精液分析質量控制方法專家共識

盧文紅，蔡靖，孫瑩璞，孫海翔，鄧成艷，劉平，周燦權，馮云，郝桂敏，全松，沈浣，師娟子，滕曉明，王曉紅，王秀霞，伍瓊芳，曾勇，張松英，鐘影，黃學鋒，黃國寧

(中華醫學會生殖醫學分會第五屆委員會)

一、背景與目的

精液分析是評估男性生育力的重要方法，也是輔助生殖治療策略制定、避孕節育效果評估、男科疾病診斷、療效觀察的依據。

由于精液分析高度復雜，操作難以標準化，因此必須進行質量控制以發現并糾正系統誤差和結果的高度變異性。不同實驗室間在精子濃度和形態學評價上的巨大差異使強化質控和標準化的需求更加迫切[1]。

為了進一步規范精液分析的實驗室操作，提高精液分析的質量和提高結果的可比性，滿足業界的迫切需求，促進男性生殖醫學的發展，為患者提供更優質的臨床醫療服務，制定本共識。本共識目前包括了精液分析中部分項目的質量控制，隨著現有項目質量控制方法的應用和不斷改進，以及計算機輔助精子分析(Computer-aided sperm analysis，CASA)、精漿生化等其他精液分析項目質量控制方法的不斷完善和實踐，將對本共識進行修訂和更新。

二、方法

根據國內外精液分析的發展現狀，參考了《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第4版/第5版/第6版、ISO15189-2012《醫學實驗室質量和能力認可準則》、CNAS-CL02-A001 2021《醫學實驗室質量和能力認可準則的應用要求》、GB/T 27043—2012《合格評定能力驗證的通用要求》、GB/T 20468—2006《臨床實驗室定量測定室內質量控制指南》、CNAS-GL03-2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》、WS/T 641—2018《臨床檢驗定量測定室內質量控制》、《臨床檢驗質量控制技術》、《男科實驗室診斷技術》、《輔助生殖男性技術》、中華醫學會發布的《制訂/修訂<臨床診療指南>的基本方法和程序》、《CSRM指南共識的制定規范(2016)》等，系統檢索了CNKI、萬方、PubMed以及Cochrane library等數據庫，結合長期的實踐經驗，參考國內男性生殖及男科學實驗室專家意見，制定本共識。

1.共識發起和支持單位：按照中華醫學會共識制定要求[2]，本共識由中華醫學會生殖醫學分會發起，生殖男科與精子庫管理學組組織和撰寫。

2.共識注冊與計劃書撰寫：本共識已在國際實踐指南注冊平臺(International Practice Guidelines Registry Platform，IPGRP)國內版進行了注冊(注冊號為IPGRP-2018CN014)，讀者可聯系該注冊平臺索要指南的計劃書。

3.共識使用者與目標人群：本共識適用于開展精液分析的各級醫學、生物學實驗室。共識的使用人群為從事精液分析的臨床檢驗、生殖醫學中心、人類精子庫、男科實驗室等技術人員及科研人員等。

4.問題的來源：本共識的問題來源于自2011年以來參加《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版標準化操作與質量控制培訓的學員填寫的調查問卷、培訓中和工作中學員遇到并咨詢的問題、國內外文獻總結以及長期實踐中總結的經驗。

三、共識建議

精液分析質量控制包括內部質量控制和外部質量控制。

精液分析內部質量控制是實驗室內為達到質量要求的操作技術和活動。目的在于監測過程，以評價檢驗結果是否可靠、可以發出，以及排除質量環節中所有階段中導致不滿意結果的原因。內部質控監控著精確性。廣義上的內部質控適用于獲得檢驗結果所有步驟的活動，從考慮臨床需要，通過收集標本，檢測可測之量來報告結果。精液分析的內部質量控制可分為分析前、分析中、分析后質量控制。

