百香果香氣成分的氣相色譜-嗅覺-質譜分析

顧鈺宸，馮 濤

（上海應用技術大學香料香精化妝品學部，上海 201418）

百香果（Passiflora eduliaSims）是一種西番蓮科植物，大量種植于熱帶和亞熱帶地區，有“果汁之王”的美譽[1]。百香果的果實具有獨特的香氣，是天然濃縮汁和天然香料[2-3]。香氣是評價其品質的關鍵特征之一，它混合了番石榴、芒果、蘋果、香蕉、荔枝、草莓、檸檬和菠蘿的香氣[4]。此外，百香果富含大量多酚、黃酮、類胡蘿卜素、維生素C等活性物質[5]。

目前對百香果的研究主要集中在其抗氧化[6-7]、抗炎[7-8]、降血糖[9]等藥理作用上，對其揮發性香氣化合物的研究較少。Li 等[4]使用HS-SPME-GC/MS 結合轉錄組分析方法對百香果成熟過程中香氣形成機制進行研究，分析了不同成熟階段的百香果果實揮發性化合物，發現隨著百香果的成熟，其香氣會急劇增加。Md 等[10]采用1H NMR 結合化學計量學分析方法，對不同成熟階段采收的百香果代謝產物進行了分析，發現所有代謝物都相互關聯，最終導致百香果的成熟。

氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和嗅辨儀（olfactometer，O）常被聯合用于表征并鑒定不同種類樣品中的揮發性香氣化合物[11-13]。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）與溶劑輔助風味蒸發（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）是較為常用的提取樣品中香氣化合物的前處理方法[14-20]。如今，香氣提取稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）與氣相色譜-嗅覺-質譜儀（gas chromatography-olfactometry-massspectrometry，GC-O-MS）相結合的應用已成為識別和表征許多食品中香氣活性化合物的有效方法[21-23]。然而，目前這種復雜的方法尚未應用于百香果揮發性香氣化合物的鑒定。

本研究旨在找到適合百香果香氣的提取方法并測定百香果中的香氣成分。首先使用AEDA 的方法鑒定不同提取方法得到的百香果香氣化合物，之后定量香氣化合物并計算OAV，最后進行香氣重組與缺失試驗，從而為百香果產品質量控制和工藝改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果，廣西桂平；NaCl、NaOH、葡萄糖和酒石酸，分析純，北京化學試劑公司；固相萃取柱Cleanert PEP-SPE（1 000 mg 填料），天津博納艾杰爾科技有限公司；D-葡萄糖酸內酯、聚乙烯基吡咯烷酮和C6～C30正構烷烴，美國Sigma 公司；香氣標準品，美國Sigma 公司和瑞士Fluka 公司。

1.2 儀器與設備

嗅辨儀（olfactory detection port，ODP），德國Gerstel 公司；溶劑輔助風味蒸發裝置（SAFE），德國Glasbl?serei Bahr 公司；Agilent 7890 GC 氣相色譜儀、Agilent 5975B MS 質譜儀，美國安捷倫科技有限公司；DVB/CAR/PDMS頂空固相微萃取頭，美國Supelco 公司；DB-Wax 氣相色譜柱、HP-INNOWax 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），美國J&W Scientific 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

（1）SPME

醫院通過辦公自動化,強化對網絡安全管理,培養專業檔案人才,制定檔案管理標準,工作效率出現顯著提升,而且整體操作規范統一。詳情見下表1。

稱取5 g 百香果香料和1 g NaCl 快速放入萃取瓶中，將裝有樣品的萃取瓶放入50 ℃的恒溫水浴鍋中平衡20 min，用SPME 萃取頭扎入萃取瓶中同樣溫度下萃取30 min。提取后，將纖維轉移到進樣口，在250 ℃下解吸5 min，用于GC-MS 分析。

（2）SAFE

準確稱量20 g 百香果香料于500 mL 錐形瓶中，加入200 mL 二氯甲烷，在磁力攪拌器上提取1 h，轉置于分液漏斗中，上層液體置于500 mL 圓底燒瓶中，保留下層液體并轉移至錐形瓶中，以相同步驟再重復2 次后將3次上層液體合并于圓底燒瓶，得到的提取液在SAFE 裝置中進行提取。餾出物用無水硫酸鈉干燥，在旋轉蒸發儀上濃縮至5 mL，然后在溫和的氮氣流下進一步濃縮至200 μL。在GC-MS 和GC-O 分析前，濃縮于-20 ℃保存。

