miR-216a通過下調(diào)CAPN6抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的研究

張賢雨，馬 歡，宋鳳麗，張志林

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院放療科，河北 張家口 075000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院放療科，北京 100029)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性癌癥的第二位。近年來隨著現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快，宮頸癌患者趨于年輕化，其對(duì)女性生育及健康造成嚴(yán)重危害[1]。宮頸癌的病因涉及致癌基因激活、抑癌基因抑制等多種復(fù)雜的分子機(jī)制，而宮頸癌患者預(yù)后較差及生存期短均與宮頸癌發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。因此，尋找宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展的相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志物，明確有效的分子靶點(diǎn)，對(duì)宮頸癌患者的臨床治療效率具有重要應(yīng)用價(jià)值[2-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是機(jī)體重要的非編碼單鏈小RNA分子，作為基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，其異常表達(dá)與腫瘤形成和進(jìn)展密切相關(guān)，已成為腫瘤分子靶向治療的研究熱點(diǎn)[4-5]。研究顯示，微小RNA-216a(microRNA-216a，miR-216a)在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤中異常表達(dá)并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其在宮頸癌中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚[6-8]。鈣激活中性蛋白酶(calcium activated neutral protease，CAPN)是一組細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴的半胱氨酸水解酶，可催化多種底物參與一系列細(xì)胞生物學(xué)過程[9]。鈣激活中性蛋白酶6(CAPN6)是非典型的CAPNs，主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物胚胎肌肉、胎盤，在出生后表達(dá)下降[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CAPN6在人子宮肉瘤、子宮肌瘤等生殖器官腫瘤組織中異常表達(dá)[11]，miR-216a可通過靶向抑制CAPN6表達(dá)而抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本研究探討了miR-216a對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及與CAPN6相關(guān)的作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1臨床資料

收集2019年5月至2021年5月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行手術(shù)治療的82例宮頸癌患者的宮頸癌組織及癌旁正常組織。患者年齡為28～59歲，平均年齡(42.53±7.16)歲，均經(jīng)病理檢測確診，術(shù)前未進(jìn)行化療、放療等治療。病理類型：宮頸腺癌19例(23.17%)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌63例(76.83%)；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期：Ⅰ期36例(43.90%)，Ⅱ期25例(30.49%)，Ⅲ期21例(25.61%)；癌旁正常組織距宮頸癌組織>3cm，病理證實(shí)無腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移等病變。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(K20190425082)，患者及家屬均知情同意。

1.2材料和試劑

人宮頸癌HeLa細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；miR-216a模擬物(miR-216a mimic)及模擬對(duì)照序列(mimic-NC)、CAPN6小干擾RNA(si-CAPN6)及亂序無意義陰性序列(si-NC)(廣州銳博生物科技公司)；CAPN6過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-CAPN6)及空載質(zhì)粒(pcDNA-NC)(美國Origene公司)；Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒；人膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；兔抗切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell CLL/lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、CAPN6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的IgG二抗(美國Abcam公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)

將人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素)，在37℃、5%CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取生長良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

HeLa細(xì)胞按1×106個(gè)/mL的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將miR-216a mimic、mimic-NC、si-CAPN6及si-NC轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，依次記為miR-216a mimic組、mimic-NC組、si-CAPN6組、si-RNA組；共轉(zhuǎn)染miR-216a mimic與pcDNA-NC、miR-216a mimic與pcDNA-CAPN6至HeLa細(xì)胞，記為miR-216a mimic+pcDNA-NC組、miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6組，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染且正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞為空白對(duì)照組(control組)。轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h后檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測宮頸癌組織、癌旁正常組織及HeLa細(xì)胞中miR-216a和CAPN6 mRNA表達(dá)

采用Trizol法提取組織和HeLa細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，采用qRT-RCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-RCR)實(shí)驗(yàn)，檢測宮頸癌組織、癌旁正常組織和HeLa細(xì)胞中miR-216a和CAPN6 mRNA的表達(dá)水平。

引物序列為：

miR-216a上游引物：5′-TGCGGTAATCTCAGCTTGGCA-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；CAPN6上游引物：5′-ACTATGGGTCCTCCTCTG-3′，下游引物：5′-AGCTGGTGGTTGCTAATG-3′；U6上游引物：5′-TGCG-GGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物：5′-CC-AGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

反應(yīng)條件：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，miR-216a以U6為內(nèi)參基因，CAPN6以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計(jì)算miR-216a和CAPN6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4蛋白質(zhì)印跡法分別檢測宮頸癌組織、癌旁正常組織及HeLa細(xì)胞中CAPN6蛋白表達(dá)

