丁香酚對靜電紡絲抑菌吸水襯墊結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

于 棟，馮旸旸，曹傳愛，孔保華，連軍強，劉 騫,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.成都希望食品有限公司，四川 成都 610000）

抑菌吸水襯墊是指將抗菌劑添加到吸水材料中而制備出兼?zhèn)湟志臀饔玫囊r墊。其被廣泛用于冷卻肉包裝中，用來吸附冷卻肉在運輸和銷售過程中滲出的血水，改善冷卻肉包裝環(huán)境，延緩微生物生長繁殖，達到延長冷卻肉貨架期的作用[1]。目前抑菌吸水襯墊的制備方法主要有凍干法[2]和流延法[1]。但是這些方法存在吸水能力低，制備方法復(fù)雜等問題。近年來，靜電紡絲作為一種連續(xù)制備納米纖維的技術(shù)在食品領(lǐng)域備受關(guān)注。其是利用高壓靜電場作用實現(xiàn)將紡絲液制備為納米纖維的一項技術(shù)[3]。在紡絲的過程中聚合物溶液受到電場力的作用被拉伸固化，最終在接收裝置表面形成一層納米纖維膜[4-5]。利用靜電紡絲技術(shù)制備的吸水墊具有孔隙率大、比表面積高等優(yōu)點[6-7]。適用于靜電紡絲技術(shù)的基材主要有蛋白質(zhì)（玉米醇溶蛋白[8]、明膠[9]等）、多糖（纖維素[10]、普魯蘭[11]等）和合成聚合物（聚乳酸[12]、聚乙烯醇[13]等）。其中聚乙烯醇是一種可降解的大分子材料，具有可紡性強，機械性能高以及安全無毒等諸多優(yōu)點。由于聚乙烯醇側(cè)鏈含有大量親水基團，使得聚乙烯醇納米纖維具有較強的吸水和鎖水能力，其可作為一種新型吸水材料應(yīng)用于冷卻肉保鮮中。

植物源抑菌劑具有較高的安全性，將其用于食品包裝是現(xiàn)代包裝材料的發(fā)展趨勢之一。植物來源的抗菌物質(zhì)主要有植物精油、中草藥提取物、果膠提取物[14]。其中，丁香酚是一種從丁香中提取的天然香料，具有抗菌和抗氧化等生物活性。但是丁香酚易受加工條件（加熱、高壓、酸堿性等）的影響，降低其自身的抗氧化和抑菌效果。因此，對丁香酚進行包埋處理是一種切實可行的解決方案。靜電紡絲技術(shù)具備優(yōu)異的包埋能力，可以有效的將丁香酚包埋到納米纖維吸水墊中制備活性包裝材料。Kayaci等[15]利用靜電紡絲技術(shù)包埋丁香酚制備了抑菌納米纖維膜，研究結(jié)果表明被包埋的丁香酚可以從納米纖維膜中緩慢穩(wěn)定釋放，其在活性包裝方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本課題組前期研究了聚乙烯醇的最佳紡絲濃度以及檸檬酸的最適交聯(lián)濃度[16]，在此基礎(chǔ)上本實驗基于靜電紡絲技術(shù)制備了兼?zhèn)涓呶院鸵志缘奈r墊，研究丁香酚添加量對抑菌吸水襯墊結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的影響，以期為靜電紡絲抑菌吸水墊在食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸 國藥集團化學試劑有限公司；聚乙烯醇上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司；丁香酚 上海源葉生物科技有限公司

1.2 儀器與設(shè)備

DFS-001高壓靜電紡絲機 北京新凱偉科技有限公司；SU8010掃描電子顯微鏡 日本日立集團；Nicolet iS-50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司；RW20機械攪拌機 德國IKA公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DMA Q800熱機械分析儀 德國耐馳儀器公司；Discovery DHR-1流變儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 靜電紡絲吸水墊的制備

配制紡絲溶液：首先配制質(zhì)量分數(shù)為7.5%的聚乙烯醇溶液，加入20 mg檸檬酸，然后稱取一定量的丁香酚加入其中。最終配制成添加丁香酚0%、5%、10%、15%、20%（以聚乙烯醇質(zhì)量計）的紡絲溶液。

