醬香型白酒4輪次堆積發酵理化因子、風味物質與微生物群落相關性分析

吳 成，程平言，謝 丹，黃 魏，范恩帝，陸倫維，胡 峰

（貴州習酒股份有限公司，貴州 習水 564622）

中國醬香型白酒一年為一次生產周期、九次蒸煮、八次發酵、七次取酒，并采用高溫制曲、高溫堆積發酵、高溫餾酒工藝，具有生產周期長、大曲貯存時間長和基酒酒齡長的特點[1]。其中高溫堆積發酵是醬香型白酒釀造非常獨特的生產方式，它的主要作用是網絡堆積環境中的微生物進行生長繁殖，進而產生多種酶類和代謝風味物質，為后續的窖內發酵富集重要的微生物、酶類與風味物質及前體，從而賦予醬香型白酒獨特的醬香風味，因此又被稱之為“二次制曲”[2-3]。其中醬香型白酒3、4、5輪次基酒與其他輪次相比，醬香突出，香氣純正，酒體醇厚，被統稱為“大回酒”，其產量占總基酒總量的55%以上[4-5]，并在勾調時多用其進行勾調。因此，對醬香型白酒“大回酒”輪次堆積發酵機理開展研究對保障大回酒比例，穩定醬香型白酒成品酒質量具有重要意義。

近年來，隨著分子生物學及風味化合物檢測技術的快速發展，例如實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術、高通量測序技術[6]、氣相色譜法、頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術[7]等已被廣泛應用于釀酒微生物多樣性和白酒風味物質的研究中，進一步增進了研究者對醬香型白酒中微生物群落組成及風味物質的認識。Wang Huan等[8]采用高通量測序方法對醬香白酒堆積發酵1～7輪次中微生物多樣性進行了研究，結果表明“大回酒”輪次堆積發酵酒醅中特征真菌屬為unclassified_Davidiellaceae、Candida和Saccharomyces，特征細菌屬為Paenibacillus、Flavobacterium、Delftia和Sphingomonas等；張春林等[9]運用數理統計學方法研究了醬香型白酒2輪次堆積發酵中微生物群落與溫度、水分、淀粉、總酸、還原糖含量等理化因子的相關性，各項理化因子對不同種屬微生物的調控作用存在差異；韓興林等[10]采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對醬香型白酒不同輪次堆積發酵酒醅中風味物質進行了研究，共定性檢測出83 種揮發性風味化合物，且在“大回酒”輪次酯類、醇類及酸類風味物質含量較高[5]。但是，以上研究僅單獨分析了堆積發酵過程風味物質或微生物群落與理化因子二者間的相互作用關系，缺乏三者之間相互作用關系的系統研究報道。

基于此，本研究以醬香型白酒“大回酒”4輪次堆積發酵酒醅為研究對象，采用傳統可培養方法和高通量測序技術解析細菌和真菌群落組成，結合酒醅中各理化因子與風味物質的動態變化，系統分析微生物群落、理化指標及風味化合物三者間的相互作用關系，以期為闡明醬香型白酒“大回酒”輪次堆積發酵機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集自GZXJ公司制酒車間2021年4輪次堆積發酵酒醅。

孟加拉紅培養基、營養瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司；WL（Wallerstein Laboratory）營養瓊脂上海博微生物科技有限公司；DNA提取試劑盒 美國Omega BioTek公司；PCR引物 上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司；ZQPW-70全溫振蕩培養箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；KG-AP32L自動蒸汽滅菌器 日本ALP公司；氣相色譜儀 美國安捷倫科技公司；Pico-21臺式離心機美國Thermo Fisher公司；GL-88B旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳托能達科技有限公司；PCR儀 北京東勝創新生物科技有限公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統 上海復日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

為保證采樣的均一性及代表性，樣品按圖1方式進行采集，取樣頻率為每天。酒醅經出甑、攤晾、拌曲、完全收堆后開始采集，完全收堆后記為發酵0 h，當發酵堆酒醅表層溫度達到50 ℃左右時入窖前即停止采樣。樣品采集后立即裝入無菌自封袋中，于4 ℃條件下帶回實驗室，共采集到酒醅樣品30 份。

