毛亞玲,李俊娥,于 靜,楊 柳,祝 霞,2,楊學山,2,
(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)
蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation,MLF)主要是在酒酒球菌(Oenococcus oeni)的主導下,將葡萄酒中的L-蘋果酸轉化為L-乳酸和CO2,可在降低酒體酸度、提高生物穩定性的同時賦予其獨特風味和口感[1-2]。分離鑒定自葡萄酒原產地的本土O.oeni由于適應了產區的特定風土條件,更能夠將釀酒葡萄的品質特征在發酵過程中充分表達,是釀造具有產區風格和典型性葡萄酒的有效方式[3]。然而,采用傳統釀造工藝進行順序接種MLF時,由于乙醇發酵(alcohol fermentation,AF)后的酒體乙醇體積分數較高、菌體可攝入的營養物質減少,O.oeni較難適應發酵環境,常常導致MLF遲滯甚至失敗[4-5]。此外,游離SO2含量的降低使酒體抑菌效果減弱,較長時間的發酵進程增加了腐敗微生物污染的風險[6]。將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和O.oeni同時接種到葡萄汁中進行共發酵,在克服以上問題的同時還能減少總發酵時長,提升葡萄酒的生產效率[7]。Antalick等[8]研究發現,同時接種可以增加美樂葡萄酒酯類物質的含量。Jussier[9]、Massera[10]、Tristezza[11]等分別對霞多麗、馬爾貝克、黑曼羅葡萄進行共發酵,發現同時接種不會抑制AF的進行,還會使葡萄酒果香氣味更加濃郁。李俊娥等[12]研究表明,與傳統順序MLF相比,共發酵不僅縮短了發酵時長,而且揮發性化合物種類多,含量高,可賦予葡萄酒濃郁的花果香。趙現華等[13]研究表明,共發酵可以增加葡萄酒乳酸、脂肪酸和萜烯類等物質含量,豐富葡萄酒的風味結構,提高葡萄酒感官品質。
在共接種釀造過程中,由于S.cerevisiae和O.oeni之間可能存在拮抗作用,影響葡萄酒品質或導致發酵遲滯[14]。通過建立數學模型定量描述發酵動力學過程,可合理預測或控制微生物代謝活動,有助于更詳細地了解發酵過程中重要參數的動態變化,降低失敗的風險,被認為是本土菌株大規模生產應用前不可或缺的步驟[15-16]。研究者對沙棘酒[17]、山葡萄酒[18]、仙人掌果酒[19]、瑪咖芒果復合酒[20]、蓮霧果酒[21]等發酵過程中的S.cerevisiae數量、還原糖含量和乙醇體積分數變化分別建立動力學模型,結果表明Logistic、Boltzmann、SGompertz和DoseResp模型測定值和預測值之間均具有較好的擬合度,可以用來描述果酒發酵過程中S.cerevisiae菌株生長、底物消耗和產物生成變化的規律,對合理控制發酵過程及產品品質調控具有重大意義[22]。然而,針對S.cerevisiae和O.oeni共接種發酵過程中的動力學特征研究還十分欠缺。
本研究選取2 株篩選自甘肅河西走廊葡萄酒產區的本土O.oeniZX-1和MG-1菌株,分別與S.cerevisiaeVW和AW進行共接種發酵,以未進行MLF為對照,采用經典的Logistic、Boltzmann、SGompertz和DoseResp模型,對共發酵過程中S.cerevisiae生物量、乙醇體積分數、還原糖含量、O.oeni生物量及L-蘋果酸含量的變化規律進行非線性擬合,建立S.cerevisiae和O.oeni共發酵動力學模型,旨在為工業化生產最優工藝控制和促進本土菌株的產業化應用提供理論基礎和技術支撐。
ZX-1、MG-1分離自河西走廊葡萄酒產區自然啟動MLF葡萄酒,由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室鑒定,-80 ℃甘油管保存。其中ZX-1菌株在釀造過程中可以分泌較高的糖苷酶,有效提升葡萄酒的品種香氣特征;MG-1菌株具有良好的發酵耐受性,具備商業化應用的潛力[23]。VW、AW均為商業活性酵母干粉,購自意大利Enartis公司。
L-蘋果酸檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司;放線菌酮、氯霉素、果糖、纖維二糖、肌醇、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺、泛酸鈣、對氨基苯甲酸、L-蘋果酸、鉬酸鈉 上海源葉生物科技有限公司;葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、鹽酸半胱氨酸、酒石酸氫鉀、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、檸檬酸、磷酸氫二銨、磷酸氫二鉀、氯化錳、氯化鋅、硼酸、瓊脂、偏重亞硫酸鈉 天津市光復精細化工研究所。
AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;LDZX立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;PHS-3C精密pH計 上海雷磁責任有限公司;HWS恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;SPX-150-II生化培養箱 上海躍進醫療器械有限公司;UV-6100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。
1.3.1 培養基的配制
本土O.oeni擴大培養采用酸性番茄培養基(acid tomato juice,ATB)[23]:葡萄糖10 g/L,酵母浸粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,鹽酸半胱氨酸0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,番茄汁25%(V/V);固體培養基添加瓊脂20 g/L、放線菌酮50 mg/L。使用1 mol/L NaOH溶液分別將液體培養基和固體培養基pH值調至4.8和5.0,121 ℃滅菌20 min。
S.cerevisiae計數培養采用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(yeast extract peptone dextrose,YPD)[24]:葡萄糖2 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母浸粉1 g/L、瓊脂20 g/L,添加10 mg/L氯霉素,121 ℃滅菌20 min。
1.3.2 模擬汁體系
模擬葡萄汁配制參考馬騰臻[25]的方法。將微量元素配制成質量濃度為g/L數量級的母液,稀釋1000 倍備用。模擬汁添加40 mg/L SO2(偏重亞硫酸鈉計),使用NaOH調節pH 3.5。
1.3.3 菌株活化及模擬汁發酵
S.cerevisiae活化:分別稱取適量VW、AW菌株干粉溶于10 倍體積的無菌水中,37 ℃恒溫水浴20 min后,再添加10 倍體積的模擬汁,28 ℃恒溫水浴10 min。
O.oeni活化:取-80 ℃甘油管保藏的本土O.oeni菌株ZX-1和MG-1,于ATB斜面培養基劃線,28℃培養5~7 d后,挑取兩環于滅菌后的ATB液體培養基中,于28 ℃生化培養箱中培養至對數期,備用。
接種量:S.cerevisiae和O.oeni的接種量均為1×106CFU/mL。20 ℃條件下進行發酵,還原糖低于4 g/L且L-蘋果酸低于0.2 g/L時,結束發酵。實驗設置3 個平行,結果取其平均值。
1.3.4 菌株接種方案
模擬汁AF(接種時間24 h)菌株接種方案如表1所示。

