脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液的制備及其微流變特性

劉興麗，魏瑩瑩，張艷艷，王宏偉，馮志強，張 華,

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.三全食品股份有限公司，河南 鄭州 450000）

馬鈴薯是世界上僅次于小麥、水稻和玉米之后的第4大糧食作物[1]。馬鈴薯蛋白為完全蛋白質，由19 種氨基酸組成，其中必需氨基酸含量為20.1%，占氨基酸總量的47.9%，與雞蛋蛋白相當，且致敏蛋白含量較少，賴氨酸比例高，是極具潛力的食品蛋白來源[2]。隨著植物蛋白越來越受到重視，馬鈴薯蛋白作為優質的植物蛋白資源被廣泛應用于食品工業。然而，作為馬鈴薯淀粉生產過程中的副產物，馬鈴薯蛋白在回收過程中易受到高強度熱處理的影響而使其功能性質遭到破壞，如乳化性、溶解性、起泡性等降低[3]，進而限制了其在食品行業中的進一步應用。馬鈴薯蛋白在液態食品的應用中易發生乳化穩定性不佳，體系失穩現象，主要表現為油水分離、脂肪球上浮與蛋白質沉淀等，嚴重影響食品品質。為了解決乳液的失穩問題，食品工業實際生產加工中常常通過加入乳化劑、增稠劑和品質改良劑等食品添加劑，達到控制乳制品穩定性的目的。

脫酰胺是一種常用且有效的改性方法。通過增加蛋白質表面的負電荷改善食物蛋白質的溶解度和其他功能特性[4]。脫酰胺改性主要分為物理法脫酰胺、化學法脫酰胺和酶法脫酰胺。與化學法、物理法脫酰胺相比，酶法脫酰胺具有高特異性、效率高、條件溫和及安全等優點[5]。谷氨酰胺酶是一種食品級商業酶，沒有谷氨酰胺轉氨酶的交聯作用，也沒有蛋白酶的水解作用，它只作用于蛋白質和多肽中的谷氨酰胺基團[6]。谷氨酰胺酶已被用來修飾多種植物蛋白，如大米蛋白、豌豆蛋白、面筋蛋白和大豆蛋白。Liu Yongle等[7]證明谷氨酰胺酶脫酰胺能顯著提高大米谷蛋白在溫和酸性（pH 5）和中性緩沖液（pH 7）中的溶解度，改善乳化性、起泡性。Li Dan等[8]認為與原大豆分離蛋白相比，在pH 3～10范圍內脫酰胺大豆蛋白具有更高的乳化穩定性。Xiang Huan等[9]認為谷氨酰胺酶處理1%和8%的大豆蛋白能顯著提高其乳化能力和乳液穩定性。但是目前關于谷氨酰胺酶脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液特性的研究鮮有報道。

本實驗研究不同脫酰胺時間（0、0.5、3、6、12 h）馬鈴薯蛋白的乳液特性，研究不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白對乳液的粒度分布、穩定性、微流變特性及微觀結構的影響。通過對脫酰胺馬鈴薯蛋白乳化特性的研究，以期提高馬鈴薯的產品附加值和綜合利用率，解決馬鈴薯加工廠淀粉廢液直接排放的污染問題，同時為馬鈴薯蛋白的深入研究及產品開發提供參考，為尋找天然植物蛋白乳化劑并將其應用于食品加工中提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯蛋白（蛋白含量90.01%） 甘肅省蘭州沃特萊斯生物科技有限公司；谷氨酰胺酶 天野酶制劑（江蘇）有限公司上海分公司；大豆油 河南省益海嘉里（安陽）食品工業有限公司；實驗用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MS7-H550-Pro型磁力攪拌器 北京大龍興創實驗儀器有限公司；FE20 Plus型pH測量計 上海儀電科學儀器有限公司；LGJ-50FD型冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；Turbiscan Lab多重光散射儀、Rheolaser Master光學法微流變儀 法國Formulaction公司；TD5M型低速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SHZ-A往復型-恒溫水浴振蕩器 江蘇省金壇市城西春蘭實驗儀器廠；IKA型高剪切分散乳化機德國弗魯克流體機械制造有限公司；UV762型紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；JY1002型電子天平上海諾科儀器儀表有限公司；MP200A型電子天平（千分位） 上海良平儀器儀表有限公司；Nano-ZS激光納米粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；BX53M偏光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法脫酰胺