靜電紡絲吸水墊的制備：將所得混合溶液移至10 mL注射器中，靜電紡絲吸水墊的制備采用電壓調(diào)節(jié)直流電源，施加電壓為15 kV，進樣速率為0.24 mL/h，接收距離為12 cm。然后將收集得到的納米纖維進行加熱處理，加熱條件為130 ℃、8 min，最終得到酯化交聯(lián)的靜電紡絲吸水墊，流程見圖1。

圖1 靜電紡絲吸水墊制作流程圖Fig.1 Production flow chart of electrospun absorbent pads

1.3.2 溶液性質(zhì)測定

1.3.2.1 電導(dǎo)率的測定

參照Altan等[17]的方法，將電導(dǎo)率儀Delta 326的探頭放入上述配制的溶液中進行測定，重復(fù)3 次。

1.3.2.2 表面張力的測定

參照Drosou等[18]的方法，利用DCAT21表面張力測定儀通過動態(tài)白金板法測定，重復(fù)3 次。

1.3.2.3 黏度的測定

參照Drosou等[18]的方法，并稍作修改。通過DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀在0～200 s-1剪切速率范圍內(nèi)采用動態(tài)剪切流變儀進行穩(wěn)態(tài)剪切流變實驗，以表征紡絲溶液的表觀黏度。其中測量溫度25 ℃、平板直徑40 mm、間隙高度1 mm。

1.3.2.4 pH值的測定

采用pH計在室溫（25 ℃）下測定各個紡絲溶液的pH值，每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 抑菌紡絲吸水墊形貌分析

參照Liu Yini等[19]的方法，剪取適當納米纖維樣品，將其直接粘在導(dǎo)電膠上，然后在真空環(huán)境中進行噴金處理，加速電壓5.0 kV，工作距離11.5 mm。挑選放大倍數(shù)50000的圖片并保存。利用電腦軟件Diameter-J對直徑統(tǒng)計分析。

1.3.4 抑菌紡絲吸水墊紅外分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測量納米纖維的紅外吸收光譜，光譜范圍500～4000 cm-1，掃描次數(shù)64。

1.3.5 抑菌紡絲吸水墊熱重分析

參照Li Mi等[20]的方法，稱取大約7 mg紡絲吸水墊于氧化鋁坩堝中，設(shè)置加熱溫度范圍為30～600 ℃，加熱速率為10 ℃/min，設(shè)定加熱過程以氮氣作為保護氣，氮氣速率為50 mL/min。

1.3.6 抑菌紡絲吸水墊機械分析

抑菌紡絲吸水墊的機械性能利用質(zhì)構(gòu)儀進行分析。按照質(zhì)構(gòu)儀對樣品的要求，剪裁抑菌紡絲吸水墊長×寬為30 mm×5 mm，使用薄膜夾具固定抑菌紡絲吸水墊。設(shè)定觸發(fā)力為5 g，測試速率為5 mm/s，夾具拉伸距離為10 cm。

1.3.7 紡絲吸水墊溶脹率和溶脹損失測定

溶脹率測定采用Mayachiew等[21]的方法。首先將干燥至恒質(zhì)量的樣品剪成相同大小（3 cm×3 cm）并記錄其質(zhì)量m0，稱量之后將樣品置于30 mL的蒸餾水中浸泡24 h，然后用濾紙將樣品表面水分吸干，記錄其質(zhì)量m1。溶脹率（Q1）計算公式如下：

溶脹損失測定采用Khoshgozaran-Abras等[22]的方法。首先將干燥至恒質(zhì)量的樣品剪成相同大小（3 cm×3 cm）并記錄其質(zhì)量m0，稱量之后將樣品放置30 mL的蒸餾水中浸泡24 h，然后將樣品烘干至恒質(zhì)量記錄其質(zhì)量為m2。溶脹損失（Q2）計算公式如下：

1.3.8 水蒸氣透過率測定

參照Allafchian等[23]的方法進行測定并稍作修改。首先測定吸水墊的厚度，并將其剪裁成5 cm×5 cm大小的正方形。然后在10 mL小燒杯中放入1 g氧化鈣，最后用吸水墊將燒杯封口，對其進行稱量。封口后的燒杯置于底部有飽和氯化鉀的干燥器中，每隔24 h進行稱質(zhì)量，持續(xù)7 d。水蒸氣透過率計算公式如下：

