自噬在多囊卵巢綜合征中的調控作用研究

陳歡歡，張磊，張珊，崔趁趁，張翠蓮*

(1.河南省人民醫院生殖醫學中心，鄭州 450003；2.河南省生殖醫學工程國際聯合實驗室，鄭州 450003)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見且復雜的育齡期女性內分泌代謝性疾病，其臨床表現為排卵障礙、高雄激素血癥、肥胖及胰島素抵抗(insulin resistant，IR)等，并與2型糖尿病、生育力下降及心血管疾病等遠期并發癥相關，占無排卵性不孕癥的70%～80%[1]。隨著人們生活方式的改變和環境因素的影響，PCOS的發病率和患病率均呈增長趨勢，在育齡女性中的發病率高達5%～15%[2]。由于PCOS患者卵泡發育及排卵障礙機制不明，病因復雜多樣加上遺傳因素的可能，PCOS至今沒有徹底治愈的方法，給患者帶來了巨大的精神和經濟壓力[3]。自噬是細胞降解胞內成分(包括可溶性蛋白、蛋白聚集體、細胞器、大分子復合物和異物)重要的、保守的過程，上述物質首先被稱為“隔離膜”的囊泡所包被，囊泡逐漸閉合形成雙層膜結構，即自噬體，并最終與溶酶體融合后進行降解[4]。近年來，關于自噬參與PCOS發生的分子機制日益受到人們的關注[5]。本文總結了PCOS相關自噬的最新進展，期望為未來的研究提供參考和借鑒。

一、自噬概述

細胞降解主要有兩種途徑：蛋白酶體途徑和自噬途徑。蛋白酶體主要降解短壽命蛋白質，而自噬則負責降解長壽命蛋白質以及受損或多余的細胞器[6]。自噬是一種特定形式的細胞死亡(Ⅱ型程序性細胞死亡)，是細胞對內外壓力反應的一部分。事實上，正常細胞很少發生大規模的自噬，除非存在誘發因素，既包括細胞外的脅迫如營養缺乏、缺血和缺氧，也有細胞內的因素如代謝應激、細胞器損壞、蛋白質的異常折疊或聚集[7]。由于這些因素的長期存在，細胞維持一個非常低的基礎自噬活性，以維持細胞內穩態。

根據自噬的形態特征和分子機制，哺乳動物細胞的自噬可以分為三種主要類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。每種類型都有其獨特的分子機制，并受到各種細胞信號的嚴格控制，有助于細胞適應不斷變化的環境。根據底物選擇性，自噬也可以分為兩類：選擇性自噬和非選擇性自噬。非選擇性自噬指的是細胞器或其他細胞質成分隨機轉運到溶酶體；選擇性自噬是指對需要降解的特定底物的識別，并進一步分為以下幾種類型：線粒體自噬、過氧化物酶體自噬、內質網自噬、細胞核自噬、核糖體自噬、脂自噬、聚集體自噬和異體自噬等。自噬是真核細胞的一種自我保護機制，在自我吞噬細胞物質的過程中，對受損的細胞器進行再加工或清除，從而維持細胞內環境的穩態，自噬失調參與多種疾病的發生[8]。

二、自噬標志物

自噬生物標志物在正常生理、病理過程或藥物的藥理反應中作為自噬的指標發揮著重要作用。在自噬的整個過程中有不同的自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)參與自噬發生的不同階段。

1.Atg12-Atg5復合體：在經典的泛素理論中，泛素作為一個前體產生，隨后被特定的蛋白酶切割，暴露某些羧基末端甘氨酸殘基。然后泛素被泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)激活，并通過硫酯鍵的形成轉移到泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)。泛素連接酶(ubiquitin ligase，E3)在確定靶蛋白后，通過泛素的甘氨酸和靶蛋白的賴氨酸殘基之間的連接，將泛素分子從E2酶轉移到靶蛋白[9]。Atg12是第一個被鑒定的類泛素Atg蛋白。自噬相關蛋白Atg7是一種E1樣激活酶，Atg10是一種E2結合酶。Atg12首先被Atg7激活，轉運到Atg10后與底物蛋白Atg5的賴氨酸殘基共價連接，形成Atg12-Atg5復合物，此過程中不需要底物特異性E3連接酶。Atg12-Atg5復合體的形成不受諸如營養缺乏等環境壓力的影響，它的存在對自噬體的形成至關重要。