將馬鈴薯蛋白分散在pH 7.0200 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中，形成（1±0.002）g/100 mL的分散懸浮液，磁力攪拌30 min使馬鈴薯蛋白分散均勻，制備馬鈴薯蛋白溶液。添加一定量的谷氨酰胺酶（酶底比為1∶400）進行改性反應，于50 ℃水浴搖晃0、0.5、3、6、12 h，得到不同脫酰胺時間下的馬鈴薯蛋白質酶解溶液（記為DPP-0 h、DPP-0.5 h、DPP-3 h、DPP-6 h和DPP-12 h）。空白組則以不加酶的相同質量濃度的馬鈴薯蛋白質溶液在上述相同條件下反應12 h。反應結束后迅速進行冰浴冷卻以抑制谷氨酰胺酶的活性，馬鈴薯蛋白質酶解溶液以及空白組溶液均用去離子水透析24 h，然后將蛋白溶液真空凍干成固體粉末，在室溫下保存在密封袋中，用于進一步分析。

1.3.2 脫酰胺馬鈴薯蛋白的乳液制備

參照仇超穎[10]的方法并修改，將一定質量的脫酰胺馬鈴薯蛋白質粉末溶于去離子水中，并將蛋白溶液與大豆油按1∶4（V/V）混合，于高速均質機中10000 r/min室溫下均質2 min。

1.3.3 脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液粒徑的測定

采用LS 13320激光納米粒度儀測定乳液的粒徑。乳液的相對折射率是1.022，即馬鈴薯蛋白顆粒的折射率為1.360，與去離子水的折射率之比為1.330。每個樣品測量3 次，取平均值。用體積平均直徑（D4,3）和表面平均粒徑（D3,2）表征乳液液滴粒度的大小[11]。

1.3.4 脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液物理穩定性的測定

穩定性動力學指數（Turbiscan stability index，TSI）可用來評估樣品穩定性。參照Santos等[12]的方法并修改。將乳液置于樣品池中，以掃描模式運行，測試溫度25 ℃，使用Turbiscan Lab多重光散射儀分析3 h，用TSI表征樣品的乳液穩定性。

1.3.5 脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液微流變特性的測定

采用擴散波譜動態光散射技術，通過Rheolaser Master光學法微流變儀分析不同脫酰胺時間下馬鈴薯蛋白乳液液滴的布朗運動[13]。以液滴均方根位移（mean square displacement，MSD）隨時間的變化測定粒子的布朗運動。參數設定：樣品體積20 mL；溫度25 ℃；測量時間3 h。通過專利運算法得出粒子MSD與去相關時間的關系，獲得樣品的彈性因子（elasticity index，EI）、固液平衡點（solid liquid balance，SLB）、宏觀黏度指數（macroscopic viscosity index，MVI）和流動性指數（fluidity index，FI）。微流變儀通過多散斑擴散波光譜學理論分析軟物質的微流變特性。

1.3.6 脫酰胺馬鈴薯乳液微觀結構測定

取不同乳液樣品適當稀釋后滴加到載玻片中央，蓋上蓋玻片，置于載物臺上，用20 倍光學顯微鏡進行觀察。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 谷氨酰胺酶對馬鈴薯蛋白乳液粒徑的影響

