乳清分離蛋白纖維和典型抗氧化劑對羅伊氏乳桿菌TMW 1.656在常溫貯藏脅迫下存活的影響

郭前婉，王 琪，嚴文莉，張運艷，康 旭，趙 萌,

（1.湖北工業大學 發酵工程教育部重點實驗室，國家“111”細胞調控與分子藥物學中心，湖北 武漢 430068；2.上海良友（集團）有限公司技術中心，上海 200333）

益生菌是一種可以為人類宿主健康帶來有益影響的功能性產品，如免疫調節、降低良性腫瘤和惡性腫瘤的風險、治療胃部不適、對抗致病菌和減輕高血壓等[1]。益生菌的干態化可以有效延長保質期，降低低溫貯存的成本，還可以方便食品應用。噴霧干燥可以通過將液體產品霧化在熱氣體中，使其瞬間形成粉末，與冷凍干燥相比，具有成本低、生產率高、連續性好、加工速度快等優點，是最常用的益生菌干燥技術之一[2]。但噴霧干燥過程中施加的高溫、滲透脅迫、脫水和氧暴露等不良因素，會造成益生菌的膜成分、胞內蛋白質、核糖體、DNA和RNA的損傷，進一步加速益生菌死亡[2]。然而，聯合國糧農組織及世界衛生組織指出，食用時活菌數必須達到一定數值，最終才能在胃腸道中發揮重要作用[3]。因此，需要探索適合益生菌噴霧干燥的壁材組分，以改善益生菌噴霧干燥存活。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）主要由β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白組成，因其成本低、營養價值高而被廣泛應用于食品行業[4]，且被證實可以有效保護益生菌[5-6]。乳清分離蛋白纖維（whey protein isolate fibrils，WPIF）是WPI在酸性、高溫以及低離子強度下長時間加熱自組裝形成的一種新型納米材料[7]，具有較多獨特特性，如高長徑比、高抗氧化性和高疏水性[8-9]。WPIF已被廣泛報道具有較高的抗氧化性[10]，如Mohammadian等[11]發現與WPI相比，WPIF的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力提高3.3 倍；Zhao Yiguo等[12]發現0.5% WPIF 2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除活性可達到80%。目前，關于WPIF抗氧化性的應用已被廣泛研究，如在涂膜實驗中可有效抑制蘋果褐變[13]、在油脂荷載實驗中可有效降低油脂氧化[14]以及提高D-檸檬烯的抗氧化性[15]等。因WPIF具有較高的抗氧化性，設想WPIF會有利于益生菌的抗氧化脅迫存活，而目前還未有研究將WPIF應用到益生菌保護中。

抗氧化劑是一種能夠延遲或防止底物由于氧化而發生風味惡化的物質[16]，在益生菌基質中添加抗氧化劑可以有效降低益生菌的死亡率。表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是典型的多酚類抗氧化劑，有文獻報道其可以有效改善益生菌貯藏存活[17-19]，也有研究發現EGCG在貯藏期間對益生菌存活影響不大[20]。還有研究指出EGCG具有抑菌性以及廣泛的抑菌譜[21-22]，其氧化產物可與核酸結合，會對細胞造成傷害[23]。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種內源性抗氧化劑，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成[24]，目前沒有關于GSH對益生菌的影響研究，只有相關報道發現L-半胱氨酸的保護作用具有菌株特異性[25]。因而，有必要進一步核實典型抗氧化劑EGCG和GSH在益生菌噴霧干燥和常溫貯藏中是施加保護效果還是抑菌效果。本實驗對WPIF的制備條件進行優化，通過噴霧干燥的方法制備益生菌粉，并比較不同壁材中羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）TMW 1.656在常溫貯藏的存活情況，以探究新型納米材料WPIF和抗氧化劑EGCG/GSH質量濃度對菌體的存活影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI 美國Davisco Foods International有限公司；羅伊氏乳桿菌TMW 1.656 加拿大阿爾伯塔大學食品微生物實驗室；EGCG 上海源葉生物科技有限公司；GSH上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

小型噴霧干燥機 鄭州宏朗儀器設備有限公司；JSM-6390lv低真空掃描電鏡、JEM-1400Plus透射電鏡 日本電子株式會社；AIRTECH超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；Direct Q3型超純水機美國Merck Millipore公司；F-7000熒光分光光度計日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 WPIF的制備優化

