胰凝乳蛋白酶SplB在枯草芽孢桿菌中的重組表達及應用

潘麗潔，王 斌，潘 力

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東省發酵與酶工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

蛋白酶是目前重要的工業酶，約占全球酶總銷量的60%，具有極高的商業價值[1]，在食品發酵、脫苦、烘焙等行業有重要的應用[2-5]。其中，胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）屬于絲氨酸蛋白酶，作為專一性切割的堿性水解酶，應用于食品加工、生物醫藥、皮革加工等領域[6-7]。胰蛋白酶最早在動物胰臟中發現，作用是降解或活化其他蛋白酶原[8-9]。最初認為胰蛋白酶只存在于脊椎和無脊椎動物中，隨著研究的深入，胰蛋白在原核和真核微生物中被發現[10-11]。通過微生物發酵獲得的胰蛋白酶濃度相對較高、易提純，因此通過微生物重組表達各種來源的胰蛋白酶成為當前趨勢[12-16]。

來自金黃色葡萄球菌的胰凝乳蛋白酶SplB屬于絲氨酸蛋白酶家族，是胰蛋白酶樣蛋白酶。該蛋白具有嚴謹的WELQut特異性切割活性，是一種理想的N端標簽切除酶。Reed等[17]首次發現并獲得該蛋白的氨基酸序列。Popowicz等[18]通過大腸桿菌異源表達了蛋白酶SplB，并通過不同的表達方式確定該蛋白酶與其他胰蛋白一樣，改變N端氨基酸會極大的影響其活性。Dubin等[19]通過枯草芽孢桿菌表達蛋白酶SplB，分離純化后最終產量為2.5 mg/L。通過構建并水解底物庫，發現蛋白酶SplB特異性識別WELQ（色氨酸-谷氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺）肽段并切割，同時通過X射線衍射揭示了SplB扭曲的活性中心，雖然折疊方式與胰凝乳蛋白酶相似，但SplB不需要前肽水解重排活性中心[20]且活性中心的空間位置使蛋白酶有與其他胰蛋白酶不同的切割傾向。Pustelny等[21]在WELQ肽段兩端連接發光基團GST、YFP，并在WELQ肽段后添加不同氨基酸，確定了蛋白酶SplB不僅對P1位置嚴格限制，同時對P1’位置也有偏好性。在P1’位置，SplB更喜好極性不帶電氨基酸，如谷氨酰胺和天冬酰胺；其次是側鏈較小的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸；而含有較大側鏈的疏水性氨基酸是最不利于反應的。丁晨等[22]在枯草芽孢桿菌中表達了該蛋白，并篩選了最佳的誘導表達條件。取誘導前菌液OD600nm2.0、IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導4 h時，獲得最高的表達量，純化后每升發酵液獲得16 mg蛋白，對比Dubin等[19]在枯草芽孢桿菌中的表達，其產量提升了6 倍。在蛋白酶的最適反應條件方面，Dubin等[19]以明膠、彈性蛋白、膠原蛋白、白蛋白和酪蛋白的熒光標記衍生物為底物，測定蛋白酶SplB的酶學性質，確定了SplB的最適pH值為8.0～8.5，在pH 7.0和pH 9.0時活性下降到50%。最適反應溫度在37～42 ℃之間，當溫度超過50 ℃，或低于15 ℃時，酶活力開始下降[19]。

由于蛋白酶SplB應用在蛋白的標簽切割時，反應時間較長，商品酶反應時間在1～16 h。因此在設置反應條件時，應貼合被切割蛋白的最佳保存條件，以最大程度保護被切割蛋白的生物活性。目前有關SplB的報道中，鮮見對蛋白酶SplB溫度以及pH值耐受性等酶學性質進行完整研究的文獻，這嚴重限制了蛋白酶SplB的實際應用場景。

因此，本研究利用自主研發的枯草芽孢桿菌宿主ATCC 6051Δ10和商業化宿主WB800，通過優化表達元件，進行胰凝乳蛋白酶SplB的重組表達，并進一步研究重組SplB的酶學性質，構建SplB在重組蛋白Prx標簽切割中的應用體系，旨在為研究蛋白酶SplB在實際應用中存在的問題提供解決思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質粒