表1 不同菌株組合Table 1 Co-inoculations of O.oeni with S.cerevisiae
1.3.5 指標檢測
1.3.5.1 菌株生物量測定
參照楊婷[26]的方法,分別采用YPD和ATB固體培養基對發酵過程中S.cerevisiae和O.oeni進行涂布計數。每隔24 h取發酵液1 mL于9 mL 0.85%生理鹽水中,混勻后稀釋至適當倍數,準確吸取0.1 mL稀釋菌懸液分別涂布于添加10 mg/L氯霉素(用于抑制細菌生長)的YPD固體培養基、添加50 mg/L放線菌酮(用于抑制酵母生長)的ATB固體培養基。酵母菌28 ℃培養48 h后觀察其菌落形成情況并計數,O.oeni28 ℃培養5~7 d后觀察其形態并計數。菌落總數以菌落形成單位(CFU/mL)表示。
1.3.5.2 還原糖含量和乙醇體積分數測定
參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》,采用斐林試劑和酒精計法測定發酵過程中還原糖含量和乙醇體積分數。
1.3.5.3L-蘋果酸含量測定
參照試劑盒推薦說明進行操作,測定發酵酒樣中L-蘋果酸含量。
采用Origin 2019軟件對數據進行統計與作圖分析,選取合適的動力學模型對共發酵過程中S.cerevisiae生物量、還原糖含量、乙醇體積分數、O.oeni生物量和L-蘋果酸含量變化情況進行非線性擬合,并選取擬合效果最佳的動力學模型對發酵過程中微生物代謝活動進行定量分析描述。
由圖1可知,與未MLF組E、F相比,共發酵過程中A、B、C和D處理組S.cerevisiae活菌數均有所降低,這可能是由于共接種模式下S.cerevisiae與本土O.oeni競爭性利用發酵環境中的營養物質,如碳源、氮源及其他微量元素等所致。在共發酵初期,發酵液中的S.cerevisiae細胞數較少,與VW相比,AW能較快適應發酵環境,活菌數略高,后期VW生長速率較AW快,但由于發酵液中營養物質的消耗致使VW更早進入衰亡期,且衰亡速度更快。2 株S.cerevisiae均經過1 d對發酵環境適應后即可快速生長,迅速進入對數生長期,發酵過程中不同處理組S.cerevisiaeVW和AW活菌數分別于4 d和5 d達到最大值,且無明顯差異(A組:2.63×106CFU/mL;B組:2.60×106CFU/mL;C組:2.46×106CFU/mL;D組:2.40×106CFU/mL)。在發酵過程中,還原糖為S.cerevisiae生長提供其所需的能量,發酵體系中還原糖含量的變化趨勢反映S.cerevisiae發酵能力的強弱[27]。隨著S.cerevisiae細胞的增長,還原糖含量呈下降趨勢,A和B處理組在2~5 d下降幅度最大,C和D處理組在3~7 d下降幅度最大,分別與S.cerevisiaeVW和AW生長量一致。A、B組和C、D組分別于8 d和10 d完成AF,還原糖含量分別為2.59、2.87、3.12、3.26 g/L,均低于對照組,說明早期階段接入本土O.oeni未抑制AF的進行。乙醇為S.cerevisiae在發酵過程中轉化糖類代謝而生成的產物[28],乙醇體積分數隨發酵的進行逐漸升高,其中A和B處理組于發酵5 d后增幅較緩,在8 d達到最高,C和D處理組于發酵7 d后增幅變緩,在10 d達到最高,A、B、C和D處理組間乙醇體積分數無明顯差異,分別為11.70%、11.60%、11.60%和11.40%。乙醇的生成幾乎與還原糖的消耗和S.cerevisiae的生長呈對應關系。