WPIF按照Hu Jing等[26]的方法制備并作了一些修改。通過將WPI粉末溶解在無菌水中，并在25 ℃攪拌2 h制備30 g/L WPI溶液，用6.0 mol/L鹽酸調節到pH 2，并在75、80、85、90、95 ℃加熱10 h，得到WPIF溶液在冰水混合物中冷卻20 min，研究溫度對WPIF的影響；在確定溫度的基礎上，其余條件不變，研究pH值（1.6、1.8、2.0、2.5、3.0）對WPIF形成的影響；在確定溫度和pH值的基礎上，其余條件不變，研究WPI質量濃度（10、20、30、40、50 g/L）對WPIF形成的影響。

1.3.2 WPIF的表征

1.3.2.1 透射電鏡觀察

按照Hu Jing等[26]方法使用透射電鏡觀察WPIF樣品的微觀結構。將10 μL 0.3 g/L的蛋白質溶液移到銅網上干燥，觀察前用磷鎢酸（15 g/L，將磷鎢酸粉末溶解在超純水中，并在水浴中以100%的功率超聲處理30 min，0.22 μm水系濾頭過濾）染色3 min，再用濾紙吸走多余的染料。

1.3.2.2 硫磺素-T（thioflavin T，ThT）熒光強度的測定

按照Mohammadian等[11]ThT熒光強度法檢測WPIF的形成。在3 mL蛋白質溶液中加入20 μL ThT溶液（12 g/L，將ThT粉末溶解在超純水中并用0.22 μm水系濾頭過濾），并在黑暗中于25 ℃放置1 min，然后在熒光分光光度計上測定。激發和發射波長分別為450 nm和482 nm。

1.3.3 菌種培養及菌樣制備

菌種培養按照Huang Xue等[27]的方法。將羅伊氏乳桿菌TMW 1.656以2%的接種量接種于改良mMRS液體培養基中，37 ℃培養24 h；然后以4.0%接種量轉入新的mMRS液體培養基，并在37 ℃培養24 h；將培養液10000×g離心10 min，用蛋白胨鹽溶液（peptone saline，PS，1.0 g/L蛋白胨，8.5 g/L NaCl，pH 6.8）洗滌2 次，并重新懸浮在5.0 mL PS溶液中，制備得到約109CFU/mL的菌懸液。

1.3.4 EGCG和GSH的抗菌性評價

將EGCG和GSH粉末溶于30 mL PS溶液中，制備5.0 g/L的EGCG/GSH溶液，并在25 ℃攪拌10 min。然后，加入0.6 mL 9（lg（CFU/mL））的菌懸液，在300 r/min下攪拌10 min。最后將混合溶液在37 ℃培養1～6 h，同時將在PS中培養相同時間的菌懸液作為對照。通過10 倍的連續稀釋，涂布在mMRS固體培養基上，并在37 ℃倒置培養48 h，對混合溶液中的活細胞進行計數，其細胞失活量表示為ΔNanti，并按式（1）計算：

式中：N1為培養前活細胞的初始數量；N2為在EGCG/GSH中培養后的活細胞數量；N3為在PS中培養相同時間的活細胞數量。

1.3.5 噴霧干燥菌粉的制備

6 組益生菌粉（WPI、WPIF、WPI+0.5 mg/mL EGCG、WPI+5.0 mg/mL EGCG、WPI+0.5 mg/mL GSH和WPI+5.0 mg/mL GSH）的制備方法如下：首先，配制WPI溶液，即將WPI粉末溶解在無菌水中并在25 ℃攪拌2 h，其終質量濃度為30 g/L；接著，配制WPIF溶液，即將30 g/L的WPI溶液，用6.0 mol/L鹽酸將溶液調pH 2.0，并在80 ℃加熱10 h，最后，取出樣品并立即在冰水中冷卻20 min制備得到。取50 mL制備好的WPI或WPIF溶液，用1.0 mol/L或6.0 mol/L的NaOH溶液調節到pH 6.8，再加入1 mL細胞懸液和1.0 g蔗糖，制備WPI或WPIF的益生菌混合溶液。在WPI或WPIF的益生菌混合溶液中，添加至最終質量濃度為0.5 mg/mL和5.0 mg/mL的EGCG或GSH，300 r/min攪拌10 min，制備含抗氧化劑EGCG和GSH的益生菌混合溶液。將各菌體混合溶液進行噴霧干燥，進口溫度120 ℃，出口溫度80 ℃。