本研究使用的菌株及質粒見表1。

表1 菌株及質粒表 1 List of strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

2×Premix PrimerSTAR Mix 日本TaKaRa公司；2×NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit 美國紐英倫生物技術公司；pMD-20 T載體/pMD-18 T載體日本TaKaRa公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物回收試劑盒 廣州美基生物科技公司；質粒小量提取試劑盒美基生物科技公司；WELQ-對硝基苯胺（4-nitroanilide hydrochloride，pNA）、N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽（N-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride，BApNA） 南京肽業生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

Luria-Bertani（LB）培養基：取1 g氯化鈉、1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物，加入去離子水定容至100 mL，攪拌溶解后，調pH 7.0，固體培養基則再加入2 g瓊脂糖，121 ℃、20 min滅菌；SOC培養基：取3.14 g SOC粉末，加入去離子水定容至100 mL，攪拌充分溶解，116 ℃、30 min滅菌。

1.2 儀器與設備

垂直蛋白電泳系統、DNA凝膠電泳系統 美國Bio-Rad公司；蛋白層析純化儀 蘇州賽譜儀器有限公司；5 mL鎳柱 美國Healthcare公司；多功能酶標儀 德國BMG公司；96 孔酶標板 美國康寧公司；電轉儀達科為生物技術股份有限公司；高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 以pBEs101質粒為基礎構建表達載體骨架

實驗室保藏質粒pBEs101包括雙啟動子P43P43、信號肽SamyQ、RBS位點、終止子Ter、枯草芽孢桿菌表達載體通用骨架pBE。通過酶切去除重復啟動子，獲得單P43通用載體pBEs1011，通過XhoI和XbaI雙酶切獲得表達載體骨架。

1.3.2SplB表達載體構建及轉化

根據UniProt上SplB氨基酸序列，經過枯草密碼子優化后送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成目的基因，根據序列信息設計引物PCR擴增分別獲得N端帶Histag、C端帶His-tag和不帶His-tag的3 種目的基因SplB片段（SplB、SplB-His、His-SplB），通過無縫克隆技術（2×NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit）表達載體骨架獲得SplB的表達載體。通過更換表達載體的啟動子（PamyX、PamyLPspovG、PxylR），構建不同啟動子的SplB表達載體。表達載體轉化大腸桿菌，大腸桿菌感受態通過SOC培養基復蘇，并進行測序驗證，使用LB培養基培養克隆正確的轉化子。驗證正確的表達載體轉化枯草芽孢桿菌ATCC 6015Δ10、WB800，將轉化子轉接裝有LB培養基（含卡那霉素）的24 孔板中，37 ℃、220 r/min培養24 h后收集菌體、提取基因組DNA，進行PCR擴增篩選陽性轉化子。

1.3.3 SplB重組菌株發酵培養

從-80 ℃冰箱取出一管保藏的菌液，接入3 mL含有卡那霉素的LB培養基，37 ℃、220 r/min培養16 h，作為一級種子液。取1 mL轉接入20 mL含有卡那霉素的LB培養基，37 ℃、220 r/min培養9～10 h，使菌液處于對數生長期，作為二級種子液。取二級種子液測菌液OD600nm值，并按等OD600nm值將二級種子液接入100 mL LB搖瓶培養基中（約5%接種量），37 ℃、220 r/min培養24 h，結束發酵。

1.3.4 胰凝乳蛋白酶活力測定

參照Yang Ning等[23]方法設計底物WELQ-pNA，底物由南京肽業生物科技有限公司合成。為了更好地對比不同條件下酶活力的差異，參考林曉彤[24]的方法，定義每分鐘水解底物產生1 μg pNA所需的酶量為1 個酶活力單位。

1.3.4.1 pNA標準曲線的繪制

取1 g左右pNA于烘箱中徹底烘干，烘干后用分析天平精確稱量0.1381 mg pNA，溶于30 mL水中，后定容至1 L，得到1 mmol/L pNA母液。后將母液稀釋至0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mmol/L。吸取200 μL混合液置于96 孔酶標板，測405 nm波長處的吸光度。以吸光度為橫軸、濃度為縱軸，繪制標準曲線。

