基于體外發酵模型分析植物多糖對T2DM患者腸道菌群及代謝的影響

賈麗娜，馬 倩，王新月，葛艷艷，王 楠，何紅鵬，羅學剛，朱立穎，賈衛國，郝力壯，齊 威,

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.浙江省農業科學院，浙江 杭州 310021；3.四川省第五人民醫院，四川 成都 610014；4.青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，青海省牦牛工程技術研究中心，青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病患者的90%～95%，是一種發病率和患病率都呈現快速增長的全球性流行病[1]。2019年全球糖尿病地圖（第9版）報告指出，2019年全球約有4.63億20～79 歲的成人患糖尿病。其中，中國糖尿病患者數量排在了印度和美國前面，位居第一，達1.164億[2]。T2DM的發病是環境和遺傳因素相互作用的結果，環境因素的影響大于遺傳因素。大量研究證明，腸道微生物失調作為一個重要的環境因素，在糖尿病發展中起著重要作用[1]。T2DM現在已成為第一個被定義腸道菌群特征的人類慢性疾病[3]，因此，靶向調節腸道微生物可能是改善T2DM的有效策略[4]。

多糖是重要的天然高分子化合物，廣泛存在于藥食同源植物中，也是中藥水煎液的關鍵生物活性成分，具有降血糖、抗氧化、免疫調節等生理作用，在改善T2DM等疾病方面發揮著重要作用[5]。由于人類基因組編碼的消化酶有限，多糖攝入人體后經口、胃、小腸等器官通常不被消化，最終進入結腸并被不同腸道微生物降解產生許多不同鏈長、結構構象和分支數量的低聚糖，這些低聚糖可以促進有益菌的生長，如雙歧桿菌和擬桿菌[6]。同時，這些低聚糖還能夠被腸道菌群代謝形成多種生物活性物質，如短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA）、乳酸、氫和二氧化碳等，進而影響宿主的生理狀態[7]。

大量研究報道植物多糖具有降血糖活性，雖然不同植物多糖的降糖機制存在差異，但其主要是在促進胰島素分泌、抑制胰島細胞凋亡、增強胰島素敏感性、降低胰島素抵抗、提高抗氧化應激能力、調節相關信號通路、調節腸道菌群等方面發揮作用，因此植物多糖可作為抗糖尿病的潛在藥物[8]。腸道菌群影響T2DM患者代謝的潛在機制主要有以下幾個方面[9]：一是調節炎癥，總的來說T2DM與促炎細胞因子、趨化因子和炎性蛋白水平有關，一些腸道微生物及其代謝物可以通過促進抗炎細胞因子和趨化因子分泌，同時抑制促炎細胞因子的分泌預防和改善機體的炎癥反應；二是降低腸道通透性，腸道通透性增加是T2DM的一個特征，它會導致腸道菌群代謝物易位進入血液并引起代謝性內毒素血癥，據報道，兩種對T2DM可能有益的擬桿菌（Bacteroides vulgatus和B.dorei）可通過調節結腸中緊密連接基因的表達，降低腸道通透性，減少脂多糖的生成，改善小鼠的內毒素血癥[10]；三是葡萄糖代謝，腸道菌群可以通過調節肝臟等主要代謝器官中的胰島素抵抗和葡萄糖穩態，以及腸道中的消化和控糖激素的產生影響T2DM，例如一種潛在益生菌（Bifidobacterium lactis）可以增加糖原合成并降低肝臟糖異生相關基因的表達[11]；四是脂肪酸氧化、合成和能量消耗，增加脂肪酸氧化和能量消耗并減少脂肪酸合成可改善肥胖和T2DM，據報道，Akkermansia muciniphila、B.acidifaciens、Lactobacillus gasseri和SCFA會增加脂肪組織中的脂肪酸氧化[12]；五是細菌間的綜合作用，一些微生物可以通過增加其他潛在的有益微生物或通過交叉喂養影響宿主生理，如Bifodobacterium的幾個菌種與其他菌群（如Faecalibacterium和Roseburia）具有交叉喂養作用[13]，L.rhamnosus可以增加大鼠盲腸中Bifidobacterium的豐度[14]，L.casei可以增加產丁酸細菌的豐度[15]。