式中：WVP為水蒸氣透過率/（g/（m·s·Pa））Δm為膜的增加質(zhì)量/g；x為膜的厚度/mm；A為膜的面積/m2；Δt為時間/s；Δp為膜兩側(cè)的大氣壓差/Pa。

1.3.9 抗氧化能力測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率參照Aydogdu等[24]的方法并稍作修改。首先將一定質(zhì)量的抑菌紡絲吸水墊浸泡在50 mL甲醇溶液中24 h，然后吸取100 μL吸水墊浸泡液與3.9 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合。混合之后避光反應(yīng)2 h，利用紫外-可見分光光度計測量517 nm處反應(yīng)液的吸光度Asample。以甲醇溶液作為空白對照，測其吸光度為Acontrol。自由基清除率計算公式如下：

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率測定參照Fonseca等[25]的方法并稍作修改。將一定質(zhì)量的抑菌紡絲吸水墊浸泡在50 mL甲醇溶液中24 h，備用。配制7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀等體積混合，避光16 h后用甲醇稀釋反應(yīng)液，使得反應(yīng)液在734 nm處的吸光度為0.7。然后吸取100 μL吸水墊浸泡液與2 mL反應(yīng)溶液混合，避光靜置6 min后利用紫外-可見分光光度計測量734 nm處反應(yīng)液的吸光度Asample。以甲醇溶液作為空白對照，測其吸光度為Acontrol。自由基清除率計算公式同上。

1.3.10 細菌生長曲線測定

參照劉世旺等[26]的方法并稍作修改。首先在無菌操作臺上將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種于液體培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基放置在37 ℃的搖床培養(yǎng)箱中活化兩代，活化完成的細菌數(shù)量為107～108CFU/mL，備用。將經(jīng)紫外線滅菌的抑菌紡絲吸水墊裁剪成正方形（5 cm×5 cm）小塊，并將其浸入到20 mL無菌生理鹽水中，37 ℃振蕩24 h使丁香酚充分釋放，得到抑菌紡絲吸水墊提取液。然后將200 μL活化完成的細菌懸液和100 μL抑菌紡絲吸水墊提取液注入到蜂窩微孔板孔中。用bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀測定600 nm處菌液的吸光度。溫度設(shè)置為37 ℃，恒溫培養(yǎng)24 h，每隔30 min測量一次吸光度。對每個樣品分別進行3 次測量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚添加量對紡絲溶液性質(zhì)的影響

從圖2可以觀察到，隨著剪切速率的增加，所有溶液的表觀黏度均下降，表現(xiàn)出剪切稀釋行為。另外，紡絲溶液的表觀黏度隨著丁香酚添加量的增大表現(xiàn)出整體下降的趨勢，但是下降幅度并不大，這可能是由于丁香酚和聚乙烯醇兩者發(fā)生乳化作用導(dǎo)致。

圖2 不同丁香酚添加量溶液的剪切稀釋曲線Fig.2 Viscosity versus shear rate curves of spinning solution with different amounts of added eugenol

由表1可以看出，添加丁香酚紡絲溶液的表面張力值與未添加丁香酚的紡絲溶液相比具有較大差別，但是表面張力并未隨著丁香酚添加量的增多而出現(xiàn)變化。不同溶液的電導(dǎo)率也沒有表現(xiàn)出明顯的差異，電導(dǎo)率在4.8～4.6 mS/cm左右小范圍波動。另外丁香酚的添加對紡絲溶液pH值影響不大。

表1 不同丁香酚添加量溶液的溶液性質(zhì)Table 1 Properties of spinning solution with different amounts of added eugenol