1.3.4.2 酶活力測定

酶活力測定實驗均重復3 次，且采用方差分析其差異顯著性，P＞0.5表明實驗結果可靠。將酶液均分于兩個EP管中，每管200 μL分別為實驗組和對照組。實驗組于40 ℃水浴保溫，對照組在沸水浴15 min使之失活。實驗組與對照組皆在40 ℃水浴保溫5 min，取出加入750 μL Tris-HCl（100 mmol/L，pH 8.0），加入50 μL 10 mmol/L的WELQ-pNA溶液，吹吸混勻。對照組提前加入100 μL 50%乙酸溶液，終止反應。將實驗組與對照組皆置于40 ℃水浴反應30 min，取出反應液，在實驗組中加入100 μL 50%乙酸溶液，結束反應。吸取200 μL反應液于酶標板，每個反應測3 組。用酶標儀測405 nm波長處的吸光度。酶活力計算公式如下：

式中：A為實驗組與對照組平均吸光度差對應標準曲線計算得到的pNA濃度/（mmol/L）；138.12為pNA分子質量（g/mol）；N為發酵液稀釋的倍數；5.5為反應總體系對酶液的稀釋倍數；T為反應時間/min。

1.3.5 蛋白純化與酶學性質檢測

1.3.5.1 蛋白純化

發酵液預處理：將枯草芽孢桿菌發酵液均分于100 mL離心管中，配平，4 ℃、12000 r/min離心10 min，收集上清液。用0.45 μm濾頭過濾上清夜，該步驟于冰上操作。

鎳柱親和層析：ddH2O沖洗系統，沖洗至紫外線水平，裝鎳柱；Buffer A液沖洗柱子至基線平衡。上蛋白粗酶液約30 mL，并收集上樣峰；5% Buffer B液洗脫雜蛋白，后按10%梯度遞增Buffer B液，洗脫蛋白，并收集各個組分出峰時的流出液。

1.3.5.2 酶學性質

溫度對SplB活力的影響：在pH 8.0條件下，4～70 ℃范圍內，測定不同溫度條件下SplB活力，確定最適反應溫度。

pH值對SplB活力的影響：在最適反應溫度條件下，pH 2.0～11.0范圍內測定SplB活力，確定最適反應pH值。體系中的底物與酶液量不變，反應緩沖液替換為不同pH值的緩沖液。其中pH 2～6、10～11為Btitton-Robinson緩沖液，pH 7～9由Tris-HCl配制。

SplB熱穩定性：將純化后SplB酶液稀釋一定倍數，在10～70 ℃范圍的水浴鍋和金屬浴中孵育0～4 h，在最適反應溫度和最適pH值下，測定孵育不同時間后SplB活力。SplB pH值穩定性：于4 ℃冰箱中，將純化后的酶液在pH 2.0～12.0范圍的沖液中孵育7 d，每隔一段時間取出一部分酶液，在最適條件下測定孵育不同時間后SplB活力。

金屬離子和化學物質對SplB活力的影響：用pH 8.0的Tris-HCl配制K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等金屬離子溶液，獲得500 mmol/L母液；后再根據需要稀釋成50 mmol/L和5 mmol/L濃度的溶液。用pH 8.0的Tris-HCl配制不同化學物質母液（乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）），使得各種化學物質濃度分別為100、20 mmol/L和20 mmol/L。再根據需要稀釋成不同濃度溶液。反應體系為700 μL Tris-HCl（100 mmol/L，pH 8.0），加入50 μL 10 mmol/L的WELQ-pNA、50 μL酶液、50 μL不同稀釋度的離子或化學溶液，在最適反應溫度與pH值下測定SplB活力。

1.3.6 蛋白酶SplB在標簽切割中的應用

1.3.6.1 TrxA標簽蛋白的構建

為驗證蛋白酶SplB的實際應用價值，構建了一種N端帶有TrxA標簽的過氧化物酶Prx，且在Prx與TrxA之間加入WELQ肽段，以驗證SplB切割TrxA標簽的效果。將過氧化物酶Prx構建到pET32a載體，在Prx的C端添加His-tag，轉化大腸桿菌構建Prx大腸桿菌工程菌株。通過鎳柱親和層析獲得胞內表達的蛋白Prx，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定目的蛋白。

1.3.6.2 SplB蛋白切割Prx的應用

通過BCA試劑盒測定蛋白濃度，按100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1的比例添加Prx與SplB，室溫反應20 h。聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定最佳反應比例。反應結束后通過SDS-PAGE分析切割效果。

1.4 數據處理

酶活力實驗均復3 次，取其平均值，且采用方差分析其差異顯著性，P＞0.5表明實驗結果可靠，并通過Origin繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 胰凝乳蛋白酶SplB的重組表達及表達元件、宿主優化