圖1 堆積酒醅取樣Fig.1 Sampling points during heap fermentation

1.3.2 理化指標檢測

根據沈怡方[11]方法對酒醅水分、總酸、還原糖及淀粉含量進行檢測。

1.3.3 菌株的分離、鑒定及保藏

分離及保藏：稱取10 g樣品于90 mL無菌水中，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩30 min，吸取1 mL懸浮液稀釋備用，分別采用營養瓊脂、WL營養瓊脂和孟加拉紅培養基分離篩選細菌、酵母菌和絲狀真菌，并記錄菌落總數及形態特征。細菌和酵母菌采用-80 ℃甘油保藏，絲狀真菌采用4 ℃斜面保藏，每株菌株平行保藏3 管。

鑒定：根據菌落形態特征進行初步分類后，每種類別挑選代表性菌株1～3 株[12]分別采用Ezup柱式細菌、酵母菌和真菌基因組DNA試劑盒對菌株DNA進行提取，具體操作流程見試劑盒說明書。細菌采用通用引物27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）對16S r RNA 基因擴增測序；酵母菌采用通用引物N L 1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）和NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）對26 SrRNA基因D 1/D 2 片段擴增測序；絲狀真菌采用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）對內轉錄間隔區1和2片段擴增測序。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min；30 次循環；72 ℃終延伸10 min降至4℃。PCR體系為：模板DNA 0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，Dntp 2.5 μL，Taq酶0.2 μL，正向及反向引物各0.5 μL，使用ddH2O補齊體系至25 μL。

1.3.4 酒醅微生物總DNA提取及PCR擴增

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取樣本總DNA，具體操作流程見試劑盒說明書。細菌采用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC），真菌采用引物ITS3（GCATCGATGAAGAACGCAGC）和引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25 次循環；72 ℃終延伸5 min降至4 ℃。PCR體系為：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL，正向及反向引物各1 μL，DNA模板20～30 ng，使用ddH2O補齊體系至30 μL。

1.3.5 高通量測序

采用Illumina MiSeq測序平臺，分別對細菌16S rRNA基因V3～V4區、真菌ITS3～ITS4區進行高通量測序分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.6 風味成分檢測

采用氣相色譜法檢測酒醅中風味物質。樣品前處理方法為稱取10 g酒醅于體積分數53%乙醇溶液中浸提4 h后，使用0.22 μm無菌膜過濾備用。氣相色譜條件為：CP97723 CP-Wax 57 CB毛細管柱（50 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度230 ℃，進樣量10 μL，分流比50∶1，升溫程序為：40 ℃保持3 min，1.5 ℃/min升溫至70 ℃，不保持，再以2 ℃/min升溫至80 ℃，不保持，最后以7.5 ℃/min升溫至215 ℃，保持20 min；載氣流速為0.3 mL/min。

1.4 數據分析

高通量測序下機序列經cutadapt去除引物接頭序列后，根據PE reads間的overlap關系使用PEAR將成對的reads拼接成一條序列，再按照barcode對其進行識別和過濾等處理后得到有效序列數據。將相似度為97%下的有效系列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，細菌和真菌分別采用RDP和UNITE數據庫進行比對。數據的分析及計算使用Microsoft Office Excel 2016軟件；理化因子動態圖和物種相對豐度柱狀圖采用Origin 2017軟件進行處理繪制；風味物質相對豐度熱圖采用TBtools軟件繪制；冗余分析（redundancy analysis，RDA）采用Canoco5.0軟件；相關性網絡圖根據吳浪濤等[13]方法繪制，即分別選取相對豐度排名前10的細菌和真菌物種，以及含量排名前20的風味物質，采用SPSS 24.0軟件計算Spearman相關性系數，選擇顯著性P＜0.01的微生物與風味物質，采用Cytoscape 5.0軟件繪制相關性網絡分析圖。