收集宮頸癌組織、癌旁正常組織和處理后的HeLa細(xì)胞，加入放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液于冰上提取細(xì)胞中總蛋白質(zhì)，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，沸水浴中煮沸變性，取定量變性蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sufate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，蛋白分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，在5%脫脂奶粉中封閉1h，用含1mL/L吐溫的Tris緩沖鹽溶液(Tris-buffered saline-Tween，TBST)洗膜，加入CAPN6(1∶800)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫下孵育1h，TBST洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影，暗室成像拍照，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 CCK-8法檢測HeLa細(xì)胞增殖活力

收集各組HeLa細(xì)胞，以2×103個(gè)/mL密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別常規(guī)培養(yǎng)24、48、72h后，每孔細(xì)胞加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀測定波長450nm處的吸光度值(optical density，OD值)，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.6流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞凋亡

將處理后的HeLa細(xì)胞以2×104個(gè)/mL接種于24孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24h，消化、固定細(xì)胞后，制備成單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用500μL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，分別加入5μL AnnexinV-FITC染液和10μL PI染液，混勻，室溫下避光反應(yīng)15min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.7蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Bax及Bcl-2的表達(dá)

檢測參照1.3.4中的方法；其中Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗均按1∶1 000稀釋。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 miR-216a和CAPN6在宮頸癌組織中的表達(dá)

在宮頸癌組織中，miR-216a mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(t=52.968，P<0.05)，見圖1A；而CAPN6 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(t=26.622，P<0.05)，見圖1B；宮頸癌組織中的CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(t=45.036，P<0.05)，見圖1C、圖1D。

注：※與癌旁正常組織比較P<0.05。圖1 miR-216a和CAPN6在宮頸癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-216a and CAPN6 in cervical cancer tissue

2.2過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活力的影響

control組、mimic-NC組、miR-216a mimic組的miR-216a mRNA相對(duì)表達(dá)量，以及HeLa細(xì)胞24、48、72h的增殖活力，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活力影響的比較Table 1 Comparison of effects of overexpression of miR-216a on proliferation activity of HeLa

兩兩比較：

mimic-NC組HeLa細(xì)胞中miR-216a mRNA相對(duì)表達(dá)量與control組比較無明顯差異(t=0.411，P>0.05)，miR-216a mimic組HeLa細(xì)胞中miR-216a mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于mimic-NC組和control組(t值分別為12.347和11.936，P<0.05)，表明miR-216a mimic成功轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞。

mimic-NC組HeLa細(xì)胞24、48、72h增殖活力與control組比較均無明顯差異(t值分別為0.662、0.765和0.235，P>0.05)，miR-216a mimic組HeLa細(xì)胞24、48、72h增殖活力均明顯低于mimic-NC組和control組(mimic-NC組：t值分別為9.276、8.033和13.906，P<0.05；control組：t值分別為9.938、8.798和13.670，P<0.05)。

2.3過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白的影響

control組、mimic-NC組、miR-216a mimic組的HeLa細(xì)胞凋亡率，以及HeLa細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

兩兩比較：

mimic-NC組HeLa細(xì)胞凋亡率與control組比較無明顯差異(t=1.001，P>0.05)；miR-216a mimic組HeLa細(xì)胞凋亡率均明顯高于mimic-NC組和control組(t值分別為22.825和23.827，P<0.05)，見表2、圖2A。

mimic-NC組HeLa細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量與control組比較均無明顯差異(t值分別為1.279、0.738和0.738，P>0.05)；miR-216a mimic組HeLa細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax相對(duì)表達(dá)量均明顯高于mimic-NC組和control組(mimic-NC組：t值分別為21.746和19.940，P<0.05；control組：t值分別為20.467和19.202，P<0.05)，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量均明顯低于mimic-NC組和control組(t值分別為22.895和23.633，P<0.05)，見表2、圖2B。

表2 過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白影響的比較Table 2 Comparison of effects of overexpression of miR-216a on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa

圖2 過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-216a on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa cells

2.4過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞中CAPN6表達(dá)的影響

control組、mimic-NC組、miR-216a mimic組的HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為58.990和156.820，P<0.05)。

兩兩比較：

mimic-NC組HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量與control組比較均無明顯差異(t值分別為0.565和0.594，P>0.05)，miR-216a mimic組HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于mimic-NC組和control組(mimic-NC組：t值分別為13.010和21.387，P<0.05；control組：t值分別為13.576和21.981，P<0.05)，見圖3。

注：*與mimic-NC組和control組比較P<0.05。圖3 過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞中CAPN6表達(dá)的影響Fig.3 Effect of overexpression of miR-216a on CAPN6 expression in HeLa cells

2.5下調(diào)CAPN6表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

control組、si-RNA組、si-CAPN6組的CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量，以及HeLa細(xì)胞24、48、72h的增殖活力，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