本研究采用體外發酵模型，分析黃芪多糖、蒼術多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖5 種植物多糖對T2DM患者糞便微生物及其產氣情況、SCFA和代謝物質的影響，探究5 種多糖潛在的益生作用，以期為植物多糖與腸道菌群的相互作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪購買自甘肅岷縣，蒼術購買自內蒙古自治區，玄參、烏梅購買自云南大理，紅棗購買自新疆和田地區。

無水乙醇 天津市江天化工技術股份有限公司；核糖醇、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA）、甲氧胺鹽酸鹽 美國Sigma公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

-80 ℃冰箱 浙江捷盛低溫設備有限公司；超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；電子天平 美國康州電子科技有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；快速冷凍干燥機 德國Christ公司；旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；GC9720 plus氣相色譜儀 浙江福立分析儀器股份有限公司；HL-QT01體外發酵氣體分析儀 蘇州海路生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取及成分測定

原料用粉碎機粉碎置于錐形瓶中，按1∶8（g/mL）加入蒸餾水，混合均勻后于90 ℃條件下水浴6～7 h，用3 層紗布過濾后6000 r/min離心10 min得粗多糖提取液。用旋轉蒸發儀低于65 ℃濃縮粗多糖提取液，之后緩慢加入5 倍量（V/V）的95%乙醇溶液，過夜沉降，8000 r/min離心10 min，收集沉淀，靜置揮發殘留乙醇，-80 ℃預凍多糖溶液24 h以上后冷凍干燥，收集備用。黃芪多糖、蒼術多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖得率分別為9.48%、27.80%、5.62%、3.82%和10.40%。

對5 種多糖進行簡單的成分測定：采用苯酚-硫酸法測得黃芪多糖、蒼術多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖總糖質量分數分別為65.73%、91.13%、87.35%、25.60%、81.90%；采用Bradford法測得黃芪多糖、蒼術多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖蛋白質質量分數分別為0.79%、1.58%、2.19%、0.35%、2.59%。

1.3.2 糞便樣本采集及體外發酵

本實驗召集6 名志愿者，2 男4 女，年齡階段20～70 歲。實驗分為2 組：NC組，3 名正常人；T2DM組，3 名糖尿病人。所有志愿者近3 個月正常飲食，在這3 個月內沒有服用抗生素或益生菌等。研究人員對所有志愿者進行了全面解釋，并獲得了書面同意。并經四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會審核通過，批準號為2018（286）。

使用自動糞便處理儀將新鮮糞便（0.8±0.02）g加入到8 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，處理成10 g/100 mL的糞便懸濁液。吸取500 μL懸浮液分別接種于酵母浸粉-水解酪蛋白-脂肪酸（yeast extract-casein hydrolysate-fatty acids，YCFA）培養基和添加5‰多糖的YCFA培養基中，37 ℃厭氧培養24 h。

1.3.3 16S rRNA基因測序

取發酵液4 ℃、12000 r/min離心10 min，菌體沉淀送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，完成16S rRNA基因測序。

1.3.4 代謝組分析

取發酵液4 ℃、12000 r/min離心10 min，取200 μL上清液，加入20 μL核糖醇（內標），真空冷凍干燥。凍干樣品中加入50 μL含甲氧胺鹽酸鹽（20 mg/mL）的吡啶溶液，在40 ℃水浴肟化反應90 min，加入80 μL的MSTFA，在37 ℃水浴硅烷化反應30 min，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾溶液除去雜質后，進行氣相色譜-質譜檢測[16]。利用NIST05譜庫初步鑒定成分，結合化學成分的實際成分和保留時間等進行定性。采用面積歸一化法進行相對定量。

1.3.5 SCFA檢測

取500 μL發酵液加入100 μL巴豆酸偏磷酸溶液，振蕩混勻后-30 ℃酸化反應24 h，隨后將樣品于4 ℃、10000 r/min離心3 min，上清液過0.22 μm濾膜，使用氣相色譜儀分析乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸。利用外標法進行絕對定量。