2 結果與分析

2.1 理化因子動態變化

如圖2 所示，酒醅溫度逐漸上升，完堆時為（27.9±3.8）℃，到入窖時為（37.9±4.6）℃；而酒醅中水分、酸度、淀粉及還原糖含量基本維持恒定，分別為（49.92±0.60）%～（53.42±0.52）%，（3.83±0.21）～（4.07±0.06）mmol/100 g，（16.01±0.47）%～（17.80±0.53）%和（0.83±0.24）%～（1.10±0.10）%，與Zhang Hongxia等[14]報道基本一致，其研究表明堆積發酵過程酒醅中水分、酸度、還原糖含量維持恒定，而在窖池發酵階段酒醅還原糖含量下降、酸度急劇上升。

圖2 4輪次堆積發酵酒醅理化因子動態變化Fig.2 Changes in physicochemical parameters of fermented grains during the fourth round of heap fermentation

2.2 傳統可培養方法

采用稀釋涂布平板法分離篩選到9 株細菌、39 株酵母菌和11 株絲狀真菌，共保藏177 株。選擇代表性菌株進行分子測序后鑒定結果及其形態特征如圖3所示。吳徐建[15]研究表明醬香型白酒堆積發酵過程中主要的細菌為B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，并且B.amyloliquefaciens具有良好的乙醇耐受性。B.siamensis鮮少從酒醅中分離到，相關報道表明其具有產γ-聚谷氨酸及纖維素酶的能力[16-17]。而采用傳統可培養方法篩選到了P.kudriavzevii（104CFU/g）、C.apicola（102CFU/g）等非釀酒酵母和Aspergillus（102CFU/g）等絲狀真菌。據相關研究報道非釀酒酵母的發酵性能和耐受能力雖然都弱于釀酒酵母，但其在發酵過程中可以分泌大量胞外酶，具有改善酒體、口感、色澤等作用[18]；而Aspergillus等絲狀真菌是醬香型白酒高溫大曲中的主要菌種，其生長代謝可以為高溫大曲提供豐富的酶系，具有分解酒醅中大分子物質、產生白酒中風味化合物及其前提物質的作用[19]。

圖3 可培養方法分離篩選微生物形態特征Fig.3 Microbial characteristics revealed by culture-dependent approaches

2.3 Illumina MiSeq測序解析微生物多樣性

2.3.1 測序評估及序列處理

樣品測序完成后，共得到389354 條原始序列，其中細菌242827 條、真菌146527 條。原始序列經去除嵌合體、過濾等處理后共得到387614 條有效序列，其中細菌241326 條、真菌146288 條，平均長度分別為422 bp和322 bp。如表1所示，細菌和真菌測序覆蓋率都為0.99以上，表明測序深度足夠，樣品中幾乎所有樣本都被檢出，測序結果可真實反映酒醅樣品中細菌和真菌群落多樣性組成情況。對于細菌而言，Chao1指數基本維持不變，Simpson指數先降低后升高，而Shannon指數先升高后下降，表明堆積發酵中期和末期細菌多樣性較為豐富；對于真菌而言，Chao1指數逐漸降低，Simpson指數先升高后降低，而Shannon指數先下降后升高，與細菌變化情況相反，表明在堆積發酵初期真菌多樣性較為豐富。

表1 堆積發酵過程細菌和真菌α多樣性指數Table 1 α-Diversity indexes of bacterial and fungal communities during heap fermentation

2.3.2 細菌及真菌群落動態變化

如圖4所示，樣品經高通量測序后，細菌共檢出7 個門、12 個綱、26 個目、47 個科、72 個屬、111 個種，其中Firmicutes和Proteobacteria為絕對優勢細菌門，A.tumefaciens、V.necropolis、Lactobacillussp.、unculturedKroppenstedtiasp.、K.eburnea、S.yanoikuyae等為優勢細菌種；真菌共檢出3 個門、8 個綱、9 個目、23 個科、41 個屬、69 個種，其中Ascomycota為絕對優勢真菌門，P.kudriavzevii、K.humilis、T.languginosus、B.spectabilis、Z.parabilii等為主要優勢真菌種。目前，尚未見有酒醅中分離出A.tumefaciens和V.necropolis的相關報道，而Lactobacillussp.的主要代謝產物乳酸是形成乳酸乙酯及其他香味成分的重要基礎物質，但對于多輪次循環發酵的醬香型白酒而言，乳酸的積累將對微生物群落結構及產酒品質產生不利影響[20]；在堆積發酵初期T.languginosus、B.spectabilis、Aspergillussp.等絲狀真菌含量豐富，它們可能主要來源于高溫大曲[21]。堆積發酵過程中，A.tumefaciens和P.kudriavzevii數量逐漸上升至發酵末期分別為34.31%和86.81%，V.necropolis和T.languginosus相對豐度急劇降低至13.13%和0.26%，而Lactobacillussp.和K.humilis含量在發酵中期數量最高分別為37.24%和13.52%。