兩兩比較：

si-RNA組HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量與control組比較均無明顯差異(t值分別為0.288和0.594，P>0.05)，si-CAPN6組HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于si-RNA組和control組(si-RNA組：t值分別為16.454和19.604，P<0.05；control組：t值分別為16.743和19.010，P<0.05)，表明si-CAPN6成功轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，見圖4、表3。

圖4 HeLa細(xì)胞中CAPN6蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression level of CAPN6 protein in HeLa cells

si-RNA組HeLa細(xì)胞24、48、72h增殖活力與control組比較均無明顯差異(t值分別為1.414、0.397和0.235，P>0.05)；si-CAPN6組HeLa細(xì)胞24、48、72h增殖活力均明顯低于si-RNA組和control組(si-RNA組：t值分別為14.142、11.523和14.849，P<0.05；control組：t值分別為12.727、11.126和14.613，P<0.05)，見表3。

表3 下調(diào)CAPN6表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活力影響的比較Table 3 Comparison of effects of down-regulation ofCAPN6 expression on proliferation activity of HeLa

2.6下調(diào)CAPN6表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

control組、si-RNA組、si-CAPN6組的HeLa細(xì)胞凋亡率，以及HeLa細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

兩兩比較：

si-RNA組HeLa細(xì)胞凋亡率與control組比較無明顯差異(t=0.112，P>0.05)；si-CAPN6組HeLa細(xì)胞凋亡率均明顯高于si-RNA組和control組(t值分別為26.708和26.595，P<0.05)，見圖5A、表4。

si-RNA組HeLa細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量與control組比較均無明顯差異(t值分別為0.639、0.738和0.594，P>0.05)；si-CAPN6組HeLa細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax相對(duì)表達(dá)量均明顯高于si-RNA組和control組(si-RNA組：t值分別為24.304和28.803，P<0.05；control組：t值分別為24.944和29.542，P<0.05)，而Bcl-2相對(duì)表達(dá)量均明顯低于si-RNA組和control組(t值分別為22.575和23.169，P<0.05)，見圖5B、表4。

圖5 下調(diào)CAPN6表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of down-regulation of CAPN6 expression on HeLa cell apoptosis

表4 下調(diào)CAPN6表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白影響的比較Table 4 Comparison of effects of down-regulation of CAPN6 expression on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa

2.7過表達(dá)CAPN6逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的作用

miR-216a mimic組、miR-216a mimic+pcDNA-NC組、miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6組的CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量，以及HeLa細(xì)胞24、48、72h的增殖活力，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

兩兩比較：

miR-216a mimic+pcDNA-NC組HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量與miR-216a mimic組比較均無明顯差異(t值分別為0.411和1.294，P>0.05)，miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6組HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于miR-216a mimic+pcDNA-NC組和miR-216a mimic組(miR-216a mimic+pcDNA-NC組：t值分別為10.084和14.880，P<0.05；miR-216a mimic組：t值分別為9.672和16.174，P<0.05)，表明pcDNA-CAPN6成功轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，見圖6、表5。

圖6 HeLa細(xì)胞中CAPN6蛋白表達(dá)水平Fig.6 Expression level of CAPN6 protein in HeLa cells

miR-216a mimic+pcDNA-NC組HeLa細(xì)胞24、48、72h增殖活力與miR-216a mimic組比較均無明顯差異(t值分別為1.575、0.915和0.323，P>0.05)；miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6組HeLa細(xì)胞24、48、72h增殖活力均明顯高于miR-216a mimic+pcDNA-NC組和miR-216a mimic組(miR-216a mimic+pcDNA-NC組：t值分別為7.090、5.947和12.939，P<0.05；miR-216a mimic組：t值分別為5.514、5.032和13.263，P<0.05)，見表5。

表5 過表達(dá)CAPN6逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活力影響的比較Table 5 Comparison of effects of overexpression of CAPN6 on proliferation activity of HeLa cells by reversing overexpression of

2.8過表達(dá)CAPN6逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的作用

miR-216a mimic組、miR-216a mimic+pcDNA-NC組、miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6組的HeLa細(xì)胞凋亡率，以及HeLa細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

兩兩比較：

miR-216a mimic+pcDNA-NC組HeLa細(xì)胞凋亡率與miR-216a mimic組比較無明顯差異(t=0.944，P>0.05)；miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6組HeLa細(xì)胞凋亡率均明顯低于miR-216a mimic+pcDNA-NC組和miR-216a mimic組(t值分別為11.739和12.684，P<0.05)，見圖7A、表6。

miR-216a mimic+pcDNA-NC組HeLa細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量與miR-216a mimic組比較均無明顯差異(t值分別為1.489、0.594和0.688，P>0.05)；miR-216a mimic+pcDNA-CAPN6組HeLa細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax相對(duì)表達(dá)量均明顯低于miR-216a mimic+pcDNA-NC組和miR-216a mimic組(miR-216a mimic+pcDNA-NC組：t值分別為20.359和21.981，P<0.05；miR-216a mimic組：t值分別為21.848和21.387，P<0.05)，而Bcl-2相對(duì)表達(dá)量均明顯高于miR-216a mimic+pcDNA-NC組和miR-216a mimic組(t值分別為33.724和34.412，P<0.05)，見圖7B、表6。