圖1 發酵過程中還原糖含量、S.cerevisiae活菌數和乙醇體積分數變化趨勢Fig.1 Trends of reducing sugar content,viable yeast count and alcohol content during co-fermentation process
如圖2所示,在共接種模式下,由S.cerevisiae主導的AF和O.oeni主導的MLF幾乎同步進行,本土O.oeniZX-1和MG-1與S.cerevisiaeVW和AW共發酵表現出良好的適應性,能夠較快地觸發MLF。如圖2所示,ZX-1和MG-1生長趨勢一致,表現出相似的發酵性能。在AF 24 h后接種本土O.oeni進行共發酵,4 個處理組菌體數量均于4 d分別達到最大值(A組:2.09×106CFU/mL;B組:2.13×106CFU/mL;C組:2.55×106CFU/mL;D組:2.61×106CFU/mL),5 d后進入衰亡期。隨著MLF的進行,發酵液中L-蘋果酸含量呈逐步下降趨勢,A、B組和C、D組L-蘋果酸質量濃度分別于發酵9 d和8 d降至0.2 g/L以下,降酸率分別為97.50%、96.67%、96.11%和95.28%,其中A組降酸能力最強。在由S.cerevisiae導致乙醇體積分數增加的過程中,2 株O.oeni生長量并未受到抑制,說明在共發酵過程的起始階段,較低的乙醇體積分數更有利于O.oeni適應酒體環境,同時早期凋亡的S.cerevisiae細胞可為O.oeni提供氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等營養因子。菌株的個體差異表現為MG-1與S.cerevisiaeVW和AW共發酵過程中生物量均略高于ZX-1。