2.1.1 胰凝乳蛋白酶SplB的生物信息學分析

金黃色葡萄球菌絲氨酸蛋白酶SplB，在MEROPS蛋白酶數據庫分類為胰凝乳蛋白酶家族S1（Family S1）中S1B亞家族的特征性肽酶S01.282，搜尋了Uniprot數據庫中注釋為絲氨酸蛋白酶SplB的基因，并同時在Swiss-Prot注釋過的14 個SplB基因進行同源比對（圖1）。絲氨酸蛋白酶SplB包含240 個氨基酸，其中前36 個氨基酸為信號肽（圖中粉紅色標注），其催化活性中心為催化三聯體組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸（75H、113D、193S，圖中紅色標注），活性中心保守。其中，Uniprot Q2FXC3的絲氨酸蛋白酶SplB已完成了晶體結構解析[20]。SplB屬于胰凝乳蛋白酶家族，一般而言，胰凝乳蛋白酶酶原通過水解N端前肽，重排活性中心的結構激活，只有精確的N末端加工才能釋放野生型蛋白酶的全部水解活性，但激活蛋白酶SplB的分子機制存在顯著差異，其酶原和成熟體的晶體結構比較未發現活性位點重排，但是天然信號肽或任何N端延伸對SplB具有抑制作用[18]。

圖1 Uniprot數據庫中注釋為SplB基因的同源比對Fig.1 Homologous alignment of the SplB gene annotated as a serine protease in the Uniprot database

2.1.2 His-tag位置對SplB活力的影響

為了重組SplB的純化，需要在重組蛋白上添加Histag。分別構建了N端、C端添加His-tag的重組SplB菌株。重組菌株發酵上清液酶活力測定結果顯示（圖2），N端帶His-tag的酶活力最低，而C端帶His-tag的菌株與不帶His-tag的菌株酶活力差別不大，這與文獻[19,25]的結論一致，即SplB的N端是其重要結構域，而C端相對不重要。

圖2 3 種表達方式的SplB活力測定Fig.2 Enzyme activities of SplB gene transformants with His-tag at different terminals

2.1.3 重組SplB的表達元件及宿主優化

為提高SplB的表達水平，對重組表達宿主和啟動子進行了篩選。分別構建了以P43、PamyX、PamyLPspovG、PxylR作為啟動子的SplB表達載體，分別轉化枯草芽孢桿菌宿主菌WB800、ATCC6051Δ10。對所得重組SplB菌株進行發酵并測定發酵液的酶活力，圖3、4結果顯示，相同啟動子的重組菌株在發酵相同時間條件下，以ATCC6051Δ10作為宿主的重組菌株酶活力均高于以WB800為宿主的菌株，說明ATCC6051Δ10宿主更適合蛋白酶SplB的表達。同時，啟動子P43介導的SplB重組表達活力最高，達到10.24 U/mL。

圖3 不同宿主發酵液SplB活力測定Fig.3 Enzyme activities of SplB expressed in different hosts

圖4 不同宿主發酵液SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE patterns of SplB expressed in different hosts

2.2 重組SplB的純化與酶學性質

2.2.1 重組SplB的純化及最適反應條件分析

通過His-tag親和純化重組SplB菌株的發酵上清液，純化過程見圖5，SDS-PAGE結果顯示發酵上清液純化過程中的峰2、峰3洗脫液為雜蛋白，峰4為目標蛋白SplBHis，蛋白酶SplB在40% Buffer B處出峰，對應的咪唑洗脫濃度為200 mmol/L。

圖5 SplB-His蛋白酶洗脫峰與SDS-PAGE圖Fig.5 Chromatographic separation and SDS-PAGE pattern of SplB

圖6結果顯示，重組SplB的最適反應溫度為40 ℃，且在10～60 ℃范圍內可維持80%以上酶活力，酶活力變化不明顯。重組SplB的最適反應pH值為8.5，在pH 7～9.5范圍內酶活力維持在80%以上。當pH值大于10或低于5時，酶活力急劇下降。從該結果看，SplB的適用溫度與pH值范圍寬廣，應用潛力高，具有較大的商業應用價值。