1.3.6 氣體成分測定

利用氣體分析儀檢測發酵后樣品小瓶中CO2、CH4、H2、H2S氣體的體積。

1.4 數據處理與分析

所有樣品的測定均重復3 次。利用SPSS Statistics 22.0軟件對數據進行顯著性分析（P＜0.05），采用GraphPrism 8軟件繪圖，利用SIMCA 14.1軟件和Metaboanalyst 5.0網站（http://www.metaboanalyst.ca）進行代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 植物多糖對腸道菌群產氣情況的影響

人體腸道氣體圖譜在很大程度上取決于微生物組成和底物[17]，因此，利用體外發酵技術評估腸道微生物利用植物多糖產生的氣體情況。相較于正常人，T2DM患者腸道菌群發酵多糖產氣體積有所減少，CO2、H2、CH4、H2S含量也減少（表1）。不同植物多糖對腸道菌群代謝產氣作用有差異，烏梅多糖降低了各組的產氣體積和H2S產量，其余多糖組的產氣量均有增加。5 種多糖均能降低NC組的H2S含量。5 種多糖均能提高T2DM組的CO2和CH4含量，降低H2S含量，紅棗多糖能夠提高T2DM組H2含量。T2DM患者腸道微生物發酵蒼術多糖產生的CO2含量最高，發酵紅棗多糖產生CH4、H2和H2S含量最高。結果表明添加植物多糖能夠影響腸道菌群產氣情況，因此，植物多糖可能通過調節腸道中細菌產生的氣體成分及含量對宿主產生影響。

表1 植物多糖對腸道菌群體外發酵產氣的影響Table 1 Effects of plant polysaccharides on gas production by fermentation of intestinal bacteria in vitro

2.2 植物多糖對腸道菌群產生SCFA的影響

T2DM患者腸道菌群體外發酵產生SCFA水平顯著低于正常人（表2）。5 種植物多糖均能夠提高T2DM組的SCFA總量、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸含量，尤其是以黃芪多糖、蒼術多糖和玄參多糖效果顯著。紅棗多糖、蒼術多糖對T2DM組乙酸具有一定的調節作用，分別提高了20.29%、75.01%。紅棗多糖、黃芪多糖、蒼術多糖和玄參多糖對T2DM組丙酸具有一定的調節作用，分別提升了130.80%、259.06%、185.33%和248.01%。SCFA作為腸道細菌產生的代謝物，介導人體和腸道微生物之間的相互作用。SCFA是腸道菌群與宿主之間信號傳遞的重要物質，能夠增強屏障功能、維持免疫系統健康和降低腸腔內的氧含量等功能，對糖尿病具有益處[18]。植物多糖能夠影響腸道菌群代謝乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等含量，且可能通過調節腸道中細菌產生的SCFA成分及含量對宿主產生影響。

表2 植物多糖對SCFA濃度的影響Table 2 Effects of plant polysaccharides on SCFA contents μmol/mL

2.3 植物多糖對腸道菌群代謝組的影響

利用氣相色譜-質譜代謝組學技術對所有樣品的代謝物進行分析，共檢測到105 種代謝產物，其中包括有機酸類（39 種）、氨基酸類（23 種）、糖類（2 種）、醇類（12 種）、酯類（2 種）、酚類（1 種）、核酸類（3 種）、胺類（9 種）。應用正交偏最小二乘判別分析方法，結果顯示樣品能明顯區分，說明不同處理組的代謝物有差異，菌群的代謝情況發生改變（圖1）。

圖1 正交偏最小二乘判別分析圖Fig.1 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis

與NC組相比，T2DM患者腸道菌群體外發酵組17 種代謝物發生了顯著變化：木糖醇、亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、尸胺、焦谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、D-焦谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、乳酸、5-氨基戊酸。其中前16 種代謝物相對于NC組顯著上調，5-氨基戊酸顯著下調。顯著性差異代謝物主要與氨基酸代謝通路相關，包括谷胱甘肽代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，谷氨酰胺和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，酪氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化。