1.3.2 GC-MS 測定條件

采用DB-Wax 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度230 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min；以4 ℃/min 上升至120 ℃，保持6 min；再以10 ℃/min 上升至230 ℃，保持6 min；載氣為氦氣；柱內載氣流量1 mL/min；不分流。電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度150 ℃；溶劑延時5 min；倍增器電壓1 964.7 V，掃描范圍20～400 amu。

1.3.3 GC-O-MS 測定條件

HP-INNOWax 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm,0.25 μm），載氣為氦氣，流速1 mL/min。進樣量為1 μL，不分流進樣。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至230 ℃，保持15 min。進樣口和輔助加熱區的溫度均為250 ℃。樣品經色譜柱分離后以1∶1 比例分別進入質譜和ODP 進行檢測。離子源為EI 源，電子能量為70 eV，質量掃描范圍為30～350m/z。質譜接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃。

將提取物用二氯甲烷溶劑逐步稀釋，由1∶2、1∶4、1∶8 直至1∶1 024。在上述GC 條件下，使用DB-Wax色譜柱通過GC-O 對每個稀釋樣（1 μL）進行分析，每個樣品及其每個稀釋度均由3 名經過半年以上聞香培訓的聞香員進行嗅辨分析，有兩位及以上聞香員嗅聞到的香味的化合物則計算其稀釋因子，直到無法檢測到任何香氣化合物為止。每種化合物的風味稀釋度（flavor dilution，FD）因子表示可以感知到的最大稀釋度。通過將其氣味、保留指數（retention index，RI）和質譜與真實化合物的氣味進行比較，識別每種氣味。

1.3.5 香氣重組試驗

AV 是香氣物質的濃度與閾值之比，表示特定氣味的效力，一般OAV＞1 則被認為是主要香氣。將百香果中FD≥8 或OAV≥1 的香氣化合物按其實際濃度混合在空白基質中作為重組模型，將其與未經處理的百香果香料香氣進行比較。小組人員共同討論得出6 個不同香氣類型用于描述百香果香氣，隨后對樣品的不同香氣類型進行了強度評估，以確定這些香氣化合物對百香果整體香氣貢獻的影響。

1.3.6 缺失試驗

根據香氣類型及化合物類別將上述香氣化合物分組，設計缺失試驗驗證單一組分對百香果的香氣貢獻。試驗需要用到缺失某一種香氣組分的缺失模型與2 個完整的香氣重組模型。所有樣品都標有三位數代碼并以隨機的順序呈現給專家小組成員進行三角測試，小組成員需要區分出缺失模型與2 個完整的香氣重構模型，確定缺失模型和重構模型差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 百香果揮發性香氣化合物的識別

通過SPME 鑒定共檢測到71 種揮發性組分（見下頁表1），其中酚類7 種、脂肪酸乙酯類7 種、脂肪酸類6種、高級醇類5 種、C6醇類5 種、內酯5 種、醛酮類3 種、硫化物2 種、高級醇乙酸酯類2 種、C13-降異戊二烯1 種以及其他類3 種。FD 值大于1 024 的香氣物質有β-大馬士酮、己酸、β-苯乙醇和4-乙基苯酚。

表1 利用AEDA-GC-O-MS 鑒定百香果香料關鍵香氣活性物質Table 1 Identification of key aroma active substances in passion fruit spices using AEDA-GC-O-MS

續表

在SAFE 提取物的香氣化合物中，共嗅聞到39 個香氣區域，其中23 個香氣區域可實現化合物的定性，與SPME 中香氣物質相似，仍有16 個香氣區域未被鑒定。鑒定的23 種香氣物質中，包括揮發性酚類8 種、內酯4種、脂肪酸類3 種、高級醇類2 種、醛酮類2 種、C13-降異戊二烯1 種、C6醇類1 種、硫化物1 種以及其他類1 種。其中，β-苯乙醇（玫瑰、花香）、愈創木酚（甜香、焦糖味）具有最大的FD 值（FD＞1 024），其次為γ-壬內酯（甜香、焦糖味、果干），FD 值達512。另外，4-乙基苯酚、異丁香酚、β-大馬士酮、己酸、對甲酚、間甲酚、4-乙烯基愈創木酚、紫丁香酚、甲硫基丙醛、γ-丁內酯、香草醛、雙乙酰、苯乙醛、異戊酸及14 種未知化合物的FD 值也都不低于8。