精液分析外部質量控制是由實驗室外的某一機構執行的客觀地評價各實驗室對發放質控標本的檢測結果，從而對各實驗室的檢驗質量進行監測和評價。目的是評價檢驗的準確性，加強各實驗室間結果的一致性，建立室間可比性。通過外部質量評價發現系統誤差，得以糾正后便可明顯提高準確度[3-4]。

1.精液分析內部質量控制包括哪些內容？

1.1分析前質控

實驗室檢測人員的培訓：每個實驗室檢測人員都應對精液分析標準化操作程序，對質量控制的重要性、基礎知識、質量控制的方法有較充分的了解，接受理論與實操培訓，并在質量控制的實際工作中不斷進行培訓提高[5-6]。

建立標準操作規程：所有臨床實驗室都應建立一套較完整的標準操作規程(Standard Operation Procedure，SOP)。例如儀器的使用、維護操作規程，試劑、質控品、校準品等的使用操作規程等[5]。

患者的準備、標本的采集、運輸、接收、處理應遵照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第6版[7]標準進行。

校準：對測定精液樣品的儀器要按一定要求進行校準；對不同的分析項目要根據其特性確立各自的校準頻率[5，7]。

質控品：質控品可分為商品化質控品或自制質控品。定性檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和/或陽性質控品；定量檢測項目，應至少使用兩個水平(正常和異常水平)的質控品。質控品應與患者待測樣本具有相似或相同的基質。實驗室可自制質控品，質控品應均一和穩定，如條件允許，可儲存一年或以上的用量。自制的質控品須進行均勻性檢驗，對于性質較不穩定的自制質控品則還須進行穩定性檢驗。所選質控品的指定值應位于臨床有意義的范圍內[2，7-8]。

統計學質控方法的選擇：應根據質控目的選擇統計學質控方法。

1.2分析中質控

內部質控的實際操作過程應貫徹質量管理體系文件，按照標準操作規程將質控品與樣本共同檢測，并遵循減小抽樣誤差、分析技術員自身和之間差異等程序進行。

1.3分析后質控

對質控結果進行記錄、統計分析及繪制質控圖等；根據質控規則確定是否在控；失控情況的處理及原因分析；對內部質控數據進行管理；PDCA循環；審核測定結果，與臨床醫生對話。

2.如何對精液分析的主要儀器設備進行質控？

精液分析的儀器設備主要包括：精子計數板、精密移液器、相差顯微鏡、CASA、天平、細胞分類計數器、恒溫設備、混勻儀、冰箱等。移液器、計數板和其他儀器應當每隔6個月或每年校準一次[1，7]。

2.1精子計數板及校準：WHO推薦使用改良Neubauer血細胞計數板進行精子計數。使用顯微鏡細準焦螺旋(Vernier scale)測量計數池的深度。重復計數10次，并計算均值、SD和CV(=100×SD/均值)。檢查精確度(確保標稱深度處于測定所得均值的2SD之內)。

2.2精密移液器的選擇及校準：原則上應采用正向置換型移液器進行精液分析操作。可由第三方進行外部校準，也可通過吸取純水并稱重的方式自行校準。水的密度按1 g/ml計算，根據吸取水的重量計算預期體積。重復測量方法同2.1。

2.3 天平的校準：應該定期使用內部校準砝碼校正天平，或由第三方進行外部校準。通過稱量外部標準砝碼來校準天平。重復測量方法同2.1。

2.4恒溫箱：應使用溫度計來核查恒溫箱和顯微鏡加溫載物臺的溫度。溫度計應定期校準。

2.5 pH 試紙：應用已知pH的標準液進行檢測。

2.6計算機輔助精液分析系統(CASA)及質控：影響CASA分析儀性能的因素很多，包括CASA本身的硬件、軟件配置、樣本制備、精子濃度、計數池深度和標準化操作過程等。因此，需對CASA分析儀及操作過程進行標準化及質量控制[7-12]。