圖2 共發酵過程中O.oeni活菌數、L-蘋果酸含量變化趨勢Fig.2 Trends of viable O.oeni count and L-malic acid content during co-fermentation process
2.3.1S.cerevisiae生長動力學模型
由圖1可知,AF初期體系營養物質充足,乙醇體積分數較低,S.cerevisiae處于生長期和穩定期,A、B組和C、D組分別于5 d和7 d后逐漸進入衰亡期,因此本研究擬對0~5 d(A、B組)和0~7 d(C、D組)時期S.cerevisiae生長情況進行非線性擬合。選用Logistic模型、Boltzmann模型和SGompertz模型對共發酵處理組S.cerevisiae數量變化進行擬合,擬合方程見表2。對比分析可得,4 個處理組擬合系數R2由大到小分別為Boltzmann模型>Logistic模型>SGompertz模型,Boltzmann模型能較好地模擬并預測共發酵過程中S.cerevisiae的生長情況,此結論與王少曼等[29]關于菠蘿蜜果酒釀造過程中酵母菌數的擬合模型一致。

表2 S.cerevisiae動態變化的擬合方程及其擬合系數Table 2 Fitting equations with correlation coefficients for S.cerevisiae growth
如圖3擬合曲線所示,S.cerevisiae在共發酵過程中生長曲線呈“S”型,在發酵0~1 d,2 株S.cerevisiae生長速率均較慢,處于生長適應期;VW和AW分別于2~4 d和1~5 d處于對數生長期,此時S.cerevisiae生長速率較快,乙醇體積分數逐漸增加。

圖3 Boltzmann模型下S.cerevisiae生長擬合曲線Fig.3 Boltzmann models describing S.cerevisiae growth
2.3.2 乙醇生成動力學模型
共發酵模式下乙醇體積分數的動態變化擬合系數見表3。對比Logistic模型、Boltzmann模型和SGompertz模型擬合系數,4 個處理組均以Boltzmann模型擬合效果最好,擬合系數R2分別為0.99790、0.99860、0.99894和0.99964,表明該模型能夠反映共發酵模式下乙醇的生成情況,與李俠等[30]對紅棗酒產物擬合模型所選一致。

表3 乙醇生成量的擬合方程及其擬合系數Table 3 Fitting equations with correlation coefficients for alcohol production
由圖4擬合曲線可知,在整個發酵過程中乙醇體積分數的測定值與預測值均有較好的擬合度。發酵1 d,4 個處理組乙醇體積分數增加均不明顯,可能是S.cerevisiae生長較緩慢,還原糖利用率低,致使還原糖不能充分轉化為乙醇[31]。發酵1 d后乙醇體積分數大幅度增加,與S.cerevisiae的生長同步進行,其中A、B處理組乙醇體積分數增加較C、D處理組快。發酵至6~8 d(A、B處理組)和7~10 d(C、D處理組),由于處于發酵后期,S.cerevisiae生長處于衰亡期,糖轉化率降低,乙醇體積分數增加緩慢。

圖4 Boltzmann模型下乙醇生成擬合曲線Fig.4 Boltzmann models describing alcohol content
2.3.3 還原糖含量變化動力學模型
還原糖含量動力學模型建立的擬合方程、擬合系數見表4。對比各擬合模型可得Logistic模型能較好反映4 個處理組還原糖含量的變化情況,擬合系數R2分別為0.99914、0.99946、0.99949和0.99917,此結果與張琪等[32]對黑加侖果酒發酵動力學研究中所選擬合方程一致。

表4 還原糖含量變化的擬合方程及其擬合系數Table 4 Fitting equations with correlation coefficients for reducing sugar content
由圖5擬合曲線可知,還原糖的消耗與乙醇的生成呈對應關系,隨著S.cerevisiae數量的增多,乙醇逐漸積累,還原糖含量下降,A、B組和C、D組分別發酵至8 d和10 d,4 個處理組酒體內還原糖質量濃度均下降至4 g/L以下,標志AF結束。