多糖處理能夠改變T2DM患者菌群體外發酵的代謝圖譜。烏梅多糖、紅棗多糖、玄參多糖、黃芪多糖和蒼術多糖處理組都顯著上調了乳酸、D-焦谷氨酸，下調了尸胺。值得注意的是，不同多糖對代謝的影響存在差異性。黃芪多糖組上調了丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸，下調了尸胺；蒼術多糖組上調了甘氨酸、亮氨酸，下調了脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、尸胺；玄參多糖組下調了纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸；烏梅多糖組上調了木糖醇，下調了纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸；紅棗多糖組上調了甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，下調了苯丙氨酸、脯氨酸。

2.4 植物多糖對腸道菌群結構的影響

2.4.1 多樣性分析

如圖2所示，曲線平緩顯示測序的數據準確可靠。α多樣性分析常用Chao指數和ACE指數衡量群落豐富度，這兩個指數越高表明微生物的豐度越高。如圖3所示，T2DM組與NC組間的α多樣性指數無顯著差異，這與已報道的研究結果一致[19]；經過多糖處理后，α多樣性指數也無明顯差異。如圖4所示，β多樣性分析顯示不同處理組樣品兩兩分離，說明不同處理組的微生物組成存在差異性，腸道菌群組成發生了一定程度的改變。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves

圖3 α多樣性分析Fig.3 α Diversity analysis

圖4 主坐標分析Fig.4 PCoA analysis

2.4.2 腸道微生物組成分析

Venn圖是統計多個組別中所共有和獨有的物種數目，可以比較直觀地看出不同環境樣本中物種組成情況。腸道菌群在屬水平上分布的結果見圖5，NC組共152 個屬、T2DM組含有108 個屬，黃芪多糖+NC組含有122 個屬（特有屬5 個）、黃芪多糖+T2DM組102 個屬（特有屬11 個），烏梅多糖+NC組含有180 個屬（特有屬27 個）、烏梅多糖+T2DM組含有138 個屬（特有屬18 個），蒼術多糖+NC組含有128 個屬（特有屬4 個）、蒼術多糖+T2DM組含有93 個屬（特有屬7 個），紅棗多糖+NC組含有128 個屬（特有屬10 個）、紅棗多糖+T2DM組含有93 個屬（特有屬2 個），玄參多糖+NC組含有129 個屬（特有屬4 個）、玄參多糖+T2DM組含有102 個屬（特有屬7 個）。

圖5 Venn圖分析Fig.5 Venn diagram analysis

腸道菌群在種水平上分布的結果顯示，NC組共252 個種、T2DM組含有171 個種、黃芪多糖+NC組含有207 個種（特有種12 個）、黃芪多糖+T2DM組167 個種（特有種18 個），烏梅多糖+NC組含有298 個種（特有種49 個）、烏梅多糖+T2DM組含有212 個種（特有種29 個），蒼術多糖+NC組含有219 個種（特有種11 個）、蒼術多糖+T2DM組含有154 個種（特有種9 個），紅棗多糖+NC組含有217 個種（特有種17 個）、紅棗多糖+T2DM組含有157 個種（特有種8 個），玄參多糖+NC組含有230 個種（特有種4 個）、玄參多糖+T2DM組含有167 個種（特有種7 個）。不同多糖處理組樣品間微生物組成存在差異，植物多糖發酵可能對微生物菌落結構和物種組成有影響。

2.4.3 腸道微生物相對豐度顯著差異的分析

腸道菌群在門水平上組成主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）。由圖6A可知，5 種植物多糖都提高了Firmicutes豐度、提高了NC組Bacteroidota豐度、降低了T2DM組Bacteroidota豐度。烏梅多糖顯著降低了Actinobacteriota豐度。5 種植物多糖降低Bacteroidota豐度，并增加Firmicutes豐度，與滇黃精中的總多糖作用類似，多糖可以在門水平上改善腸道的微生態環境[20]。