硬件部分，需配置三目正相差顯微鏡、數字口攝像機、玻璃恒溫部件等。此外，有條件的實驗室，宜配置可同時放置多個玻片的全自動顯微鏡，減少人工主觀因素。

軟件部分：要求有配套的質控系統，具備對比分析流程和重復測量差異可接受性評估功能；形態學分析支持將精子各部切割及測量參數；分析結果可人工修正。宜采用人工智能(Artificial Intelligence，AI)算法提高精子和雜質區分度，精子追蹤準確性，以及形態學分割和判定的準確性。

應參照CASA分析儀的使用指南進行操作，所有操作人員都應接受規范的CASA分析儀使用培訓，并了解其長處與不足。

在使用CASA分析儀獲取精子運動參數時，所選擇的視野應涵蓋計數池的各個區域，建議每個計數池應至少分析6個視野(總共12個視野)，每個計數池樣本應分析至少200個活動精子(總共400個活動精子)的運動軌跡。使用深度為20 μm的一次性計數池可獲得可靠的精子活力結果，通常要評估兩個計數池的精子。觀察泳動精子的持續時間會對結果產生顯著影響，時間應不少于1 s[7]。

關于計算機輔助精子形態測量分析(CASMA)，自動精子形態學分析系統比手工評估在客觀性、精確性和可重復性方面具有潛在優勢。CASMA必須使用標準化程序和設備、以及進行質量控制，以確保得到可比且可靠的結果。

3.精液分析質控品的制備原則有哪些？

理想的質控品應涵蓋所在實驗室檢測的所有精液樣本的檢測范圍。應選擇那些有臨床意義的質控樣本。目前可得到的商品化精液分析質控品只有精子計數的質控珠。自制的質控品具有可得性、涵蓋范圍大、廉價、方便等優點[1，7]。

為確保不滿意的內部質控結果不歸咎于質控樣品之間或本身的變異性，內部質控的質控品通常必須進行均勻性檢驗，穩定性檢驗則可根據樣品的性質和計劃的要求來決定。對于性質較不穩定的質控品，以及傳遞周期較長的測量物品，穩定性檢驗是必不可少的[13]。

精子濃度質控品，可以稀釋并儲存不同精子濃度的精液標本。將若干份標本合并以達到某一特定濃度或某一更大體積的稀釋標本，需選擇質量好、沒有凝集、聚集，細胞碎片、顆粒等雜質少的樣本，上游精子或去除精漿及洗滌的方式可減小發生精子聚集的可能性[14]。

精子形態學評估的質控品，可以用幾個不同的精液樣本，每個樣本制備多張涂片，代表實驗室常規形態學評估時所見的一系列精子形態。可根據質控計劃的需求，選擇使用空氣干燥的精液涂片、固定后的精液涂片或經固定和染色的精液涂片等，以用于監測染色過程、分析程序、評估標準等不同質控內容使用。經過巴氏染色并封片的涂片在室溫條件下避光貯存，其穩定性可以保持數月，甚至數年。在涂片制備的整個過程中必須充分混勻精液，以確保從一個特定精液樣本制備所得的所有涂片是完全一致的。這樣可以假設在分析過程中發現的任何較大變化都來自被監測的過程(即形態學分析過程)，而不是由于在制片過程中沒有充分混勻精液所致。

存活率檢測，可使用伊紅-苯胺黑染色涂片。質控涂片應該從實驗室的常規標本中選取，并掩飾標識碼。質控片可以重復使用，一旦質量下降，應該重新制備。如果涂片制備和儲存得當，可以保持穩定數月甚至數年。在質控片更替的過渡時期，不同批次的質控片可以交替使用或互相重疊使用。

精子活力標本視頻可用于質控。錄像的放大倍數要與實際的標本分析時顯微鏡下所見一致。所有日常分析中所用的攝像機和顯示屏采用的是與視頻錄像時相同的放大倍數和對比度。

推薦使用新鮮精液作為精子活力的質控品。由于精子活力隨時間而下降，因此需要所有檢測人員在第一時間而且基本上同時進行評估。推薦有條件的實驗室使用多人共攬顯微鏡或有攝像機連接到顯示器的顯微鏡，可以使幾個檢測人員同時分析同一樣本的同一視野。

