭培永，宋海燕

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構(gòu)辦公室，上海200032

原發(fā)性肝癌最常見的類型為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），約占75%～85%[1]。2018年全球新發(fā)肝癌病例中，約46.7%在我國[2]。雖然近年來關(guān)于HCC的診斷和治療有顯著進步，但尚未達到控制該病的目的。在我國，中醫(yī)藥在肝癌治療中發(fā)揮了重要作用，尤其是大量晚期肝癌患者。

肝積方以名老中醫(yī)邱佳信為首的上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科組方，臨床治療肝癌效果良好，可單獨或聯(lián)合靶向藥抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移、改善患者癥狀和生存質(zhì)量。臨床試驗顯示，肝積方單獨用于治療晚期原發(fā)性肝癌的患者1年生存率為31%（18/58），而對照組為4.5%（1/22）[3]。動物實驗研究顯示，肝積方可預(yù)防二乙基亞硝胺（DEN）誘發(fā)大鼠肝癌的發(fā)生[4]，可抑制HCC細胞增殖和皮下瘤的生長[5]。然而，肝積方抑制HCC的作用機制尚不明確。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過篩選肝積方有效成分，根據(jù)生物基因組、蛋白質(zhì)相互作用、疾病和藥物靶點等信息，綜合評價該復(fù)方對HCC的效應(yīng)，并分析其潛在作用靶點和相關(guān)調(diào)控機制。進一步通過藥物對HCC動物模型的干預(yù)實驗，探討肝積方治療HCC的藥效及部分機制。

1 材料與方法

1.1 肝積方主要化學(xué)成分收集和篩選

利用TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[6]、HIT（http://hcls.hit.edu.cn/hclsen/main.htm）[7]、TCMID（http://bidd.group/TCMID/）及STITCH（http://stitch.embl.de/）[8]數(shù)據(jù)庫檢索太子參、白術(shù)、茯苓、巖柏、馬蘭根、夏枯草、鱉甲、天南星、牡蠣、丹參、八月札，獲取相應(yīng)化學(xué)成分，將收集到的化學(xué)成分理化特征與已知藥物的相同特征按照類藥性評估指標（quantitative estimate of druglikeness，QED）[9]評估化合物ADME（吸收、分布、代謝、排泄）性質(zhì)。QED=，式中di為整合8種主要分子描述符的渴求函數(shù)，分別為化合物相對分子質(zhì)量、油水分配系數(shù)、氫鍵受體數(shù)、氫鍵供體數(shù)、分子極性表面積、化合物中可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)、化合物中芳香環(huán)數(shù)及非藥子結(jié)構(gòu)數(shù)[10]。通過計算DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）[11]中美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市的1 805種藥物的QED值，按QED閾值≥0.2對化學(xué)成分進行初步篩選。

1.2 主要作用靶點收集和篩選

應(yīng)用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫的基因搜索功能對化學(xué)成分作用靶點名稱進行標準化處理。對搜索結(jié)果按下式采用基于二項分布P(X≥k)的富集評分算法篩選作用靶點，計算靶點分值（gene score，GS）。

式中，k為對所研究靶點起作用的化合物數(shù)量，n為化合物總數(shù)，g表示平均作用于每個靶點的化合物數(shù)量。P(X≥k)指經(jīng)過錯誤發(fā)現(xiàn)率方法調(diào)整后，以隨機機會衡量目標物與n個化合物中的k個以上化合物發(fā)生相互作用的可能性。P值低（P<0.05）提示觀察到的相互作用化合物的數(shù)量顯著大于預(yù)期數(shù)量，可認為是核心目標。本研究以基因靶點關(guān)聯(lián)閾值≥400、靶點分值≥0.2、P<0.05為條件進行篩選，建立肝積方作用靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 疾病靶點收集

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索“Hepatocellular Carcinoma”，獲取肝癌疾病相關(guān)基因，設(shè)置相關(guān)性得分（relevance score）≥10，提取高關(guān)聯(lián)度靶點基因，建立疾病相關(guān)基因靶點數(shù)據(jù)庫[12]。

1.4 靶點生物功能富集分析

對肝積方和HCC 的靶點進行GO 富集分析及KEGG通路富集分析，GO富集分析包括分子功能、生物過程、細胞組分三部分。采用超幾何分布模型評估靶點群（gene set）是否與特定的基因本體及通路顯著關(guān)聯(lián)。經(jīng)過FDR（false discovery rate）法調(diào)整的P值可反映作用靶點與GO功能條目或KEGG通路的關(guān)聯(lián)強度。以調(diào)整的P<0.01為顯著關(guān)聯(lián)，通過基因的富集分析探討肝積方治療HCC的可能機制。