由圖6 B 可知，與T2 DM 組相比，植物多糖+T2DM組均提高了Faecalibacterium、Roseburia的豐度，降低了Escherichia的豐度，表明5 種多糖能夠富集Faecalibacterium、Roseburia；同時除烏梅多糖外，其他多糖均能夠提高Megamonas的豐度；黃芪多糖+T2DM組提高Bifidobacterium、Bacteroides、Akkermansia豐度，降低Ruminococcus豐度；玄參多糖+T2DM組提高Bacteroides豐度；紅棗多糖+T2DM組提高Bifidobacterium、Akkermansia豐度，降低Ruminococcus豐度；烏梅多糖+T2DM組提高Blautia的豐度；蒼術多糖+T2DM組提高Bifidobacterium、Akkermansia豐度。Escherichia coli能夠促進糖尿病，而Akkermansia和Bifidobacterium對T2DM具有改善作用，B.longum、B.infantis、B.Animals、B.carinii、B.brevis等都顯示對糖耐量有所改善[3,21]。簡言之，植物多糖能夠改善菌群結構，促進有益微生物的生長，抑制有害微生物的增長。

圖6 群落組成分析Fig.6 Analysis of intestinal microbial composition

2.4.4 腸道菌群功能預測

對測序結果樣本中微生物群落的功能組成進行預測（圖7），豐度較高的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路包括氨基酸生物合成、氨基酸和核苷酸糖代謝、ABC轉運蛋白、碳代謝、次生代謝產物的生物合成、嘌呤代謝。此外，與T2DM組相比，紅棗多糖+T2DM、蒼術多糖+T2DM、烏梅多糖+T2DM組下調了苯丙氨酸代謝。黃芪+T2DM組下調了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等代謝通路。紅棗+T2DM組下調了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、磷酸轉移酶系統等代謝通路。氨基酸代謝與糖尿病風險相關[22]。多糖可能通過影響腸道菌群的氨基酸代謝途徑，進一步對宿主發揮作用。

圖7 KEGG功能豐度統計Fig.7 KEGG functional abundance statistics

2.5 多組學聯合分析

應用多組學聯合分析，對NC、T2DM和加糖實驗組的腸道菌群與氣體成分、SCFA和差異性代謝物繪制熱圖（圖8）。玄參多糖組中甘氨酸與Ruminococcus呈正相關；戊酸與Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關；異丁酸與Alistipes呈正相關；異戊酸與Phascolarctobacterium、Eggerthella、Escherichia-Shigella、Negativibacillus呈正相關；5-氨基戊酸與Phascolarctobacterium、Bilophila呈正相關；尸胺與Dorea呈正相關；H2與Collinsella呈負相關，與Subdoligranulum、Klebsiella呈正相關；H2S與Dorea、Escherichia-Shigella、Enterococcus正相關，與Bifidobacterium呈負相關；丙酸與Desulfovibrio呈正相關。

圖8 相關性熱圖分析Fig.8 Correlation heatmap

黃芪多糖組中甘氨酸與Lactobacillus、Bifidobacterium呈正相關，與E.coli、Escherichia-Shigella呈負相關；乳酸與Phascolarctobacterium呈負相關；丙氨酸與Desulfovibrionaceae呈負相關；異丁酸與Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關；5-氨基戊酸與Lactobacillales、Megasphaera呈正相關；戊酸與Clostridium_sensu_stricto_1、Oscillospiraceae_UCG-002、Romboutsia、Megasphaera、unclassified_o__Lactobacillales、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關；丁酸與unclassified_o__Lactobacillales、Megasphaera、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關；L-脯氨酸與Veillonella呈正相關；尸胺與Eggerthella、Escherichia-Shigella、Dorea呈正相關；H2與Subdoligranulum呈正相關，與Lactobacillus呈負相關；H2S與Lactobacillus呈負相關，與Escherichia-Shigella呈正相關。