圖6 SplB蛋白酶最適溫度及pH值Fig.6 Optimal temperature and pH of SplB protease

2.2.2 重組SplB的穩定性

圖7結果顯示，在不同溫度下溫育相同時間，其酶活力變化趨勢一致。并且短時間內，60 ℃孵育可小幅提高酶活力。繼續孵育后酶活力開始下降，但下降幅度較小，同條件下10 ℃、5 h孵育酶活力下降最大，降至74%。說明溫度對SplB活力影響不大，SplB可在不同溫度條件下保留較長時間而極少損失酶活力，具有非常好的溫度穩定性。pH值穩定性結果顯示，除在pH 8.0條件下，SplB在其他pH值條件下溫育4 h時，酶活力反而升高，其中中性條件下酶活力漲幅最大，達到初始酶活力的124%。之后酶活力慢慢下降。并且下降幅度較小，其中酶活力下降最多的條件為pH 8.0溫育100 h，酶活力下降為初始酶活力的86%。以上結果說明重組蛋白酶SplB具有非常好的pH值穩定性，特殊pH值條件孵育較短時間甚至可以提高相對酶活力，此性能賦予SplB較廣的應用場景，提高了SplB的商業應用潛力。

圖7 SplB蛋白酶pH值與溫度耐受性Fig.7 pH and temperature tolerance of SplB protease

2.2.3 金屬離子與化學試劑對重組蛋白酶SplB活力的影響

為研究金屬離子與化學試劑對重組SplB活力的影響，用溶解了離子和化學試劑的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液稀釋蛋白酶液作為實驗組，以未溶解離子和化學試劑的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液稀釋蛋白酶液作為對照組，對照組酶活力設為100%。在離子濃度比較高（5 mmol/L）的情況下（表2），金屬離子對其活力都有抑制作用。在離子濃度較低情況下，Co2+對SplB活力有促進作用，Mg2+、K+不影響酶活力。而Cu2+、Zn2+、Ni+離子抑制SplB活力，其中，Ni+在低濃度下（1 mmol/L）下抑制作用不明顯，濃度升高后，抑制作用同時提高。另外，SDS可以極大地抑制重組SplB的酶活力，而傳統的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF卻對重組SplB活力有促進作用。

表2 不同濃度離子和化學物質對重組SplB相對酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of recombinant SplB%

2.3 重組蛋白酶SplB在重組蛋白Prx標簽切割中的應用

2.3.1 帶標簽的Prx重組蛋白的純化

為了獲得純化的帶標簽蛋白Prx，進行蛋白標簽的切割。通過超聲破碎Prx大腸桿菌工程菌，獲得胞內表達的Prx蛋白溶液。重組Prx蛋白的N端帶有His-tag，大小為39.7 kDa，通過鎳柱親和層析純化該蛋白。SDS-PAGE結果顯示（圖5），當Buffer B達到70%時，蛋白被洗脫，且在80%、90%均有洗脫峰，70%洗脫濃度最大。

2.3.2 重組蛋白酶SplB應用于切割Prx蛋白標簽

將SplB與帶有WELQ肽段的Prx蛋白按不同質量濃度混合，室溫反應20 h，通過SDS-PAGE檢測切割效果，以確定蛋白酶SplB的作用。Prx與SplB添加量見表3。WELQ肽段添加在Prx與TrxA基因之間（圖8A），使得酶切蛋白大小分別為18.15、21.12 kDa。切割結果顯示（圖8B），蛋白酶SplB具有標簽切割作用，并且蛋白酶SplB濃度越高，酶切效果越好。

表3 重組Prx蛋白與SplB蛋白的添加量Table 3 Dosages of recombinant Prx and SplB μL

圖8 重組蛋白酶SplB在重組蛋白Prx標簽切割中的應用Fig.8 Application of recombinant SplB in the tag digestion of recombinant protein Prx

2.4 重組蛋白酶SplB與商品酶在重組蛋白Prx標簽切割中的對比

為了對比商品酶和重組蛋白酶SplB的切割效率，將商品酶稀釋至與SplB相同的濃度，分別和帶有WELQ肽段的Prx蛋白按1∶5混合，并延長反應時間至48 h，通過SDS-PAGE檢測切割效果，圖9顯示，兩組Prx蛋白都被切割為短肽，且蛋白酶SplB的標簽切割效果與商品酶相近。說明本研究獲得的蛋白酶SplB與在售商品酶性質相當。