1.5 實驗驗證

1.5.1 動物

18只SPF級雄性SD大鼠（6周齡），購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，溫度（22±2）℃，濕度55%±10%，每日光照12 h。動物實驗步驟、實驗操作遵循實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會批準（PZSHUTCM210514001）。

1.5.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（貨號11965092），美國賽默飛世爾科技公司；胎牛血清（貨號C0237），美國Life Techonlogies公司；青霉素-鏈霉素（貨號15140122），美國Gibco公司；蛋白酶抑制劑（批號5892791001）、磷酸酶抑制劑（批號4906837001），瑞士ROCHE 公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號P0015）、RIPA蛋白裂解液（批號P0013B），碧云天生物技術(shù)有限公司；p-AKT（貨號#4058）、AKT（貨號#9272），美國CST 公司；鈣黏蛋白-E（E-cadherin，貨號20874-1-AP）、鈣黏蛋白-N（N-cadherin，貨號22018-1-AP）、波形蛋白（Vimentin，貨號10366-1-AP），武漢Proteintech 公司；鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail，貨號A11794），武漢ABclonal公司；微量BCA蛋白定量試劑盒（批號CW0014S）康為世紀生物科技有限公司；脫脂奶粉（批號232100），美國BD公司；ECL發(fā)光底物（批號WBKLS0500），美國Millipore公司。

Heracell 150i型二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司），SynergyH4 型酶標儀（美國BioTek 公司），Western 電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司），CPA3235 型電子天平（德國Sartorius 公司），Tanon 4600生物發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.5.3 細胞及藥物

大鼠肝癌細胞McA-RH7777細胞，購于中國科學(xué)院上海細胞所。以DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司），加入10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素，置于恒溫37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。肝積方（太子參15 g，珠兒參9 g，麩炒白術(shù)9 g，茯苓12 g，丹參9 g，巖柏15 g，馬蘭根15 g，牡蠣15 g，夏枯草15 g，鱉甲9 g，天龍9 g，地龍9 g，八月札9 g，制天南星6 g，山慈菇6 g，制半夏9 g），飲片購于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科中藥房，沸水煮0.5 h，煮2次，合并后濃縮，藥液置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 造模及藥物干預(yù)

大鼠按體質(zhì)量完全隨機分為對照組6只、造模組12只。對照組予生理鹽水皮下注射。造模組初次給予3 mL/kg 純CCl4皮下注射，后續(xù)將CCl4和橄欖油按1∶1比例混合后按2 mL/kg皮下注射，每周2次，以誘導(dǎo)肝纖維化。12周后，取對數(shù)生長期的McARH7777細胞制成單細胞懸液，造模組大鼠肝包膜注射4×106個細胞。3 d后造模組大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機分為模型組和肝積方組，每組6只。根據(jù)實驗動物和人臨床給藥劑量折算系數(shù)及大鼠體質(zhì)量計算給藥劑量，肝積方組大鼠灌胃肝積方16.9 g原藥材/kg，灌胃體積5 mL，模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)2周。干預(yù)結(jié)束后用2%戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠，取原位肝癌組織測量大小并稱重，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.5 Western blot檢測AKT相關(guān)蛋白表達

采用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液及勻漿提取各組大鼠肝癌組織蛋白，通過BCA法進行蛋白定量。蛋白變性后應(yīng)用10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，封閉后加入p-AKT、AKT、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail 一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液反應(yīng)，采用發(fā)光成像儀進行條帶采集分析。

1.5.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS24.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖。符合正態(tài)分布且方差齊時，實驗數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，用LSD-t檢驗進行兩樣本間比較；不符合正態(tài)分布或方差不齊時，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩樣本間采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝積方有效化學(xué)成分

通過TCMSP、HIT、TCMID、STITCH數(shù)據(jù)庫檢索后以QED閾值≥0.2對化學(xué)成分進行初步篩選，得到肝積方的有效化學(xué)成分127個。主要活性成分包括β-欖香烯、姜辣烯酮、芍藥醇、茯苓酸、丹參酮、黃芩苷等，見表1。

表1 肝積方主要活性成分（前20位）

2.2 肝積方有效成分作用靶點及肝癌疾病靶點

將肝積方各化學(xué)成分作用靶點信息應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫的基因搜索功能對其名稱進行標準化，建立肝積方主要作用靶點數(shù)據(jù)庫。基于二項分布的富集評分算法，篩選出主要作用靶點301個，包括Caspase-3、AKT、SEC61A1等。靶點分值前20位的靶基因見表2。