2.2 丁香酚添加量對納米纖維吸水墊形貌的影響

從圖3可以看出，未添加丁香酚的納米纖維呈隨機錯綜分布，纖維形態(tài)均一，纖維直徑主要集中在100～200 nm之間。隨著紡絲溶液里丁香酚添加量的增大，納米纖維形貌中“囊泡”狀結(jié)構(gòu)也隨之逐漸增多，這是因為丁香酚和聚乙烯醇溶液極性相反，靜電紡絲過程中溶劑迅速蒸發(fā)后，會導(dǎo)致纖維中嵌入“囊泡”狀結(jié)構(gòu)。Camerlo等[27]研究以聚乙烯醇為基質(zhì)包埋檸檬烯制備乳液靜電紡絲時也得到了相似的結(jié)論。從圖3還可以看出，丁香酚添加量還會影響納米纖維吸水墊的形態(tài)。丁香酚添加量為5%和20%時，纖維形態(tài)均不理想，紡絲射流并沒有被細化拉伸成形態(tài)均一的納米纖維。

圖3 不同丁香酚添加量納米纖維吸水墊掃描電鏡圖及纖維直徑分布Fig.3 SEM images and fiber diameter distribution of electrospun nanofiber pads with different amounts of added eugenol

2.3 抑菌納米纖維吸水墊紅外光譜分析

從圖4可以觀察到，丁香酚的紅外光譜在3520、3100～2790、1512、1264 cm-1處顯示出特征吸收峰，分別對應(yīng)于官能團是O—H彎曲、C—H伸縮振動、C＝C伸縮振動、C＝O伸縮振動[28]。此外，在含有丁香酚的納米纖維吸水墊中，觀察到丁香酚特征峰如1512 cm-1烯烴特征峰，其吸收強度隨丁香酚添加量的增多而增強，證實了丁香酚被包埋到納米纖維吸水墊中。還有其他一些峰出現(xiàn)減弱或者消失的現(xiàn)象，表明丁香酚與聚乙烯醇溶液之間存在分子間或者分子內(nèi)的相互作用。

圖4 不同丁香酚添加量納米纖維吸水墊的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of nanofiber pads with different eugenol contents

2.4 抑菌納米纖維吸水墊熱重分析

采用熱重分析可以表征納米纖維吸水墊的熱穩(wěn)定性[29]，同時由于丁香酚的加入，其熱重曲線會表現(xiàn)出一定程度上的差異，故也可通過熱重曲線表征丁香酚包合物的形成。熱重曲線上每一個臺階代表物質(zhì)的分解。從圖5可以看出，丁香酚熱穩(wěn)定性較差，僅發(fā)生一次降解，在導(dǎo)數(shù)曲線中可以直觀看到其最大降解速率對應(yīng)的溫度在180 ℃左右，在200 ℃時完全分解。納米纖維樣品均發(fā)生3 次降解。第1次是水分子的蒸發(fā)，第2次對應(yīng)大分子側(cè)鏈的降解，第3次是聚合物主鏈分解，樣品主要降解發(fā)生在第2階段[30]。不同添加量丁香酚納米纖維的降解曲線大致相同，雖然加入丁香酚會降低納米纖維的熱穩(wěn)定性，但其影響并不大。

圖5 不同丁香酚添加量納米纖維吸水墊失重曲線（a）和失重微分曲線（b）Fig.5 TGA curves (a) and DTG curves (b) of nanofiber pads with different eugenol contents

2.5 抑菌納米纖維吸水墊機械性能分析

從圖6a可以看出，所有納米纖維吸水墊的應(yīng)力應(yīng)變曲線呈現(xiàn)微彎的曲線。納米纖維吸水墊的斷裂伸長率隨丁香酚的增加而下降（P＜0.05）（圖6b）。如圖6c所示，加入5%和20%丁香酚均會導(dǎo)致納米纖維吸水墊抗拉伸強度顯著下降（P＜0.05）。加入10%和15%丁香酚會使納米纖維吸水墊抗拉伸強度稍有上升。這可能是因為抑菌納米纖維吸水墊的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及丁香酚與聚乙烯醇相互作用造成[31]。另外丁香酚的反增塑作用也可能影響抑菌納米纖維吸水墊的機械性能。這一結(jié)果也同掃描電鏡結(jié)果相呼應(yīng)，說明丁香酚對納米纖維吸水墊的機械性能有較大影響。

圖6 不同丁香酚添加量納米纖維吸水墊的機械性能Fig.6 Mechanical properties of nanofiber pads with different eugenol contents