圖9 重組蛋白酶SplB與商品酶在重組蛋白Prx標簽切割中的對比Fig.9 Comparison of SplB and commercial enzyme in tag cleavage of recombinant protein Prx

3 討論

胰蛋白酶從被發現開始，在食品、藥品等領域就獲得廣泛應用。因自然界中發現的大多數胰蛋白酶來源于哺乳動物，產量低，純化復雜，使得重組蛋白酶的研究成為一大熱點。哺乳動物來源的胰蛋白酶，因自身蛋白修飾系統復雜，難以在細胞結構相對簡單的微生物中大量表達，同時哺乳動物來源蛋白酶在藥品領域，始終存在容易引發免疫應答的風險。Yee等[26]通過大腸桿菌重組表達了鼠來源的胰蛋白酶；Viader-Salvadó等[27]在畢赤酵母中重組表達了對蝦來源的胰蛋白酶。微生物異源表達胰蛋白酶解決了其純化困難與免疫原性的問題，但動物來源胰蛋白在微生物中產量相對于其他的蛋白酶仍舊低下。因此，尋找微生物來源的類胰蛋白酶，大量表達代替動物來源的胰蛋白酶，具有非常重要的研究價值。蛋白酶SplB來源于金黃色葡萄球菌，是一種致病菌，本研究利用實驗室自主研發的枯草芽孢桿菌宿主，表達重組胰蛋白酶。根據Guan Chengran等[28]的研究，枯草芽孢桿菌為食品安全菌，且在表達堿性蛋白上具有優勢以枯草芽孢桿菌為宿主，在解決安全性的同時，確保了重組蛋白酶的表達水平（粗酶液活力10.24 U/mL）。本研究通過枯草芽孢桿菌表達純化獲得蛋白酶SplB，以研究其酶學性質。

重組SplB的最適反應溫度為40 ℃，最適反應pH值為8.5，與Popowicz等[29]研究結果一致。本研究獲得的蛋白酶SplB在溫度10～60 ℃、pH 7～9.5范圍內可維持80%以上酶活力，酶活力變化不明顯。而Popowicz等[29]研究結果表明蛋白酶在pH 7.0和pH 9.0時活性下降到50%；在溫度超過50 ℃，或低于15 ℃時，酶活力開始下降，相比之下本研究獲得的蛋白酶SplB溫度和pH值適用范圍更廣。造成該現象的原因尚未可知，在Pustelny等[21]研究中，蛋白酶SplB對底物的空間位阻有所要求，以及P1’位置的氨基酸有偏好性，因此筆者推測兩者使用的底物不同造成了數據差異。除Co2+、Cu2+、Zn2+外，多數陽離子以及金屬螯合劑EDTA-Na2對蛋白酶SplB活力無顯著影響。值得注意的是，常見的胰蛋白酶抑制劑PMSF對蛋白酶SplB無抑制作用，該結果與已有研究[29-30]結論一致。

為模擬蛋白酶SplB的真實應用場景，本研究設計了帶有WELQ標簽的重組Prx蛋白。通過酶切實驗發現，該蛋白在實際應用中的標簽切割效率較低，實際反應時間較長，且單次蛋白酶用量高。因此在反應過程中，應盡量將反應條件保持在適合被切割蛋白保存的范圍內。根據本研究獲得的酶學性質數據，重組蛋白酶SplB廣泛的溫度和pH值適應性以及高度溫度和pH值耐受穩定性、對鹽離子的耐受性等性質，為蛋白酶SplB在實際場景中的靈活選擇提供參考。同時，蛋白酶SplB的高度穩定性，表明該蛋白重復利用的可行性。繼續研究蛋白的回收再利用以減少單次使用成本，同時減少對被切割蛋白的污染，可以進一步提高該蛋白在商業應用中的潛力。

胰凝乳蛋白酶類蛋白酶屬于絲氨酸家族，是一種具有專一性水解活性的堿性內肽酶。SplB為非典型胰凝乳蛋白酶，無前肽，胞外表達的蛋白酶即為活性酶，且具有WELQ肽段專一性識別與切割活性。本研究通過啟動子優化、宿主篩選，成功重組表達了絲氨酸蛋白酶SplB，對純化的重組蛋白酶SplB酶學性質進行了研究，并實現了重組蛋白酶SplB在重組蛋白Prx標簽切割中的應用。