圖5 Logistic模型下還原糖含量變化擬合曲線Fig.5 Logistic models describing reducing sugar content
2.3.4 本土O.oeni生長動力學模型
由圖2可知,本土O.oeni菌株ZX-1和MG-1與S.cerevisiaeVW和AW共發酵分別于6 d和5 d后進入衰亡期,因此本研究擬對1~6 d(A、B組)1~5 d(C、D組)時期O.oeni生長情況進行非線性擬合。各動力學模型如表5所示,相比較于Logistic模型,Boltzmann模型和DoseResp模型均對O.oeniZX-1和MG-1數量變化能進行較好的描述,故選用Boltzmann模型和DoseResp模型對共發酵過程中O.oeni生長情況進行定量描述。

表5 O.oeni動態變化的擬合方程及其擬合系數Table 5 Fitting equations with correlation coefficients for O.oeni growth
由圖6擬合曲線可知,O.oeni在共發酵早期能快速適應發酵環境進入對數生長期。A、B組和C、D組分別發酵至5 d和4 d時,由于在AF過程中乙醇逐漸積累增加了細胞膜的流動性,對O.oeni的生長有一定抑制作用[33],且酒體內大量精氨酸和其他氨基酸被消耗,O.oeni生長變的緩慢,隨后進入穩定期。


圖6 Boltzmann模型和DoseResp模型下O.oeni數量變化擬合曲線Fig.6 Boltzmann and DoseResp models describing O.oeni growth
2.3.5L-蘋果酸含量變化動力學模型
表6為共發酵過程中L-蘋果酸含量變化的擬合方程和擬合系數。對比3 種擬合模型,4 個處理組Boltzmann模型和DoseResp模型擬合系數R2分別一致(A組:0.99915,B組:0.99951,C組:0.99913,D組:0.99984),高于對應的Logistic模型,均能較好反映共發酵過程中L-蘋果酸含量的變化。

表6 L-蘋果酸含量變化的擬合方程及其擬合系數Table 6 Fitting equations with correlation coefficients for L-malic acid content
L-蘋果酸可使葡萄酒產生強烈的酸澀感,其在葡萄酒發酵期間含量的變化是衡量MLF是否完成的重要標志[34]。如圖7擬合曲線所示,在共發酵過程中4 個處理組L-蘋果酸的消耗與O.oeni的生長呈反向趨勢。隨著O.oeni數量的增長,L-蘋果酸含量逐漸下降,在O.oeni對數生長時期,L-蘋果酸含量下降速率較快,4 個處理組均于發酵5 d后L-蘋果酸消耗速率較為緩慢,并分別于發酵9 d和8 d完成MLF。