乳液屬于熱力學不穩定體系，貯存過程中由于兩相熱力學不相容導致相分離趨勢，主要表現為分層、沉降、絮凝、聚結、奧氏熟化和相轉化等[14]。乳液粒度大小是衡量乳濁液穩定性的一個有效指標[15]。通常乳液粒徑越小，乳液體系越穩定[16]。由表1可知，脫酰胺馬鈴薯蛋白可以制備出粒徑較小且比較穩定的乳液。隨著脫酰胺時間的延長，馬鈴薯蛋白乳液的D4,3呈現先減小后增大的趨勢。脫酰胺0.5 h的馬鈴薯蛋白乳液的D4,3為8.17 μm，這一較小的粒徑數值表明液滴表面凈電荷增加，液滴在靜電作用下不易聚集。蛋白具有較好的降低界面膜界面張力的能力，也可能是因為體系中馬鈴薯蛋白在界面發生重排進而穩定了水油兩相。脫酰胺12 h的馬鈴薯蛋白乳液的D4,3升高至13.46 μm，這表明脫酰胺12 h時并未達到蛋白的飽和吸附濃度[17]，油滴未被乳化劑完全包裹吸附，導致油滴穩定性差。這些結果表明脫酰胺后馬鈴薯蛋白分子結構的展開及溶解性的增加使蛋白質具有較高的界面活性，馬鈴薯蛋白能夠在油-水界面迅速吸附，降低界面張力，形成較小的油滴。谷氨酰胺酶已經在小麥面筋蛋白、大米蛋白、玉米醇溶蛋白中應用并成功改善其溶解度、乳化性、起泡性等功能性質，但目前關于谷氨酰胺酶處理馬鈴薯蛋白的研究鮮有報道。Jiang Zhongqing等[18]發現酶法脫酰胺后，脫酰胺度越高的燕麥蛋白形成的乳液中大油滴比例減小、小油滴比例增大，粒徑分布更均勻。谷氨酰胺酶處理過的馬鈴薯蛋白乳液具有類似的結果，乳液粒徑顯著減小（P＜0.05），使乳液更均勻。非酶法脫酰胺也是一種常用的脫酰胺方法，但是非酶法脫酰胺常會引起蛋白質的水解或者產生不良風味。Wu等[19]用酸處理小麥面筋蛋白后提高了其乳化和穩定性，并指出酸處理導致蛋白質肽鍵的水解及較高的熱處理溫度導致蛋白溶解性提高，而谷氨酰胺酶可以特異性地催化蛋白質中谷氨酰胺和天冬酰胺殘基的脫酰胺，只產生輕微的水解[20]。

表1 脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液的粒徑分布Table 1 Particle size distribution of deaminated potato protein emulsions

2.2 谷氨酰胺酶對馬鈴薯蛋白乳液穩定性的影響

TSI可以反映多種不穩定（如乳化、聚結和/或絮凝）變化的綜合效應，與乳狀液體系的穩定性相關[21]。TSI值越高，系統穩定性越差[22]。如圖1所示，未進行脫酰胺處理的馬鈴薯蛋白乳液的TSI值較大，穩定性較低。脫酰胺處理0.5、3、6 h的馬鈴薯蛋白乳液的TSI值減小，說明脫酰胺處理可以提高馬鈴薯蛋白乳液的穩定性，可能是乳狀液液滴間相互作用較弱，不會發生聚集沉淀的現象，對乳狀液穩定性影響較小。脫酰胺處理12 h的馬鈴薯蛋白乳液的TSI值增大，乳液的穩定性降低。這可能是因為脫酰胺處理的時間較長，更多的疏水基團暴露出來，乳化穩定性降低。乳狀液液滴間相互作用較強，乳液的物理穩定性被破壞。

圖1 不同脫酰胺時間馬鈴薯蛋白乳狀液的TSI值Fig.1 TSI values of emulsions containing potato protein deaminated for different durations