圖4 4輪次堆積發酵細菌（a）和真菌（b）群落組成Fig.4 Composition of bacterial (a) and fungal (b) communities during the fourth round of heap fermentation

2.4 傳統可培養方法與高通量測序結果比較

對于優勢細菌種鑒定而言，傳統可培養方法與高通量測序結果存在差異，傳統可培養方法結果表明B.amyloliquefaciens為堆積發酵中的絕對優勢細菌（105CFU/g），而高通量測序結果中A.tumefaciens和V.necropolis為優勢細菌；對于優勢真菌種鑒定而言，傳統可培養方法和高通量測序技術結果同時表明P.kudriavzevii為主要的優勢真菌，而C.apicola和H.burtonii酵母菌以及A.chevalieri、A.cristatus和M.purpureus等絲狀真菌也在兩種方法中同時被檢出，證明本研究高通量測序結果可靠，且相較于傳統可培養方法而言，高通量測序技術的確有利于揭示樣品中小類菌群的組成。基于此，針對優勢細菌種鑒定結果的差異，本課題組分別采用RDP和Silva數據庫比對后，優勢細菌屬仍為Agrobacterium，導致此結果原因可能是由于擴增片段的選擇不適用于酒醅中細菌群落組成的鑒定；針對真菌多樣性而言，同時采用UNITE和RDP數據庫進行比對，結果發現UNITE相較于RDP數據庫而言，更適用于酒醅中真菌群落組成的鑒定，因此，擴增片段及數據庫的選擇的確會影響高通量測序技術結果的準確性[22]。此外，采用傳統可培養方法僅分離鑒定出了極少部分的細菌、酵母菌和絲狀真菌，表明分離培養基及培養條件等有待于進一步改進優化，特別是針對T.languginosus、Lactobacillussp.等微生物的分離鑒定。

2.5 酒醅中風味物質動態變化

采用氣相色譜法在酒醅中共檢出23 種風味化合物，其中包含3 種醛類物質、7 種酸類物質、6 種酯類物質和7 種醇類物質，其變化規律為：醛類和酸類風味物質含量急劇下降，酯類和醇類風味物質含量基本維持不變，而醋嗡含量逐漸上升，表明在堆積發酵過程中除酸類物質含量較高外，還可以產生一定的酯類和醇類物質，這與張永燕等[23]的研究報道一致圖5表明：堆積發酵前期和中期酒醅風味化合物結構相似，主要以酸類、酯類和醛類物質為主，如乙酸、丙酸、異丁酸、乳酸乙酯、己酸丁酯、糠醛和乙縮醛等，到發酵末期主要以醇類物質為主，如丙醇、異丁醇、異戊醇和醋嗡等，這可能是由于酒醅中微生物群落的相互作用從而導致了風味化合物的轉化。劉曉光等[24]研究表明大曲和酒醅中某些微生物可以直接參與高級醇、乳酸、丁酸、丁酸乙酯及己酸乙酯等白酒中重要風味化合物的形成。

圖5 4輪次酒醅風味成分相對豐度熱圖Fig.5 Heatmap of flavor compounds from fermented grains during the fourth round of heap fermentation