表2 肝積方活性成分作用靶點（前20位）

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫，以“Hepatocellular Carcinoma”關(guān)鍵詞進行檢索，選擇相關(guān)性評分>10的基因，建立疾病相關(guān)基因靶點數(shù)據(jù)庫，前60位與疾病相關(guān)的主要靶基因見表3。

表3 HCC主要相關(guān)靶點（前60位）

2.3 GO和KEGG通路富集分析

肝積方主要作用靶點及HCC疾病靶點GO富集分析見圖1?？梢钥闯?，二者顯示出共關(guān)聯(lián)性。與兩者顯著共關(guān)聯(lián)的GO生物過程主要有氨基酸代謝、蛋白質(zhì)水解、免疫調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)節(jié)過程等。

圖1 肝積方與HCC靶點GO生物過程富集分析

對肝積方靶點和HCC靶點進行KEGG通路富集分析。肝積方靶點與74條信號通路顯著相關(guān)，HCC靶點與63條信號通路相關(guān)聯(lián)，與兩者共關(guān)聯(lián)有31條（P<0.05）。主要共關(guān)聯(lián)信號通路包括PI3K-AKT、TNF-α、IL-17、Focal adhesion、drug resistance 等。這些信號通路與腫瘤細胞增殖、耐藥、炎性或細胞遷移、免疫逃逸等肝癌發(fā)生和進展病理過程密切相關(guān)，提示肝積方可能通過調(diào)控這些信號通路發(fā)揮治療HCC的作用。見表4、圖2。

表4 肝積方治療HCC靶點顯著關(guān)聯(lián)的信號通路（前12條）

圖2 肝積方與HCC靶點KEGG通路富集分析

2.4 肝積方對大鼠原位肝癌的生長及瘤組織AKT活化水平的影響

肝癌發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，臨床有80%患者具有肝纖維化或肝硬化的背景[13]。因此采用伴有肝纖維化微環(huán)境的非免疫缺陷大鼠原位肝癌模型驗證部分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果。由于建立原位癌手術(shù)中導(dǎo)致1只對照組及2只模型組死亡，故剩余對照、模型、肝積方組各5只完成后續(xù)生理鹽水或藥物干預(yù)過程。實驗結(jié)果顯示，15只大鼠HCC原位腫瘤造模均成功。模型組中腫瘤體積和質(zhì)量均較對照組增加；與模型組比較，肝積方組大鼠腫瘤質(zhì)量和體積均顯著減?。≒<0.05，P<0.01）。見圖3A、圖3B。

PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有廣泛的生物活性，可參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期、增殖、凋亡、遷移等多種過程，是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路[14-15]。因此，采用Western blot驗證肝積方對該通路的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，各組AKT表達無明顯變化，模型組瘤組織的p-AKT/AKT水平較對照組明顯上調(diào)，而肝積方組可抑制該比例（P<0.05），見圖3C、圖3D。表明肝積方可抑制纖維化環(huán)境HCC組織中AKT通路的活化水平。

圖3 各組大鼠原位肝癌生長情況及肝癌組織AKT蛋白表達

2.5 肝積方對大鼠原位肝癌組織相關(guān)分子的影響

腫瘤細胞受炎性、低氧、纖維化等腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進細胞腫瘤干性、抗凋亡、侵襲、遷移等能力。EMT與肝癌惡性程度密切相關(guān)，而PI3K-AKT 是促進腫瘤EMT 的重要調(diào)控通路[16]，因此檢測大鼠肝癌組織中EMT相關(guān)調(diào)控因子的表達水平。Western blot結(jié)果顯示，模型組E-cadherin表達較對照組明顯下調(diào)，N-cadherin、Vimentin、Snail表達顯著上調(diào)。與模型組比較，肝積方組E-cadherin表達明顯上調(diào)，N-cadherin、Vimentin、Snail表達均下調(diào)（P<0.01，P<0.05）。見圖4。提示肝積方具有逆轉(zhuǎn)纖維化微環(huán)境導(dǎo)致的肝癌細胞EMT作用。