2.3 谷氨酰胺酶對馬鈴薯蛋白乳液微流變特性的影響

2.3.1 脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液MSD曲線

微流變可以通過跟蹤粒子的布朗運動獲得MSD值測量乳液樣品的黏彈性特性。如圖2所示，脫酰胺馬鈴薯蛋白乳狀液的MSD曲線為線性，表明樣品為純黏性。純黏性流體（牛頓流體）中，粒子MSD與時間呈線性增長[23]。MSD曲線首先由長位移向短位移轉變，即彈性增加，顆粒間碰撞增加。去相關時間由短向長的MSD曲線變化，表明黏度增加。通過研究顆粒的運動軌跡，可以感知樣品結構的變化。同時，MSD曲線可以反映樣品的黏彈性與流體特征[24]。由圖2可知，脫酰胺6 h的馬鈴薯蛋白乳液的變化最大，彈性平臺的MSD值最低，說明脫酰胺6 h的馬鈴薯蛋白乳液的黏度最高。

圖2 不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白乳液MSD曲線Fig.2 MSD curves of emulsions containing deaminated potato protein with different deamidation time

2.3.2 脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液MSD斜率、MVI、EI、SLB和FI

MSD斜率可以提供運動類型信息，量化動力學特性。去相關時間較長的時間內，MSD斜率可以用來監測粒子的運動。MSD斜率等于1時，它提供了液滴隨機運動的布朗運動，沒有特定的終點和規律；MSD斜率大于1時為彈道運動，通常對應于沉降；而MSD斜率小于1時，由于樣品中結構的形成，液滴運動受阻。穩定的流體系統中，質點的運動在很短時間內是彈道運動，而不穩定的系統中，運動是長時間的彈道運動[25]。如圖3所示，未經過脫酰胺處理的馬鈴薯蛋白乳液的MSD斜率大于1，說明它的乳液體系相對不穩定。未脫酰胺和脫酰胺的馬鈴薯蛋白乳液剛開始時的MSD斜率大于1，說明顆粒的運動是彈道運動，而不是純布朗運動，說明剛開始有粒子的沉降。脫酰胺3 h的馬鈴薯蛋白乳液在0.5 h后MSD斜率等于1，說明粒子此時的運動是布朗運動[26]。脫酰胺6 h和脫酰胺12 h的馬鈴薯蛋白乳液中結構形成，液滴運動受阻；這可以解釋為蛋白質的氧化降低了表面的疏水性，促進了類似液滴的形成，這些液滴容易聚集形成網絡，導致運動受阻。

圖3 不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白乳液MSD斜率Fig.3 MSD slopes of emulsions containing potato protein deaminated for different durations

MVI為平臺區域后MSD曲線的斜率，與宏觀黏度有關，能反映體系的質構、流動性、長期穩定性[27]。粒子移動到一定距離的時間越長，表示液滴運動速度越低，MVI值越高。另一方面，粒子移動的越快，樣品的黏度越弱，粒子移動的越慢，樣品的黏度越強[28]。MVI實際為乳液在零剪切速率下的黏度，是表征體系結構承受低剪切效應的能力，數值越大，說明體系的結構越強[29]。如圖4所示，脫酰胺改性6 h的乳狀液MVI值最大，黏度最大。不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白乳液的MVI值與未處理的相比呈現增大的趨勢，更高的宏觀黏度說明粒子需要更多的時間移動，它們具有較低的粒子速度，可能會提高乳液的穩定性。

圖4 不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白乳液MVI曲線Fig.4 MVI curves of emulsions containing potato protein deaminated for different durations

EI可以表示樣品彈性隨時間的變化過程[30]。EI值對應于MSD平臺值的倒數，平臺值越高，EI值越低。如圖5所示，未經處理的乳液EI值較低，說明乳液液滴間的相互作用較差。酶解時間延長，乳狀液的EI值升高，說明酶解處理增加了乳液的彈性。EI值的增大表明乳液形成了致密的結構。較高的EI值歸因于較高的表面蛋白濃度和較厚的界面層，可以防止液滴的破壞和聚集，乳液相對穩定[31]。

圖5 不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白乳液EI曲線Fig.5 EI curves of emulsions containing potato protein deaminated for different durations