精液分析質控品的特性見表1。

表1 精液分析質控品的特性

各類質控品的具體制備方法可參照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第6版[7]。

4.如何減小精液分析中的抽樣誤差？

精液分析是從精液樣本中取出很少部分進行分析，并推算出整份樣本的精液參數結果，因此抽樣誤差是不可避免的。為了減小因抽樣誤差對分析結果的影響，提高結果的精確度和準確度，必須采取必要的措施[7]。

充分混勻精液樣本：每次吸取精液制備分析樣本時。

評估足夠數量的精子：每份重復樣本至少評估200個精子(總共至少400個精子)，活力評估時至少5個(CASA至少6個)視野。如果評估的精子數不能達到400個，則應在報告表中說明，并注明誤差。

重復計數之間的一致性：按照精液分析標準程序處理精液標本，一份精液樣本用同樣操作方法分別取樣進行兩次分析；計數兩次計數精子數的總數，評估兩個計數之間95%可信限間隔的差異，計數它們的總和與差異，如差異不可接受，則樣本存在系統誤差，應放棄結果，重新混合樣本后，再重新計數。如差異可以接受，則按要求進行最終結果的計算。

5.如何選擇精液分析內部質控程序？

狹義的內部質控(統計學質控)是指檢驗人員按照一定的頻度連續測定穩定樣品中的特定組分，并采用一系列方法進行分析，按照統計學規律推斷和評價本批次測量結果的可靠程度，以此判斷檢驗報告是否可發出，及時發現并排除質量環節中的不滿意因素。

精液分析內部質控程序選擇原則如下：

5.1技術人員自身差異的監控程序

平均變異系數：技術員對同一份樣本重復測量10次以上，至少評估20份以上樣本，計算平均變異系數。建議精子濃度和存活率的平均變異系數控制在10%以下，活動率的平均變異系數控制在15%以下，精子形態學評估的平均變異系數控制在20%以下。

Xbar圖：用儲存的質控品制備全實驗室的Xbar圖，用來監控以后的檢測，此批質控品用完需要更換，并重新制作Xbar圖。

5.2技術人員之間誤差的監控程序

5.2.1兩名技術員之間一致性分析：共同評估20份以上不同樣本，建議使用Bland-Altman圖或配對t檢驗進行一致性分析。

Bland-Altman圖[1，13，15-16]：其基本思想是計算出兩種測量結果的一致性界限，并用圖形的方法直觀地反映這個一致性界限。最后結合臨床實際，得出兩種測量方法是否具有一致性的結論。這種繪制方法有三個適用條件：差值的平均趨勢在測量范圍內保持不變；差值的散布程度在測量范圍內保持一致，即方差齊同；差值的分布呈正態分布。

Bland-Altman方法結合多個因素判斷結果(圖1)，差值均數線越接近代表差值均數為0的線，說明兩個結果的一致程度越高；95%一致性界限(1.96SD)外的數據點越少，一致程度越高；結果的判斷還考慮到一致性界限內的最大差值在臨床上的可接受程度。還可清楚地顯示極端值，對數據的異常值進行觀測。Bland-Altman方法同時也可在外部質量控制時用于評價兩個實驗室對質控樣本的分析結果。

圖1 兩名技術人員精子濃度分析的Bland-Altman圖

配對t檢驗：評估兩名技術人員結果的一致性，任何非零的顯著性差異都揭示兩個檢測人員之間的偏倚(系統誤差)。可通過統計學軟件實現。

5.2.2使用Youden圖或雙因素方差分析進行不同技術人員間差異評估

三個以上技術員一致性分析：共同評估2份不同的樣本，建議使用Youden圖(圖2)；由實驗室有經驗的檢測人員的測量結果確定兩個標本檢測結果的95%可信區間，用兩個不同樣本的結果互相作圖(Youden plots)。每個檢測人員分別分析兩份不同標本，然后將幾個檢測人員的測量結果進行比較，檢測值應落在由這些點線交叉形成的靶窗口區域。