圖4 各組大鼠肝癌組織EMT相關(guān)蛋白表達

3 討論

HCC是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，目前尚缺乏有效治療方法。HCC中醫(yī)病機總屬本虛標實，正虛邪實[17]。肝積方據(jù)此組方，攻補兼用，具有健脾益氣、清熱解毒、軟堅化痰作用，在長期用于肝癌治療中取得較好效果，尤其對于耐藥、術(shù)后及晚期肝癌患者能夠發(fā)揮一定作用。但由于其成分復(fù)雜性，動物模型無法模擬臨床肝癌病理，也難以用藥物直接干預(yù)細胞進行體外實驗，其作用機制迄今仍不清楚。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對肝積方的活性成分、HCC相關(guān)靶點和通路進行分析。共篩選出肝積方有效活性成分127種，主要包括β-欖香烯、姜辣烯酮、芍藥醇、茯苓酸等。依據(jù)這些靶標進一步篩選出301個主要作用靶點，包括Caspase-3、AKT、SEC61A1等，這些靶點與HCC高度相關(guān)。隨后對這些藥物靶標進行GO和KEGG通路富集分析，顯示肝積方可調(diào)控多條與HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物過程和信號通路，生物過程主要包括氨基酸代謝、蛋白質(zhì)水解、免疫調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)節(jié)過程，信號通路包括PI3K-AKT、TNF-α、IL-17、Focal adhesion、drug resistance 等信號通路。這些信號通路與HCC惡性進展密切相關(guān)，肝積方可能通過對這些通路多靶點、多環(huán)節(jié)的調(diào)控發(fā)揮抑瘤作用。

PI3K-AKT信號通路具有廣泛的生物學(xué)作用，該通路激活會促進HCC的代謝、增殖、抗凋亡、血管生成及耐藥[18]。該通路在多種腫瘤中活化，尤其在缺氧、炎癥、纖維化等微環(huán)境誘導(dǎo)下，酪氨酸激酶生長因子受體、G蛋白偶聯(lián)受體和癌基因（如RAS）的激活會導(dǎo)致PI3K-AKT信號通路的活化增強[19-22]。本研究中，模型組大鼠腫瘤體積和質(zhì)量較對照組增加，與模型組比較，肝積方組大鼠的腫瘤體積和質(zhì)量均顯著減小。同時，模型組瘤組織的p-AKT/AKT水平較對照組明顯上調(diào)，而肝積方組中該比例下調(diào)。以上結(jié)果提示肝積方能夠抑制HCC生長，其作用機制與PI3K-AKT信號通路有關(guān)。

研究表明，活化的PI3K-AKT信號通路可直接或通過參與其他分子信號通路誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生EMT，在肝癌進展中發(fā)揮重要作用[23-24]。PI3K-AKT 介導(dǎo)EMT的過程作為預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和耐藥的潛在靶點引起了廣泛關(guān)注。EMT指具有極性的上皮型細胞在某些因素刺激下失去基底膜附著極性，細胞間失去緊密連接和黏附能力，轉(zhuǎn)換為間質(zhì)型細胞的過程。EMT與腫瘤惡性程度密切相關(guān)，在腫瘤細胞的存活、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、腫瘤耐藥等病理過程中，EMT扮演著重要的角色[25]。E-cadherin表達缺失是EMT產(chǎn)生的標志，會促使細胞內(nèi)發(fā)生信號級聯(lián)反應(yīng)，繼而促進HCC細胞侵襲遷移能力增強[26]。EMT發(fā)生時，細胞骨架發(fā)生重大改變，細胞角蛋白骨架會轉(zhuǎn)化成Vimentin為主的間質(zhì)細胞形態(tài)[27]。N-cadherin也是一種介導(dǎo)細胞與細胞間黏附的跨膜蛋白，當EMT發(fā)生時，N-cadherin 表達會升高[28]。Snail 是EMT 的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，是肝癌EMT中最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[29]。PI3K-AKT通路是EMT中一條重要的調(diào)控通路。一方面，AKT表達能抑制Snail降解，另一方面PI3K-AKT活化能直接促進Snail表達，調(diào)控Vimentin轉(zhuǎn)錄表達升高，并降低E-cadherin表達[23]。本研究顯示，與模型組比較，肝積方組E-cadherin表達顯著上調(diào)，N-cadherin、Vimentin、Snail被明顯抑制，表明肝積方能有效抑制HCC發(fā)生EMT。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以及進一步的肝積方干預(yù)大鼠原位肝癌的體內(nèi)實驗，明確了肝積方抑制HCC的作用，并揭示調(diào)控PI3K-AKT信號通路抑制EMT是促進其藥效作用的部分機制。由于AKT/EMT是導(dǎo)致腫瘤干性、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等的重要機制，因此可為肝積方在臨床發(fā)揮抑瘤生長、轉(zhuǎn)移及改善耐藥等作用提供生物學(xué)依據(jù)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SEC61A1、Caspase-3等分子是肝積方治療HCC的潛在靶點，TNF-α、IL-17、Focal adhesion、drug resistance等信號通路可能是其干預(yù)的信號途徑，為后續(xù)更廣泛深入的相關(guān)藥理機制研究提供了方向，有待通過體內(nèi)及體外實驗進一步明確。