SLB值代表樣品固體性質和液體性質的比率，反映固液特性。0＜SLB＜0.5時，體系中固體行為（凝膠行為）占主導作用；SLB＝0.5時，體系中液體行為與固體行為同等；SLB＞0.5時，體系中液體行為占據主導地位[32]；SLB＞1表示沉積物的出現。較短的去相關時間內，SLB值對應MSD平臺區的斜率；斜率越高，粒子移動越快，說明樣本更趨向于液體。如圖6所示，剛開始乳液的SLB值都很大，隨著時間的延長SLB值逐漸降低，后面趨于穩定。未經過脫酰胺處理的馬鈴薯蛋白乳液的SLB值最大，表明乳液的乳化性不好，存在上浮和下沉的現象。經過谷氨酰胺酶處理過的馬鈴薯蛋白乳液SLB值在0.5～1.0之間，乳液的黏度降低，乳液的流動性增強，液滴運動速率增加，液體行為更加明顯。乳液中，液滴運動速率低可能表示體系處于穩定狀態，而過高的運動速率可能與液滴的沉降和乳液的相分離有關。

圖6 不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白乳液SLB曲線Fig.6 SLB curves of emulsions containing potato protein deaminated for different durations

FI反映了系統中液滴的流動性，與MVI呈負相關[33]。如圖7所示，未處理的脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液的FI值最大，乳液流動性最快，這是因為未處理的乳液的黏度較小，粒子的運動速度快。經過脫酰胺處理0.5、3、6 h和12 h的乳液FI值降低，乳液黏度增大，粒子運動速度減慢。這說明脫酰胺處理對馬鈴薯蛋白乳液的布朗運動有一定的促進作用。

圖7 不同脫酰胺時間的馬鈴薯蛋白乳液FI曲線Fig.7 FI curves of emulsions containing potato protein deaminated for different durations

2.4 谷氨酰胺酶對馬鈴薯蛋白乳液微觀結構的影響

由圖8可知，未經過脫酰胺改性的馬鈴薯蛋白乳液油滴大而且分散不均勻；脫酰胺0.5 h的馬鈴薯蛋白乳液油滴與未改性的乳液相比大油滴減少、小油滴分布較多；脫酰胺3 h和6 h的馬鈴薯蛋白乳液液滴分布相對均勻，形成的乳液液滴較小，這可能是因為靜電斥力增大，阻止了液滴的聚集；脫酰胺12 h的馬鈴薯蛋白乳液相比脫酰胺3 h和6 h的馬鈴薯蛋白乳液油滴大且分布較為分散，這可能是因為蛋白分子在油水界面間的相互作用受到抑制，降低了界面膜的黏彈性[34]，此外電荷斥力降低使蛋白在界面既不能伸展也不能重新排布[35]。

圖8 脫酰胺馬鈴薯蛋白乳液的光學顯微鏡圖像Fig.8 Optical microscope images of deaminated potato protein emulsions

3 結論

采用谷氨酰胺酶處理馬鈴薯蛋白，探究谷氨酰胺酶對馬鈴薯蛋白乳化特性的影響，并對不同脫酰胺乳液的粒度分布、穩定性、微流變特性及微觀結構進行分析。結果表明，未經過脫酰胺處理的馬鈴薯蛋白乳液粒徑較大，乳液穩定性差；脫酰胺3 h和6 h的馬鈴薯蛋白乳液粒徑分布均勻，乳液較為穩定；微流變特性表明未經過脫酰胺的馬鈴薯蛋白乳液的MVI、EI值最小，SLB、FI值最大，說明未脫酰胺的乳液體系最不穩定，脫酰胺6 h的馬鈴薯蛋白乳液的MVI值最高，黏度最大，粒子運動速度減慢，形成的體系最穩定。因此，脫酰胺6 h的乳液體系較為穩定、乳液黏度、彈性較好。本實驗為馬鈴薯蛋白作為乳化劑的開發并將其應用于食品行業中提供一定理論基礎，為提高馬鈴薯的產品附加值提供思路，谷氨酰胺酶可能是提高馬鈴薯蛋白在食品工業中可用性的一種潛在工具。