1.3.6 噴霧干燥菌粉的形態觀測

使用掃描電鏡對噴霧干燥益生菌粉末進行成像[27]。在成像之前，將樣品粘在膠布上并鍍金。所有樣品的放大倍數為2000 倍，加速電壓為10 kV。

1.3.7 噴霧干燥菌粉的失活計算

菌體失活按照Zhao Meng等[28]的報道進行測定。將10 mg的新鮮噴霧干燥益生菌粉末加入990 mg PS溶液中，然后在37 ℃孵育10 min，并渦旋30 s進行分散。通過10 倍的連續稀釋，在mMRS固體培養基上涂布，并在37 ℃倒置培養48 h。貯藏實驗是將噴霧干燥菌粉在30 ℃和相對濕度33%條件下貯存，在固定的時間間隔內對樣品進行細胞計數。菌體失活情況以ΔNs表示，并按式（2）計算：

式中：N0為菌懸液的活細胞數；Nt為貯存td后噴霧干燥菌粉的活細胞數。

1.3.8 高溫處理后WPIF的微觀結構觀察

首先，制備得到WPIF溶液，并將pH值調至6.8左右備用。再將pH 6.8的WPIF溶液放置進入100 ℃水浴鍋中加熱1 min，稀釋后取10 μL溶液到銅網上。最后進行透射電鏡觀察。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 23.0軟件和Excel 2019進行統計分析。通過獨立樣本T檢驗確定抗氧化劑的抗菌性評價；單因素方差分析確定噴霧干燥以及常溫貯存期間益生菌失活的差異顯著性（P＜0.05，差異顯著）。使用簡單線性回歸分析菌體貯藏期間失活情況和貯藏時間之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 WPIF的制備優化

溫度會影響穩定蛋白質結構力的平衡，如內部氫鍵、范德華相互作用和疏水相互作用等，從而使得蛋白質發生熱變性[29]。由圖1可知，當溫度達到85 ℃以后，蛋白溶液呈現出輕微的黃色，這可能是原材料WPI中含有少量的糖類，在高溫長時間加熱的條件下，發生了焦糖化反應。在75～95 ℃條件下加熱都可以形成長而纖細的纖維，且形態上沒有差異（圖2A）。由圖3A可知，隨著溫度的升高，其ThT熒光強度呈現先上升后降低的趨勢，在80 ℃達到頂峰。與之類似，也有研究發現在高溫下長時間加熱會進一步導致纖維的破壞，如pH 2、1%的β-乳球蛋白在110 ℃加熱5 h和120 ℃加熱3.3 h后熒光強度都顯著降低[30]。因此，選取80 ℃為最優條件進行后續實驗。

圖1 WPI溶液在75～95 ℃加熱10 h的宏觀圖片Fig.1 Macrophotographs of WPI solutions heated at 75–95 ℃ for 10 h

圖2 WPIF的透射電鏡圖片Fig.2 TEM micrographs of WPIF

圖3 WPIF的ThT熒光強度Fig.3 ThT fluorescence intensity of WPIF

pH值在蛋白纖維化過程中會影響肽鍵的斷裂和靜電相互作用的調節[31]。有研究發現β-乳球蛋白在pH 1.6～3.0形成的纖維較長，而在pH 3.5時形成的纖維較短[14]。由圖2B可以觀察到，在本實驗中pH 1.6～1.8的纖維呈現出彎曲狀，pH 2.0～3.0的纖維直而纖細。由圖3B可知，隨著pH值的升高，其ThT熒光強度呈現先上升后降低的趨勢，在pH 2.0達到頂峰。因此，選擇pH 2.0為最優條件進行下一步實驗。

蛋白質量濃度也能影響原纖維的形態，有研究發現在80 ℃、pH 2.0條件下加熱β-乳球蛋白16 h，添加量為3%時可形成長半柔性纖維，而7.5%時形成的是短蠕蟲狀纖維[32]。此外，為了確保纖維的形成，蛋白質量濃度需要達到臨界纖維化濃度[33]，因此，本研究對30～50 g/L的蛋白質量濃度進行優化。30～50 g/L的WPI都能夠形成纖維（圖2C），且隨著質量濃度的升高，熒光強度逐漸增大（圖3C）。然而質量濃度越高，蛋白溶液越稠，考慮到其實際應用，選擇質量濃度30 g/L進行后續實驗。因此，后續制備益生菌噴干菌粉的實驗中選取pH 2.0、30 g/L的WPI在80 ℃加熱10 h制備WPIF。