圖2 多名技術人員分別分析兩份精液精子存活率Youden圖

根據數據點所在的位置評估質控結果及判斷誤差的性質：如果一個樣本的值落在其靶值范圍，而另一個樣本的值不在靶值范圍，表明為隨機誤差；而兩個樣本的值都高或都低，表示系統誤差；若一個樣本的值過低，而另一個過高，最有可能是隨機誤差所致。

使用雙因素方差分析評估兩名以上技術人員結果的一致性。樣本之間差異應該是顯著的，技術人員之間差異的P>0.05，表明技術人員結果一致性好。可通過統計學軟件實現。

5.2.3建議使用Xbar圖、S圖，對實驗室所有技術人員檢測結果進行監控

Xbar圖(圖3)是對同一樣本重復測量，用均值與時間做圖；主要目的是檢測結果偏離靶值的程度。系統誤差可以通過連續測量相同樣本檢測出來。實驗室的每個技術人員都要分析IQC樣本，并將結果用于繪制質控圖。

圖3 精子濃度的Xbar圖

由于質控樣本全部來源于同一個混合的儲存樣品，樣本之間預期沒有差異，所以檢測人員之間的任何顯著性差異將提示是某個或多個人員在分析中產生的系統性偏倚(表2)。一旦某個分析程序開始運轉且結果變異處于可接受范圍內，就應當常規對IQC樣本進行分析并將結果與已建立值進行比較，做法是將每次分析中IQC樣本的測量均值繪制在質控圖上，觀察是否落在本實驗室為該方法確定的變異(誤差)范圍之外。

S圖(圖4)是對樣本進行重復測量，并用標準差對時間作圖。檢測的是是否由于技術人員的原因產生了高度變異的結果。

圖4 精子濃度的S圖

表2 Xbar圖和S圖質控圖控制規則及誤差的來源

5.3使用月均值監測進行實驗室檢測的趨勢分析

統計實驗室一個月內所有精液樣本檢測值的平均值，簡稱月均值。月均值監測可以用從不同患者精液分析結果的趨勢檢驗隨后的操作。目的是監測實驗室操作中未能控制的改變或在檢測中重現偏移趨向，可反映不同的被檢者特性或技術因素(檢測人員的改變、實驗室用品的改變、季節溫度、操作流程等的變化等)。

將一個時間段內(如1個月)所有受檢者的每個變量的均值制作成Xbar圖，并分別以2個和3個標準誤在均值兩端設置警戒限和處置限。控制限的設置應至少采用6個月的觀察值，并定期修改。每個均值應至少來自于20個結果，小型實驗室可能要匯總1個多月的結果[17]。

控制規則與Xbar圖相同。

6.精液分析外部質控有哪些要求？

應對外部質控組織者的能力、組織過程和質量提出必要的要求，同時對精液分析外部質控的參加單位也應提出相應的要求，以真正達到外部質控的目的、效果和質量。

6.1對精液分析外部質控組織者的要求：

6.1.1組織

外部質控組織者或其所在組織，應是一個具有法律地位和能夠承擔法律責任的實體。

有責任確保所提供外部質控活動符合相關標準要求。

應具有開展《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準化操作培訓的能力和經驗；

建議自上而下分級(國家級、省級、市級)、分地區(各省、市)組織外部質控；

精液分析外部質控有兩種方式：中心實驗室將質控(QC)樣本分發到各實驗室用于技術人員進行熟練檢驗；參加質控的單位的技術人員集中到一個實驗室進行QC樣本的檢驗。

已開展精液分析內部質控的單位方可允許參加；必要時組織者應指導實驗室建立內部質控體系。

6.1.2 管理體系

應建立、實施和保持與外部質控的類型、范圍和數量范圍相適應的管理體系。

6.1.3 人員

管理和技術人員應具有履行其職責所需權限、資源和技術能力。

6.1.4 對精液分析外部質控的設計

應在外部質控開始之前制定文件化的方案，說明本次外部質控計劃的目標、目的以及基本設計情況，并提供必要信息：參加計劃應滿足的條件；對質控品制備、質量控制、存儲、分發的要求；外部質控計劃各階段時間表；質控品均勻性和穩定性檢驗結果；為參加者準備的結果報告表；指定值的來源；參加者結果和根據外部質控結果所做結論的公布范圍描述；參加者返回結果的截止日期；