2.6 微生物群落與理化因子及風味化合物間關系

如圖6所示，同時選取相對豐度排名前10的細菌（相對豐度＞88.36%）和真菌種（相對豐度＞86.28%）與理化因子進行RDA，結果表明P.kudriavzevii、S.kudriavzevii與水分、溫度呈正相關，與淀粉和還原糖含量呈負相關；T.lanuginosus、B.spectabilis和A.costiformis等絲狀真菌與水分呈負相關；B.velezensis和C.apicola與淀粉和還原糖含量呈正相關；Z.parabailii、S.pombe和Lactobacillussp.與酸度呈正相關，unculturedKroppenstedtiasp.和Bacillussp.與酸度呈負相關。在堆積發酵過程中溫度逐漸升高，而淀粉和還原糖含量呈現緩慢降低趨勢，Zhang Hongxia等[14]研究表明釀造環境是堆積發酵中Pichiasp.的主要來源，是醬香型白酒堆積發酵中的重要微生物群落，表明4輪次堆積發酵可能主要是由P.kudriavzevii非釀酒酵母菌的生長代謝而驅動。

圖6 理化因子與微生物群落RDAFig.6 RDA between physicochemical factors and microbial community

同時，相關性網絡圖（圖7）分析表明醬香型白酒4輪次堆積發酵過程，同類微生物可代謝多種風味化合物，而同一種風味化合物也可能來自于不同微生物的代謝作用，微生物與風味物質間存在著復雜的構效關系[25]。P.kudriavzevii、K.humilis、Z.parabailii、S.pombe和S.kudriavzevii等酵母菌主要與醇類物質的形成呈正相關，與酸類和酯類物質呈負相關；而T.lanuginosus、B.spectabilis、A.costiformis和M.brevicaulis等絲狀真菌，以及Bacillussp.、K.eburnea和unculturedOceanobacillussp.等芽孢桿菌屬細菌主要與酸類和酯類物質的形成呈正相關，這與Zhang Hongxia等[14]研究報道一致。目前，已有研究報道非釀酒酵母如P.kudriavzevii、Trichosporon coremiiforme、Trichosporonidessp.等具有代謝產生多元醇的功能[26]，芽孢桿菌屬細菌的主要代謝產物包括吡嗪類、酮類化合物、丙酸、乙酸、甲酯等[27]，而絲狀真菌如Aspergillus、Rhizopus和Monascus等可以產生糖化酶、液化酶和纖維素酶等多種功能酶系，它們對于白酒風味物質的形成至關重要[28]。此外，C.apicola和大多數酸類物質呈正相關，表明除乳酸菌及芽孢桿菌屬細菌可以代謝產生酸類物質外，某些非釀酒酵母可能也具有產酸的能力[29]。

圖7 風味成分與微生物群落相關性網絡圖Fig.7 Correlation network diagram of flavor compounds and microbial community

3 討論

同時采用傳統可培養方法和高通量測序技術對醬香型白酒4輪次堆積發酵過程微生物組成情況進行解析，對細菌優勢菌種鑒定結果存在差異，而對真菌優勢菌種鑒定結果一致。16S rRNA基因V3～V4區（436～671 bp）是高通量測序技術中分析細菌多樣性常用的擴增片段，而對于白酒酒醅中細菌多樣性分析大多采用16S rRNA基因V4區（588～671 bp）和RDP數據庫，僅少部分采用了16S rRNA基因V3～V4區，對應使用的數據庫為GenBank[22]。因此，導致本研究細菌優勢群落組成與傳統可培養方法存在差異的原因可能是由于擴增片段的選擇，即16S rRNA基因V3～V4區（436～671 bp）不太適用于醬香型白酒酒醅中細菌多樣性的分析。I.orientalis和P.kudriavzevii為同一種酵母菌[30]，高通量測序結果分析時采用了UNITE數據庫對真菌多樣性進行分析，鑒定結果種名均為I.orientalis，但在傳統可培養方法中對測序序列采用NCBI數據庫進行BLAST比對后，出現種名均為P.kudriavzevii，可見UNITE數據庫中關于某些真菌菌種名若沒有得到及時更新則會影響測序結果準確性和可靠性。因此，雖然高通量測序技術具有快速分析鑒定樣本中微生物群落組成的能力，特別是小類菌群的組成，但是傳統可培養方法仍有無可替代的作用，一是可以填補由于高通量測序數據庫信息不完全造成的結果偏差，二是可以為篩選優良性能菌株奠定物質基礎。此外，堆積發酵的主要作用是網絡環境中的酵母菌，采用傳統可培養方法和高通量測序技術結果同時表明非釀酒酵母P.kudriavzevii為4輪次堆積發酵過程的主要優勢真菌，Zhang Hongxia等[14]研究表明醬香型白酒堆積發酵過程Pichia酵母菌主要來源于釀造環境，其具有較好的熱耐受性及較強的競爭效應。非釀酒酵母功能在葡萄酒領域相關研究報道較多，其可以產生酯酶、β-葡萄糖苷酶、果膠酶和木聚糖酶等，還可以通過自身代謝直接合成多種揮發性風味物質[31]，而在醬香型白酒中也存在著資源豐富的非釀酒酵母，其代謝功能與其他微生物間的相互作用有待于進一步研究。