2.2 EGCG和GSH的抑菌性

有文獻報道有些抗氧化劑具有抑菌性，如多酚類[22,34]，且在本實驗中抗氧化劑和細胞在制備和貯存期間會直接接觸，因此，在進行包埋實驗前評估EGCG和GSH對羅伊氏乳桿菌的抗菌活性。研究發現，羅伊氏乳桿菌TMW 1.656和EGCG/GSH在37 ℃共培養1 h后，活細胞數量沒有明顯變化，如含EGCG的細胞懸液僅失活0.06±0.02，而含GSH的細胞懸液失活數量為負值（表1），這是因為使用的平板技術法存在一定的誤差。因此，這也表明在微囊的制備過程中，抗氧化劑不會對細胞造成額外的損害。然而，在共培養6 h后，添加EGCG和GSH的混合液中菌體失活值分別為0.70±0.02和2.73±0.10，這表明細胞與EGCG/GSH長時間的接觸顯著加速了細胞的死亡，并且GSH的抑菌性顯著大于EGCG。

表1 羅伊氏乳桿菌TMW 1.656與EGCG/GSH共培養后益生菌的失活情況Table 1 Inactivation of L.reuteri TMW 1.656 after incubation in EGCG or GSH solution

2.3 噴霧干燥菌粉的表觀形態

如圖4所示，噴霧干燥形成的都是微米級球狀體，且大小大多分布在10～20 μm。噴霧干燥菌粉的球體表面光滑，但有一定程度的凹陷，這可能是由于噴霧干燥的高溫使微囊內部水分快速蒸發造成的。與之類似，Zhao Meng等[35]利用噴霧干燥制備的A型明膠/阿拉伯膠/蔗糖益生菌微囊的形態也是光滑且有一些空洞，大小在3～20 μm左右。

圖4 WPI、WPIF以及添加 EGCG/GSH噴霧干燥菌粉的掃描電鏡照片Fig.4 SEM photographs of spray dried probiotic powders with WPI,WPIF or WPI+EGCG/GSH

2.4 噴霧干燥菌粉的失活量和貯藏失活量

由表2可知，噴霧干燥造成菌體部分死亡，WPI和WPIF組中菌體失活量分別為0.25±0.22和0.14±0.13，兩種壁材包埋的菌體噴霧干燥死亡數量沒有顯著差異。且噴霧干燥菌粉在常溫貯藏28 d之后，WPI和WPIF組中菌體失活量均在1.40左右，這表明噴霧干燥菌粉在常溫貯藏過程中，WPI與WPIF保護效果相似，也就是說WPIF并沒有為噴霧干燥菌粉提供額外的保護。

表2 噴霧干燥以及常溫貯藏（30 ℃、相對濕度33%）后益生菌的失活情況Table 2 Probiotic inactivation after spray drying and during ambient storage at 30 ℃ and relative humidity of 33%

為了說明抗氧化劑質量濃度在噴霧干燥和常溫貯存期間對細胞活力的影響，在WPI基質中分別加入0.5 mg/mL和5.0 mg/mL的EGCG/GSH。與含0.5 mg/mL抗氧化劑相比，含5.0 mg/mL抗氧化劑的菌體失活量更高；如在貯藏28 d后，WPI+0.5 mg/mL EGCG組菌體失活量為1.59±0.02，而WPI+5.0 mg/mL EGCG組菌體失活量為3.02±0.19。且與含EGCG（WPI+0.5 mg/mL EGCG，WPI+5.0 mg/mL EGCG）相比，含GSH組（WPI+0.5 mg/mL GSH，WPI+5.0 mg/mL GSH）的菌體失活量明顯更高。總之，益生菌的貯藏穩定性遵循WPIF≈WPI＞WPI+0.5 mg/mL EGCG＞WPI+0.5 mg/mL GSH＞WPI+5.0 mg/mL EGCG＞WPI+5.0 mg/mL GSH的順序，并表明EGCG和GSH的存在不利于的益生菌存活，GSH對菌體的傷害比EGCG更大，且具有濃度依耐性，即抗氧化劑濃度越高，對菌體傷害越大。

為了進一步比較抗氧化劑種類以及質量濃度對噴霧干燥菌粉中菌體的存活影響，本研究對其貯藏存活進行擬合，計算不同種類和質量濃度抗氧化劑基質中菌體的貯藏失活常數，即菌體死亡速率的大小。如表3所示，噴霧干燥菌粉在常溫貯藏的失活常數順序為kWPI+5.0mg/mLGSH＞kWPI+5.0mg/mLEGCG＞kWPI+0.5mg/mLGSH＞kWPIF≈kWPI≈kWPI+0.5mg/mLEGCG，表明在貯藏過程中，抗氧化劑GSH比EGCG對菌體的傷害更大，且抗氧化劑質量濃度越高，菌體死亡的速度越快。