質控品的制備或采購：確保所有質控品以恰當的方式獲得、收集、制備、處置、存儲。建立均勻性和穩定性評價程序。確保所用材料的獲取符合相關法規和倫理道德要求。

統計設計：應制定和建立符合外部質控目標的統計設計[18-20]。

指定值：見建議7。

結果報告：清晰、全面的，包含所有參加者結果的資料，并指出每個參加者的能力[3，21-27]。

6.2 對精液分析外部質控參加者的要求

外部質控參加者資質：建議實驗室逐級(國家級、省級、市級)、分地區(本省、市)參加精液分析外部質控；實驗室必須首先開展精液分析內部質控；

外部質控計劃的選擇：詳細閱讀并理解外部質控計劃書的有關要求；必須在規定時間內向外部質控組織者申請參加某項外部質控計劃；選擇外部質控計劃時，應考慮：與參加者所開展的檢測、測量或校準類型相匹配，對計劃設計的細節、確定指定值的程序、給參加者的指導書、數據統計處理以及最終總結報告的可獲得性，運作的輪次，組織保障方面(如時間、地點、樣品穩定性考慮、樣品發送安排)的適宜性，接受標準(即用于判定室間質量評價中的滿意表現)的適宜性，成本，為參加者保密的政策，報告結果和分析數據的時間表，確信質控品適宜性的特性(如均勻性、穩定性等)，與本標準的符合性等諸多因素。

質控品接收與存儲：按實驗室常規樣品接收作業指導書要求接收質控品。并按質控品的性質、存儲要求保存質控品。

質控品準備與檢測：質控品應由進行常規檢驗的人員檢測，實驗室主任和檢測人員應在外部質控組織者提供的工作表上簽字，保證質控品在處理方式和安全要求、檢測的次數、主要檢測系統及常規檢驗方法等與常規樣品一致。

結果審核與記錄：應按作業指導書的要求對質控品檢測結果進行審核；應將質控品處理、準備、方法、檢測、審核等每一步驟形成記錄文件。必須保存所有記錄至少2年。

結果回報：應將檢測結果等各項內容逐項填寫回報表，回報給外部質控的組織者；在規定回報結果截止日期之前，參加者之間不能對質控品檢測結果進行交流[3，20-23，27]。

7.精液分析外部質控的指定值如何確定？

指定值是對能力驗證物品的特定性質賦予的值，其確定方法有多種，在大多數情況下，按照以下次序，指定值的不確定度是逐漸增大的。

7.1 已知值——根據特定質評物配方(如制造或稀釋)確定的結果；

7.2 有證參考值——根據定義的檢測或測量方法確定(針對定量檢測)；

7.3 參考值——根據對質評物和可溯源到國家標準或國際標準的標準物質/標準樣品或參考標準的并行分析、測量或比對來確定；

7.4 由專家參加者確定的公議值——專家參加者(某些情況下可能是參考實驗室)應當具有可證實的測定被測量的能力，并使用已確認的、有較高準確度的方法，且該方法與常用方法有可比性；

7.5 由參加者確定的公議值——使用ISO13528和IUPAC國際協議中的統計方法，并考慮離群值的影響。如，參加者結果的穩健平均值、中位值(也稱為中位數)等[19-20，27]。

目前，精液常規分析、精子形態學分析外部質控的指定值一般使用由專家參加者確定的公議值和/或由參加者確定的公議值。

致謝：共識專家組(以姓氏筆畫為序：李玉山、趙邦榮、唐鋒、梁小薇)參與了共識的討論和修改，中華醫學會生殖醫學分會第四屆、第五屆委員會生殖男科與精子庫管理學組其他委員審閱了本共識。