蒼術多糖組中乳酸與Lachnospiraceae呈負相關；丙酸與Monoglobus呈負相關；H2與Lactobacillus呈負相關，與Subdoligranulum、Klebsiella呈正相關；H2S與Subdoligranulum呈正相關；戊酸與Oscillospiraceae_UCG-005、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關；異丁酸與Oscillospiraceae_UCG-002、Bilophila呈正相關，異戊酸與Dorea、Escherichia-Shigella、Phascolarctobacterium、Bilophila、unclassified_f__Desulfovibrionaceae呈正相關；5-氨基戊酸與Phascolarctobacterium、Bilophila、unclassified_f__Desulfovibrionaceae呈正相關；L-酪氨酸與Megamonas呈負相關；木糖醇與Escherichia-Shigella、Parabacteroides呈正相關；尸胺與Dorea、Eggerthella呈正相關；DL-苯丙氨酸與Streptococcus、Veillonella呈正相關；纈氨酸與Intestinibacter呈正相關；異亮氨酸與Eubacterium_hallii_group、Intestinibacter、Ruminococcus呈正相關；甘氨酸與Monoglobus、Intestinibacter呈正相關；D-焦谷氨酸與Streptococcus呈正相關；鳥氨酸與Rombutzia、Oscillospiraceae_UCG-002呈負相關。

烏梅多糖組中甘氨酸與Anaerostipes、Lactobacillus、Ruminococcus呈正相關；谷氨酸與Bilophila呈負相關，與Lachnospiraceae_ND3007_group呈正相關；H2S與Enterococcus、Escherichia-Shigella、Parabacteroides呈正相關，與Anaerostipes、Lactobacillus、Blautia、Lachnospira、Faecalibacterium、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG-001 呈負相關；丙酸與Agathobacter、Lachnospiraceae_UCG-001呈負相關；L-脯氨酸與Enterococcus、Escherichia-Shigella呈正相關，與Agathobacter、Faecalibacterium、Roseburia、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG-001呈負相關；尸胺與Escherichia-Shigella呈正相關，與Lachnospiraceae_UCG-001呈負相關；異丁酸與Bilophila呈正相關；乙酸與Parabacteroides呈正相關，與Lachnospiraceae_UCG-001呈負相關；異戊酸與Bilophila、Phascolarctobacterium呈正相關；5-氨基戊酸與Bilophila、Phascolarctobacterium呈正相關；H2與Anaerostipes、Lachnospira呈負相關；纈氨酸與Lachnospiraceae呈負相關；苯丙氨酸與Lachnospiraceae、Sutterella呈負相關；焦谷氨酸與Lachnospira、Faecalibacterium、Roseburia、norank_f__Ruminococcaceae呈負相關，與Bifidobacterium呈正相關；L-酪氨酸與Parabacteroides呈正相關，與Faecalibacterium呈負相關；戊酸與Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關；異亮氨酸與Sutterella呈負相關。

紅棗多糖組中H2S與Dorea、Escherichia-Shigella呈正相關；戊酸與Romboutsia、Ruminococcus、Oscillospiraceae_UCG-002、Megasphaera、unclassified_o__Lactobacillales呈正相關；異丁酸與Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關；異戊酸與Phascolarctobacterium、Bilophila呈正相關；尸胺與Dorea呈正相關；5-氨基戊酸與Desulfovibrionaceae、Phascolarctobacterium、Bilophila呈正相關；甘氨酸與Lactobacillus呈正相關；乳酸與Lachnospiraceae、Faecalibacterium、Lachnospira、Ruminococcus_torques_group呈負相關；谷氨酸與Sutterella呈負相關。

3 討論

腸道菌群被稱為“第二個人類基因組”，作為機體的一種內部環境因素，它能調節人體內的新陳代謝，起到多種作用[9]。正常生理狀態下，這些微生物與人體共生，相互依賴且相互制約，保持動態平衡，以此維持人類身體健康。如果出現病理因素將這種平衡打破時，就會引起糖尿病等諸多疾病。多糖作為腸道菌群的碳源，能夠促進有益菌群生長，同時多糖能夠被腸道菌群碳水化合物活性酶分解后轉化為次生代謝物或發酵產物被機體吸收，進而影響宿主細胞增殖和凋亡，調節免疫反應，改變宿主代謝[23]。腸道菌群對多糖的利用降解是多糖活性的基礎，因此，以腸道菌群為媒介，探索多糖的作用機制是研究多糖功能的主要方向之一。