表3 噴霧干燥菌粉的菌體失活常數Table 3 Inactivation constants of spray-dried probiotic powders

有研究表明EGCG可以改善菌體存活，也可能對菌體沒有影響[20,36-37]，這可能是由不同貯存條件或菌種差異造成。如在4 ℃的蘋果汁中貯存30 d后，WPI-EGCG共軛物保護的益生菌存活率顯著提高[36]；在4 ℃的5%無菌氯化鈉溶液中貯存30 d后，含10%綠茶提取物的由殼聚糖包裹的海藻酸鹽微膠囊只略微提高了益生菌存活率[37]；而含有10 g/L EGCG的噴霧干燥海藻酸鹽微膠囊在4 ℃貯存12 d后并沒有改善菌體存活[20]。EGCG會抑制微生物生長[22,34]，且其自氧化產物還會對細胞造成損害[38-39]，而本研究貯藏實驗在30 ℃、相對濕度33%條件下進行，在惡劣環境下可能會進一步加速EGCG的氧化，并誘發更多的細胞失活，這可能是EGCG在常溫貯藏期間加速益生菌死亡的原因。

目前還鮮有關于GSH對益生菌存活影響的研究。只有報道在相對濕度32%、22 ℃貯藏90 d后發現，添加L-半胱氨酸的噴霧干燥乳清濃縮蛋白菌粉中嗜乳酸桿菌Ki存活率提高，副干酪乳桿菌L26存活率沒有變化，動物雙歧桿菌B-12存活率降低[25]。在本研究中，常溫貯藏中含GSH的基質中益生菌失活量最高，與益生菌在GSH溶液中培養6 h后的失活量最高一致（表1），這也進一步表明長時間與抗氧化劑接觸對細胞有害。

2.5 高溫對WPIF的影響機制

為了解釋WPIF沒有改善噴霧干燥菌體存活的原因，利用透射電鏡觀察了WPIF在噴霧干燥后的變化，將pH 6.8的WPI和WPIF溶液經過短時間高溫加熱處理（100 ℃、1 min）進行觀察。pH 6.8的WPI溶液呈現透明狀，而在100 ℃加熱1 min之后，溶液變成乳白色（圖5A）；pH 6.8的WPIF溶液未加熱之前呈現乳白色，并且能觀察到纖維狀物質，而加熱之后WPIF溶液中纖維狀消失，形成了大量的聚集物（圖5B），這說明WPIF溶液在中性條件下短時間的高溫加熱會使纖維結構消失和聚集。類似的，有研究發現在4%、pH 2條件下制備纖維，將pH值調至6.8后在90 ℃加熱20 min，其纖維結構消失，只能觀察到聚集物[40]。而在制備菌粉時，噴霧干燥溫度較高，WPIF溶液極有可能是在高溫條件下發生了聚集，其纖維結構消失，因此其對益生菌的保護效果與WPI相差不大。

圖5 WPI（A）和WPIF（B）溶液經高溫處理后的宏觀、微觀圖Fig.5 Macroscopic,microscopic images of WPI (A) and WPIF (B)solutions after high temperature treatment

3 結論

探索了新型納米材料WPIF以及典型抗氧化劑濃度對噴霧干燥微囊中益生菌存活的影響，益生菌存活實驗表明，在噴霧干燥菌粉中，WPI與WPIF兩種基質包埋菌體其存活率沒有顯著差別，這可能是因為高溫造成蛋白纖維的聚集和分解，使得WPIF沒有發揮其優越性能。為了避免高溫對WPIF的結構和特性的破壞，在后續研究中，將考慮嘗試在低溫條件下利用WPIF的抗氧化特性進行益生菌保護，如濕態體系、冷干和真空干燥等低溫方式制備菌粉。添加EGCG/GSH都加速了噴霧干燥菌粉在常溫貯藏期間的死亡，這與添加抗氧化劑可以有效保護益生菌免受氧化應激的“常識”相反。且抗氧化劑對菌體的傷害具有濃度依耐性，質量濃度越高，菌體死亡數量越多。EGCG和GSH加速益生菌的死亡可能與它們的抗菌作用和自動氧化產物的毒性有關。如何利用抗氧化劑保護益生菌免受氧化應激的影響而不損害益生菌仍然是未來的一個重要研究方向。