總體上，利用AEDA-GC-O-MS 技術鑒定了由SPME 和SAFE 萃取樣品中的關鍵香氣物質共71 個香氣區域，每個香氣區域均由兩位及以上的專業品評員共同嗅聞確定。其中47 個香氣區域能夠實現香氣物質的鑒定，但仍有24 個香氣區域無法鑒定，這可能與上述化合物為痕量物質或存在共流出現象有關。高級醇物質是百香果重要的風味物質化合物，在百香果中共檢測到高級醇類物質5 種；其中β-苯乙醇具有最大FD 值（FD＞1 024），其次為異戊醇，FD 值達512。脂肪酸乙酯類物質主要表現為果香，其中辛酸乙酯的FD 值達512，除苯乙酸乙酯外，其他脂肪酸乙酯類香氣物質的FD 值均在8～128 之間。高級醇乙酸酯類物質主要貢獻花香和果香，其中乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的FD 值均不低于8。揮發性酚類物質中4-乙基苯酚具有最大FD 值（FD＞1 024），在嗅聞過程中表現為動物味、馬廄味和皮革味；另外，4-乙烯基愈創木酚（李子干、肉桂）、丁香酚（李子干、香料）、愈創木酚（甜香、煙熏）和對甲酚（動物味）也都具有較大的FD 值。脂肪酸類物質主要表現為脂肪味和酸腐味，其中己酸具有最大FD 值（FD＞1 024），除辛酸外，其他脂肪酸類香氣物質的FD 值均在16～256 之間。C13-降異戊二烯對果實的花香、果香貢獻最大。本試驗中嗅聞到的C13-降異戊二烯中FD 值最大的為β-大馬士酮（FD＞1 024），嗅聞過程中表現為花香、甜香和蜂蜜味。C6醇類物質對香氣的貢獻也比較大，嗅聞過程中主要表現為生青味，1-己醇、順式-3-己烯醇、反式-3-己烯醇、順式-2-己烯醇以及反式-2-己烯醇的FD 值均不低于8。

除上述物質外，百香果還鑒定出了內酯、硫化物、醛酮類物質等，也對香氣有較大貢獻。內酯主要為γ-丁內酯（烘烤味、烤杏仁）、γ-己內酯（黃瓜、植物味）、γ-辛內酯（花香、椰子）和γ-壬內酯（甜香、焦糖味、果干），它們的FD 值均不低于8。硫化物在嗅聞過程中表現為煮土豆味，甲硫基丙醇和甲硫基丙醛的FD 值分別為8 和128。醛酮類物質也稱羰基化合物，既可能來源于果實，也可來源于微生物代謝，其中雙乙酰表現為黃油味、酸奶味，FD 值達512；苯乙醛表現為玫瑰花香，FD 值為128。此外，麥芽酚（甜香、焦糖味）和香草醛（香草味）的FD 均不低于8，對香氣有一定貢獻。在未知化合物中，未知物1533 和1901 的FD 值為256，而未知物2246 和2257 的FD 值也可達128，對百香果整體香氣可能有較大貢獻，但需要提高色譜的分離度或質譜的分辨率對未知嗅聞區域的物質做進一步定性分析。

2.2 百香果揮發性香氣成分的定量及OAV 的計算

對百香果中的揮發性香氣成分進行OAV 的計算，篩選出OAV＞1 對香氣有貢獻的成分。

由表2 可知，由SPME 方式萃取的百香果香料中香氣化合物含量最高的為乙酸，其次為異戊醇，含量分別為676.44 mg/L 和177.11 mg/L，分別占香氣物質總量的55.58%和14.55%。另外，乳酸乙酯、2,3-丁二醇、異丁醇、γ-丁內酯、乙酸乙酯、β-苯乙醇、1-己醇、異丁酸、辛酸、己酸、癸酸、辛酸乙酯和丁酸的含量均超過1 mg/L。

對定量的香氣化合物進行OAV 分析，具體結果見表2。OAV 大于1 的游離態香氣化合物共有23 種，包括脂肪酸乙酯7 種、脂肪酸類6 種、高級醇類3 種、醛酮類2種、高級醇乙酸酯1 種、其他酯類1 種、C13-降異戊二烯類1 種、C6醇類物質1 種和硫化物1 種。根據OAV 結果發現，β-大馬士酮（OAV=707.80）、苯乙醛（OAV=164.10）和己酸乙酯（OAV=112.20）的OAV 較高，可能對百香果的香氣特征有較大貢獻。高級醇類物質中的異戊醇、β-苯乙醇、異丁醇和脂肪酸類物質中的辛酸、己酸、乙酸的OAV 均大于1。雖然乙酸和異戊醇的含量最高，但其OAV 并不高，僅為3.38 和2.72。這說明香氣化合物的含量并不能完全反映其對百香果香氣的貢獻。