在本研究中，通過腸道菌群功能預測和代謝數據揭示了5 種植物多糖能夠調節微生物組成，進一步影響產氣情況、氨基酸代謝和SCFA代謝通路，與之前有關報道一致[24]。盡管許多研究分析了不同人群的腸道菌群與T2DM的關系[25]，但糖尿病人和健康人腸道菌群差異方面的研究結果不一致。Larsen等[26]發現，T2DM患者中Firmicutes和梭菌類的比例顯著降低；而巴基斯坦的一項基于60 人的數據顯示，T2DM患者的Firmicutes、梭菌門和陰性菌門占主導地位[27]。同時有研究發現T2DM患者的Firmicutes和Actinobacteriota的相對豐度均有增加，而Bacteroidota相對豐度則有降低，條件致病菌和硫酸鹽還原菌富集，雙歧桿菌和擬桿菌等益生菌和丁酸鹽產生菌減少[28]。Le等[29]發現，T2DM患者腸道內雙歧桿菌數量明顯低于健康人，而糞腸球菌數量高于健康人。另一方面，Doumatey等[30]報道T2DM患者的豐富度顯著降低，β多樣性指標的顯著差異，而Ahmad[27]和Chavez-Carbajal[25]等觀察到α多樣性指數沒有顯著差異。在本研究中，α多樣性分析T2DM患者菌群豐度與正常人相比無顯著變化，5 種植物多糖干預T2DM患者菌群豐度也無顯著差異；β多樣性分析5 種植物多糖干預正常人和T2DM患者的菌群組成在一定程度上有所改變，同時提高了兩組的Firmicutes豐度、降低了T2DM組Bacteroidota豐度，這些變化被認為與通過幫助宿主消化多糖或激活AMP激活的蛋白激酶加速能量吸收和體重增加有關[31]。黃芪多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bifidobacterium、Bacteroides、Akkermansia豐度，降低Ruminococcus豐度。玄參多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bacteroides豐度。紅棗多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bifidobacterium、Akkermansia的豐度，降低Ruminococcus豐度。烏梅多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Blautia菌的豐度。蒼術+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bifidobacterium、Akkermansia的豐度。Bifidobacterium、Bacteroides、Faecalibacterium為腸道益生菌，Roseburia和Faecalibacterium是丁酸產生菌 。Roseburia可以改善葡萄糖耐受性[33]。Roseburia、Faecalibacterium、Akkermansia和Blautia與T2DM呈負相關，而Ruminococcu與T2DM呈正相關[9]。乳酸桿菌可能參與糖尿病發展中的慢性炎癥，與葡萄糖、糖化血紅蛋白呈顯著正相關[28]。Akkermansia可能是一種潛在的治療糖尿病的益生菌，由于其在黏蛋白降解過程中的特殊表現，已成為腸道與宿主細胞之間的黏膜界面上的關鍵生物，與炎癥性腸病、肥胖、結腸炎、T2DM和其他代謝紊亂有關[21]。

腸道菌群能夠通過代謝產生CO2、H2、CH4、H2S等氣體介質對宿主健康產生影響。CO2和H2是微生物發酵碳水化合物過程中產生的主要氣體，CH4則是由大腸中古生菌代謝CO2和H2產生。H2S和含硫微量氣體是還原硫酸鹽和亞硫酸鹽的硫還原細菌發酵蛋白質產生的[34]。腸道細菌代謝產生氣體的同時也會消耗氣體，H2主要被產甲烷菌、產乙酸菌和硫酸鹽還原菌所利用；H2和CO2被產乙酸細菌利用產生乙酸，還能夠被產甲烷菌利用產生CH4。H2是碳水化合物發酵的主要氣體標記物，用于診斷碳水化合物吸收不良或小腸細菌過度生長，H2S也是蛋白質發酵的一個潛在有用的生物標志物。H2S可以直接通過中樞神經調節腸道蠕動。一般認為，腸道微生物群產生的H2很容易通過飲食調節，CH4的生成則更強烈地依賴于微生物群組成[17]。相比較于NC組，T2DM患者腸道菌群產氣體積減低，添加黃芪、蒼術、玄參、紅棗多糖能夠提高腸道菌群的產氣含量。烏梅多糖能夠降低各組的H2S產量，研究表明利用膳食纖維干預腸道菌群降解H2S有助于調節宿主糖代謝、改善T2DM 。