圖7 Boltzmann模型和DoseResp模型下L-蘋果酸含量變化擬合曲線Fig.7 Boltzmann and DoseResp models describing L-malic acid content
采用模擬葡萄汁為發酵基質,以本土O.oeniZX-1和MG-1分別與S.cerevisiaeVW和AW進行共接種發酵。結果表明,不同菌株組合均能順利完成AF和MLF,所選模型能較好描述共發酵動力學特征。O.oeni作為主導MLF的主要乳酸菌菌種,對葡萄酒生境具有較高要求。葡萄汁成分復雜,含有較多野生酵母和雜菌等抑制O.oeni生長的抑制因子[35]。而模擬葡萄汁因其成分簡單,不僅可以滿足微生物生長的需要,在排除其他微生物影響的同時,可以避免不同葡萄品種間理化指標差異的影響,且成本低廉,操作可控,有利于研究發酵機理和微生物的生長特性。段浩云等[36]利用模擬葡萄酒發酵體系,對篩選所得14 株乳酸菌進行耐受性分析實驗,結果表明菌株G23與L42綜合耐受能力最強。劉曉嬌等[37]研究O.oeni在不同模擬酒中的降酸效果發現,O.oeni31MBR和SD-2a在96 h內降酸率達到90%以上。Nehme等[38]在模擬酒中發現在MLF 500 h時,O.oeniX降解了74%的L-蘋果酸。
在共發酵過程中,A、B、C、D組S.cerevisiae活菌數均略低于對照組,這與Mu?oz等[39]對丹娜葡萄汁進行共發酵的結果一致。該過程中由于受乳酸菌活性影響,酵母生長動力學和代謝活性降低。這一結果可能是由于早期接種發酵基質中較低的乙醇體積分數有利于本土O.oeni生長,造成了營養競爭,且本土O.oeni在生長過程中可能會釋放β-1,3-葡聚糖酶,該酶會水解S.cerevisiae細胞壁,導致S.cerevisiae活菌數降低[40]。也有學者研究發現O.oeni對S.cerevisiae的生長沒有影響,但會加速S.cerevisiae細胞的死亡,而S.cerevisiae細胞死亡速度的加快可能與O.oeni代謝產生的抑制因素有關[41]。此外,S.cerevisiae合成乙醇和中鏈脂肪酸的濃度和類型會抑制O.oeni的生長,且S.cerevisiae細胞內的陽離子蛋白也可能抑制MLF。然而,也有學者研究發現酵母的自溶活性在很大程度上影響葡萄酒中多肽、氨基酸和蛋白質等含氮化合物的濃度,而多肽(<1000 Da)對O.oeni的生長具有促進作用[42]。Tristezza等[11]對黑曼羅葡萄酒共發酵結果表明,菌株CL1能順利完成MLF,而CL2則存在較高的L-蘋果酸殘留量,說明S.cerevisiae與O.oeni之間的相互作用與所選菌株有關。本研究4 個處理組還原糖消耗率和L-蘋果酸降酸率均可達到95%以上,進一步說明本土O.oeniZX-1、MG-1和S.cerevisiaeVW、AW共接種可順利完成AF和MLF。
共發酵過程中菌體生長、底物消耗和產物生成情況非線性擬合結果表明,Boltzmann模型對酵母菌生長和乙醇體積分數變化情況擬合效果較好,Logistic模型能較好反映還原糖含量的消耗變化。Boltzmann模型和DoseResp模型擬合系數R2相同,2種模型均能對共發酵過程中O.oeni生長和L-蘋果酸的消耗情況進行擬合。李雪等[19]在仙人掌果酒發酵動力學研究結果表明,SGompertz、Logistic和DoseResp模型能較好反映發酵過程中酵母菌數、乙醇體積分數和還原糖含量變化。張琪等[32]研究發現,黑加侖果酒發酵過程中酵母菌數、乙醇體積分數和還原糖含量變化均以Logistic模型擬合效果最好。
近年來,越來越多的動力學模型被應用于指導酒類工藝放大生產。微生物菌株的發酵能力不僅與其自身生理機能有關,還受到發酵工藝、條件、過程控制等動力學規律的影響[39]。充分了解和掌握發酵過程中主要理化參數的變化趨勢,選取適宜的發酵動力學數學模型,可較為準確地預測釀酒過程中關鍵指標的最終水平,對發酵菌株選擇、工藝優化及工業化生產具有重要的指導作用[19]。在后續研究中,需要進一步通過葡萄酒釀造生產實踐驗證實驗所建立動力學模型的適用性,深入探討共接種發酵對酒體的品質影響,為定向釀造特色化葡萄酒、提升生產效率及促進本土菌株的產業化應用提供理論依據和技術支撐。
綜合分析發酵過程中底物消耗和產物生成的動態變化趨勢結果表明,混菌發酵模式未明顯抑制供試各菌株的生長和發酵性能,2 株本土O.oeni分別與商業S.cerevisiaeVW、AW共接種后均可順利完成AF和MLF。不同接種處理組S.cerevisiae活菌數、乙醇體積分數、還原糖含量、O.oeni活菌數和L-蘋果酸含量最佳線性擬合模型預測值和實測值擬合效果良好,可較為客觀反映共發酵過程微生物生長和特定代謝物轉化的動力學特征。研究結果有助于揭示共接種發酵過程中S.cerevisiae和O.oeni的演替變化規律,對葡萄酒釀造生產中相關主要指標的預測和工藝優化控制具有潛在的應用指導價值。