表2 基于SPME、SAFE 前處理后樣品中香氣物質的OAV 計算Table 2 OAV calculation based on aroma substances in samples after SPME and SAFE pretreatment

百香果中的酯類物質的含量常超過其感官閾值，可以賦予百香果濃郁的果香和甜香。本試驗中鑒定出的酯類物質主要為脂肪酸乙酯類，含量在0.003～115.39 mg/L之間，其中己酸乙酯具有最大的OAV，達112.20；另外，乙酸異戊酯、乙酸乙酯以及乳酸乙酯的OAV 均大于1。醛酮類物質苯乙醛的OAV 僅次于β-大馬士酮（OAV=161.40），而該物質在GC-O 分析中也具有較大的FD 值。另外，辛酸、癸醛、乳酸乙酯、癸酸乙酯的FD 值均小于8，但它們的OAV 值均超過1。由此可見，在GC-O稀釋分析與OAV 分析鑒定重要化合物時存在一定差異。百香果中OAV 大于1 的結合態香氣化合物共有10 種，包括揮發性酚類4 種、脂肪酸類2 種、醛酮類2 種、硫化物1 種和C13-降異戊二烯類1 種。

2.3 香氣重組與缺失實驗

FD 值和OAV 的分析結果確定了影響百香果香氣的關鍵香氣物質。然而，揮發性化合物之間的相互作用沒有考慮在內。為了驗證上述主要香氣化合物對百香果整體香氣的貢獻，對百香果香料及香氣重構模型進行定量描述分析。采用FD≥8 或OAV≥1 的42 種香氣物質進行香氣重構分析，重構模型由模擬溶液與42 種化合物組成，見圖1。

圖1 百香果香料與重構香料香氣輪廓分析Fig.1 Aroma profile analysis of passion fruit spices and reconstituted spices

百香果香料及重構模型的得分情況如圖1 所示，在6 種香氣中，果香、甜香和花香有較強的香氣強度，而酸香、柑橘香和青草香不太明顯。另外，通過重構試驗發現重構模型與原樣相比，香氣輪廓基本一致，但是重構模型的香氣強度均低于原樣，可能是由于在GC-O 分析實驗中，存在許多未被鑒定的FD 值較大的嗅聞區域，而這些化合物未被添加進重構模型所造成的。

為了驗證上述香氣化合物對百香果香氣輪廓的影響，根據香氣類別及化合物類型將上述香氣化合物分成5 組，建立5 組缺失模型，缺失物質分為酯類物質、β-大馬士酮、揮發性酚類物質、C6醇類物質和脂肪酸類物質。分別缺失這5 組香氣化合物，通過三角檢驗對比缺失香氣與未缺失香氣的重構模型之間是否存在差異，來確定其對整體香氣的貢獻，缺失試驗結果如表3（見下頁）所示。

表3 百香果香料缺失試驗結果Table 3 Results of passion fruit spice deficiency experiment

由表3 可知，酯類物質、β-大馬士酮及C6醇類物質的缺失組與未缺失組之間存在極顯著的差異（P＜0.001）。揮發性酚類物質很顯著影響百香果香料的香氣感知（P＜0.01），這些物質主要賦予百香果水果味、香料味及甜味，這類香氣在重構時也與百香果輪廓較為相似，進一步說明揮發性酚類物質是百香果香料的特征香氣物質。脂肪酸類物質對其的香氣感知也有顯著影響（P＜0.05），在嗅聞過程中主要表現為脂肪味、酸腐味，雖然不是百香果香料主要的香氣輪廓，但缺失檢驗顯示其對百香果香料的香氣存在影響。

3 結論

本研究證明了固相微萃取和溶劑輔助風味蒸發是提取百香果香氣化合物較好的方法。通過香氣提取物稀釋分析共識別出71 種百香果香氣化合物，對它們進行定量，并計算氣味活性值。其中β-大馬士酮的FD 因子與OAV 值最高，可被認為是百香果香氣最重要的貢獻物。把FD≥8 或OAV≥1 的化合物進行香氣重組與香氣缺失試驗，結果表明重組模型與百香果香氣沒有明顯差異且5 組香氣化合物對百香果香氣存在影響。本研究彌補了百香果香氣化合物研究方向的空白，為百香果的產品質量控制和工藝改進提供了參考。