腸道菌群的改變可以調節SCFA和氨基酸的含量，改善腸道內環境，預防和治療糖尿病[36]。乙酸、丙酸和丁酸是腸道菌群利用碳水化合物發酵產生的主要代謝產物，是腸上皮細胞的重要能量來源，而屬于支鏈SCFA的異丁酸和異戊酸主要由分支氨基酸和到達結腸時未被消化的蛋白質被腸道微生物發酵利用所產生[37]。乙酸和丙酸主要由Bacteroidota產生，而大量的丁酸來自Firmicutes 。乙酸是含量最多的SCFA，作為能量來源參與機體代謝，它能到達外周組織，尤其是脂肪和肌肉，用于膽固醇代謝和脂肪合成，影響人體食欲。腸道微生物產生的丁酸可以改善機體的胰島素反應，進一步促進免疫調節，具有抗炎和抗癌作用。丙酸能夠調節膽固醇的合成，但是丙酸異常可能會增加T2DM的風險，但是丙酸與糖尿病風險之間的因果關系仍需要進一步的研究[33]。擬桿菌屬和雙歧桿菌屬能夠產生乙酸和丁酸，乙酸和丁酸與對應的受體結合，并誘導下游的胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2、酪酪肽的分泌，通過對胰腺功能以及胰島素釋放的影響，最終發揮降低血糖的作用[39]。此外，本研究數據也與之前的研究相符合，SCFA與產氣之間可能存在某種平衡[17]。5 種多糖發酵導致較多還原性丁酸的產生，也導致較多的還原劑H2的產生，增加了總體產氣量。多糖體外發酵影響T2DM患者腸道菌群氨基酸通路，丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸和己糖水平與T2DM風險正相關，并且T2DM可能會改變患者體內的酪氨酸和丁酸水平，調節酪氨酸代謝和丁酸的產生可能是改善T2DM預防的一種潛在方法[40]。苯丙氨酸代謝與胰島素抵抗有關，可能增加T2DM的風險[41]。在T2DM患者中，腸道菌群細胞膜對糖和支鏈氨基酸的轉運更為活躍，但丁酸的合成減少，與促炎反應直接相關的氧化應激反應激增。植物多糖可以通過糾正腸道菌群失調恢復腸道微生物生態、促進產SCFA微生物的富集、提高SCFA水平 。黃芪多糖、蒼術多糖和玄參多糖提高了T2DM組的乙酸、丁酸、丙酸水平。

4 結論

基于T2DM患者腸道菌群和植物多糖體外發酵模型，分析5 種植物多糖對微生物群落結構及其代謝圖譜的影響。本研究結果可以篩選得到更具有糖尿病功能食品潛力的植物多糖。在氣體成分方面，黃芪多糖、蒼術多糖、玄參多糖和紅棗多糖均能夠提高T2DM組的總氣體介質含量以及CO2和CH4含量，降低H2S含量，而烏梅多糖降低了總氣體介質；在SCFA方面，黃芪多糖、蒼術多糖、玄參多糖調節T2DM組總酸的含量更為顯著；在代謝物質方面，5 種多糖均能夠上調氨基酸等有益代謝物質；在腸道菌群方面，5 種多糖均能夠調節腸道菌群結構，增加有益菌的豐度。綜合結果來看，蒼術多糖、玄參多糖和黃芪多糖更具有發展為糖尿病功能食品的可能性。參照最新的藥食同源名錄，發現黃芪在特定的范圍和劑量內可作為藥食兩用，蒼術和玄參也均在可用于保健食品的中藥名單中，因此這3 種植物多糖在功能性食品開發方面具有廣闊前景，但是否能夠真正開發為功能食品，還需進一步進行動物實驗及臨床實驗。本研究為植物多糖對慢性代謝類疾病產品的開發和利用提供了理論基礎。