表6 過表達(dá)CAPN6逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白影響的比較Table 6 Comparison of effects of overexpression of CAPN6 on apoptosis rate and apoptotic protein of HeLa cells by reversing overexpression of

圖7 過表達(dá)CAPN6逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-216a對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Overexpression of CAPN6 reversed the effect of overexpression of miR-216a on HeLa cell apoptosis

3討論

3.1過表達(dá)miR-216a抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡

miRNAs是一類新興的基因調(diào)節(jié)因子，參與了包括癌癥在內(nèi)的許多生理和病理過程。近年來，人們對(duì)miRNAs在癌癥生物學(xué)中的重要作用進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs靶基因范圍廣泛，可通過負(fù)性基因調(diào)控維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。miRNAs作為腫瘤抑制因子和癌基因可參與各種癌癥的發(fā)生進(jìn)展。因此，調(diào)控miRNAs表達(dá)可作為宮頸癌、乳腺癌等多種癌癥的治療靶點(diǎn)[13-15]。miR-216a作為miRNA成員之一，被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中異常表達(dá)。miR-216a在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，并通過靶向JAK2抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展[16]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中miR-216a表達(dá)均下調(diào)，其通過靶向調(diào)節(jié)EIF4B抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。此外，miR-216a在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，通過直接靶向TLR4發(fā)揮抑癌作用[18]。本研究檢測了miR-216a在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中miR-216a表達(dá)顯著下調(diào)，而過表達(dá)miR-216a能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，并通過調(diào)控凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；提示miR-216a可能作為抑癌基因參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

3.2下調(diào)CAPN6表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡

CAPN6位于X染色體，是非經(jīng)典型CAPNs家族的成員之一，其在維持細(xì)胞穩(wěn)定性、控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散，以及抑制骨骼肌分化、抗凋亡等方面發(fā)揮作用。Hong等[19]報(bào)道CAPN6是糖皮質(zhì)激素的靶分子，通過細(xì)胞骨架重組和微管的乙酰化調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞吸收。Rho等[20]報(bào)道CAPN6通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成促進(jìn)腫瘤發(fā)生。說明CAPN6在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡和骨架動(dòng)力學(xué)方面起到一定的作用。既往研究顯示，子宮平滑肌瘤中過度表達(dá)的CAPN6與其他異常表達(dá)因子相互作用，通過相關(guān)的生化途徑導(dǎo)致正常子宮肌層的病理變化[21-22]。最新研究發(fā)現(xiàn)，CAPN6的下調(diào)抑制子宮平滑肌瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。Lee等[24]發(fā)現(xiàn)CAPN6在子宮頸腫瘤的組織中過度表達(dá)，參與了子宮頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明，CAPN6在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，而下調(diào)CAPN6表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)下調(diào)CAPN6表達(dá)可增加Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)。該結(jié)果證實(shí)了CAPN6參與宮頸癌的發(fā)生，其有望成為治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)。

3.3 miR-216a通過下調(diào)CAPN6表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡

CAPN6在腫瘤中作為一種潛在的致癌基因，受磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路調(diào)控，抑制癌細(xì)胞凋亡[25]。但CAPN6受miRNAs調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中CAPN6是miR-449a的新靶基因，miR-449a可通過下調(diào)CAPN6抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯和細(xì)胞凋亡。本研究探索宮頸癌中miR-216a與CAPN6的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-216a mimic升高HeLa細(xì)胞中miR-216a表達(dá)水平后，HeLa細(xì)胞中CAPN6 mRNA和CAPN6蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，表明過表達(dá)miR-216a可顯著下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中CAPN6表達(dá)水平。miR-216a通過靶向調(diào)控多種基因參與腫瘤細(xì)胞生理學(xué)過程。miR-216a通過直接靶向磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移[27]。乳腺癌中miR-216a通過靶向PKCα促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[28]。miR-216a還通過靶向調(diào)控PD-L1和MALAT1基因在肺癌、胰腺癌等腫瘤中發(fā)揮作用[29-30]。本研究將miR-216a mimic與pcDNA-CAPN6共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞增殖活力明顯升高，細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高；提示上調(diào)CAPN6表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-216a對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)的作用。本研究結(jié)果顯示miR-216a可能通過靶向CAPN6調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡。

綜上所述，miR-216a在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，其在宮頸癌中可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用，可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)CAPN6表達(dá)有關(guān)。miR-216a有望成為宮頸癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。