醬香型白酒“大回酒”輪次基酒具有醬香突出、香氣純正、酒體醇厚的特點，馬宇[32]研究了醬香型白酒1～7輪次基酒中風味物質變化規律，其發現在4輪次基酒中的主要風味物質包括1-辛醇、2,3-丁二醇、丙二醇、鄰苯二甲酸二丁酯、2-羥基-丁酸乙酯、3-甲基戊酸和己酸等。而本研究從4輪次堆積發酵酒醅中同樣檢測出了2,3-丁二醇、丙二醇等物質，與該輪次基酒中主要醇類物質結構組成相近，而酸類和酯類物質組成相差較大，可見醬香型白酒基酒中的部分風味物質可以直接來源于酒醅蒸餾，表明醬香型白酒堆積發酵過程可以富集和篩選微生物，同時還可以直接產生豐富呈香呈味物質前體[33]。水分、酸度及淀粉含量等理化因子受生產工藝影響較大，本研究通過RDA表明酒醅水分與酸度呈現正相關，與淀粉含量呈負相關，與張永燕等[23]的研究報道一致。P.kudriavzevii等酵母菌與水分呈正相關，與淀粉和還原糖含量呈負相關；Bacillussp.、K.eburnea和unculturedOceanobacillussp.等芽孢桿菌屬細菌與酸度、淀粉含量呈正相關；T.lanuginosus、B.spectabilis、A.costiformis和M.brevicaulis等絲狀真菌與水分呈負相關。王歡等[34]研究表明Bacillus、Thermoactinomyces與淀粉含量也呈正相關，與水分呈負相關，主要是因為Bacillus能產生蛋白酶與淀粉酶等水解酶類，水解原料形成豐富的發酵前體物質，而Thermoactinomyces具有糖化力、液化力和較高的蛋白質分解力，可降解釀酒原料中的淀粉、蛋白質等生成風味物質。同時，相關性網絡圖分析表明醇類物質的形成主要與P.kudriavzevii等酵母菌的相關，而酸類和酯類物質主要與絲狀真菌及細菌相關，表明水分可能會影響P.kudriavzevii等酵母菌以及絲狀真菌利用酒醅中淀粉等大分子物質形成醇類、酸類和酯類等風味物質，酸度則會影響細菌生成酸類和酯類等風味物質。但是，本研究結果表明在堆積發酵過程，水分、酸度、淀粉和還原糖含量基本維持恒定，這可能是由于各類微生物間相互作用形成了醇類、酸類和酯類物質的同時又降低了理化因子彼此間對微生物群落的影響[9]，有待于進一步驗證。

4 結論

同時采用傳統可培養方法和高通量測序技術，并結合氣相色譜及多元統計分析法，對醬香型白酒4輪次堆積發酵過程微生物群落、理化因子及風味物質間的相互作用關系進行了解析。傳統可培養方法和高通量測序技術鑒定結果存在異同，結合兩種方法結果表明醬香型白酒4輪次堆積發酵過程主要的優勢細菌和真菌分別為B.amyloliquefaciens和P.kudriavzevii，在堆積發酵過程醇類物質的形成主要與P.kudriavzevii等酵母菌相關，酸類和酯類物質主要與絲狀真菌及細菌相關，而水分、酸度、淀粉和還原糖含量基本維持恒定，為課題組進一步研究醬香型白酒堆積發酵機理提供了理論參考。