2.6 抑菌納米纖維吸水墊溶脹率、溶脹損失和水蒸氣透過率分析

從表2可以看出，隨著丁香酚添加量的增加，納米纖維吸水墊的溶脹率逐漸降低（P＜0.05），當丁香酚添加量為10%和15%時，二者納米纖維吸水墊的溶脹率并無顯著差異。雖然丁香酚添加量較低時對納米纖維吸水墊的溶脹損失影響不大，但是當丁香酚添加量增加到20%時，溶脹墊的溶脹損失會顯著上升（P＜0.05），高于其他樣品。這可能和納米纖維吸水墊的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，當丁香酚添加量為20%時，納米纖維吸水墊的微觀結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞。納米纖維吸水墊的水蒸氣透過率和丁香酚添加量有關(guān)，當丁香酚添加量增加時，納米纖維吸水墊的水蒸氣透過率會顯著下降（P＜0.05）。

表2 不同丁香酚添加量納米纖維吸水墊的溶脹率、溶脹損失和水蒸氣透過率Table 2 Swelling ratio,water solubility and water vapor permeability of nanofiber pads

2.7 抑菌納米纖維吸水墊抗氧化能力分析

通過DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除實驗測定含丁香酚納米纖維吸水墊的體外抗氧化能力，以研究丁香酚被包埋到納米纖維吸水墊抗氧化活性變化情況。如圖7所示，包埋丁香酚的納米纖維吸水墊具有自由基清除活性，可以將穩(wěn)定的紫色DPPH自由基溶液還原成黃色，也可以將藍綠色的ABTS陽離子自由基溶液還原為無色。如預(yù)期的那樣，丁香酚添加量對自由基清除活性有直接關(guān)系，抑菌納米纖維吸水墊對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的抗氧化活性均隨著丁香酚添加量的增加而增加。當丁香酚添加量為20%時對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力最強，清除率分別為83%和78%。對于未包埋的納米纖維吸水墊也進行了抗氧化能力實驗，但其未顯示出自由基清除活性。

圖7 不同丁香酚添加量納米纖維吸水墊的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率Fig.7 DPPH radical and ABTS radical cation scavenging activity of nanofiber pads loaded with different amounts of eugenol

2.8 抑菌納米纖維吸水墊的抑菌能力分析

從圖8可以看出，對照組細菌生長最快，吸光度最高。隨著丁香酚添加量的增加，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用隨之加強。丁香酚添加量越高，細菌生長曲線的吸光度越低，相應(yīng)的抑制率越高。從抑制率曲線可以看出，抑制率并不是持續(xù)增加的趨勢，其隨著細菌生長周期不斷變化。剛開始時由于細菌數(shù)量少，因此丁香酚抑制率急劇上升。隨后隨著細菌快速繁殖，抑制率開始下降，然后由于丁香酚的釋放量不斷增加，抑制率再次增加。最后，丁香酚的釋放低于細菌的繁殖率，導(dǎo)致抑制率降低并達到其最小值。

圖8 大腸桿菌（a、b）和金黃色葡萄球菌（c、d）的生長曲線和抑菌率曲線Fig.8 Growth and inhibition curves of E.coli (a,b) and S.aureus (c,d)after exposure to nanofibers with eugenol

3 結(jié)論

基于靜電紡絲技術(shù)包埋丁香酚制備了一種兼具高吸水性和抑菌性的吸水襯墊，研究丁香酚添加量對吸水襯墊材料特性和功能特性的影響。從掃描電鏡圖可以看出丁香酚添加量為15%時，納米纖維形貌較好。雖然丁香酚添加量增加，吸水襯墊的溶脹率隨之下降，但是當丁香酚添加量為15%時，吸水襯墊的溶脹率仍在400%以上，說明納米纖維吸水墊仍具備較強的吸水能力。與此同時，丁香酚添加量為15%時吸水襯墊的抗拉神強度最高。抗氧化和抑菌實驗表明，隨著丁香酚添加量增加，納米纖維吸水墊的抗氧化能力和抑菌能力均隨之增強。綜合以上實驗數(shù)據(jù)，丁香酚添加量為15%時納米纖維吸水襯墊功能性質(zhì)最佳。因此，利用靜電紡絲技術(shù)包埋丁香酚制備的抑菌吸水墊具有較好的吸水能力和抑菌效果，本實驗為冷卻肉貯藏保鮮提供參考。