2.Atg16L1：螺旋狀蛋白Atg16L1與Atg12-Atg5復合物相互作用，通過寡聚化形成Atg12-Atg5-Atg16L1復合物[10]，在自噬前體膜的延伸中發揮作用。Atg12-Atg5-Atg16L1復合物粘附在自噬體表面，主要分布在膜的凸起部位，而在膜的凹部分布較少，即Atg12-Atg5-Atg16L1復合體主要位于自噬體膜的外側。在自噬體結構完全閉合后，復合物從自噬體膜中釋放出來，并在細胞質中重新分布，而分布在膜兩側的Atg8-PE留在自噬體膜上，并被運輸到溶酶體，與溶酶體融合后降解。綜上所述，在自噬體延伸過程中，Atg16L1定位于早期自噬膜上，而不存在于自噬溶酶體膜上。因此，Atg16L1可以被用來檢測早期自噬體的形成。

3.Atg8/LC3：Atg8/LC3是目前自噬研究中應用最廣泛的分子生物標志物。在酵母中，Atg8與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)結合形成Atg8-PE。在哺乳動物細胞中，Atg8的同源物包括微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3/LC3)和γ-氨基丁酸受體相關蛋白(γ-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP)。LC3參與自噬體膜的形成，GABARAP參與自噬體膜的延伸和閉合[11]。MAP1LC3/LC3蛋白包括LC3A、LC3B、LC3B2和LC3C，其中LC3A和LC3B具有較高的同源性。LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ是兩種可以相互轉化的LC3[12]。細胞中新合成的LC3首先被加工成LC3-Ⅰ，以可溶性形式存在于細胞質中。然后，泛素化的LC3-Ⅰ與存在于自噬體膜表面的PE結合，形成膜結合的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ分布在自噬體膜上，是自噬過程的重要生物標志物，LC3-Ⅱ含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與細胞自噬體數量呈正相關，可用于評估細胞自噬水平。

4.Beclin-1：哺乳動物中的Beclin-1含有450個氨基酸殘基，相對分子量為60 kD，主要位于高爾基體的反面、內質網和線粒體上。Beclin-1蛋白有4個重要的結構域：Bcl-2同源結合域(BH3)、螺旋結構域(CCD)、進化保守結構域(ECD)和核輸出信號結構域[13]。Beclin-1通過其ECD結構域與磷脂酰肌醇3激酶催化亞基3型(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3，PIK3C3/Vps34)結合形成Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)復合物，而磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基4(phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 4，PI3KR4/Vps15)可以將Vps34固定在細胞膜上。Vps34磷酸化磷脂酰肌醇，產生的磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)能夠結合自噬前體膜上的其他自噬相關蛋白。Beclin-1在調控自噬起始的信號轉導途徑中發揮作用。在正常條件下，Beclin-1與Bcl-2相互作用，自噬被抑制。當細胞處于應激條件時，促凋亡分子BH3從Bcl-2中分離出Beclin-1[14]，然后Beclin-1與Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶PIK3C3/Vps34結合激活自噬。

5.p62/SQSTM1：p62也被稱為SQSTM1(sequestosome 1)，是一個相對分子量為62 kD的自噬受體，作為底物在自噬過程中被降解[15]。p62在多種細胞和組織中表達，并作為支架蛋白參與多種信號轉導過程。免疫組化結果顯示p62的定位與LC3的定位重疊。p62可以通過其LC3-相互作用區與LC3結合，并通過泛素相關結構域(ubiquitin-associated domain，UBA)與含有泛素的蛋白質結合。p62及其結合的泛素化蛋白包含在自噬體中，并在自噬溶酶體中降解。當自噬受到抑制時，自噬體積累，p62水平升高。因此，p62可以作為自噬的一個標志物，其水平的高低反映了自噬活性程度。

三、PCOS相關內分泌代謝中自噬的調節

1.高雄激素參與PCOS自噬調節：高雄激素血癥是女性無排卵最常見的原因之一，并增加了PCOS患者內分泌紊亂的風險[16]。自噬在內分泌功能障礙和無排卵中起著重要作用。探討高雄激素血癥與自噬的關系有助于了解PCOS的發病機制。

高雄是PCOS的臨床特征之一。雄激素對自噬的調節可能在PCOS的發病機制中發揮了重要作用。研究者收集PCOS患者和非PCOS患者的顆粒細胞，發現Beclin-1的表達水平與血清總睪酮和雄激素水平呈正相關；在非PCOS患者的顆粒細胞中添加二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)，Beclin-1的表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈劑量依賴關系[16-17]。表明雄激素誘導的自噬激活可能在PCOS的發生發展中發揮重要作用。

Song等[18]在脫氫表雄酮(DHEA)誘導的PCOS小鼠模型中研究了mTOR復合物1(mTOR complex 1，mTORC1)在調控骨骼肌自噬中的作用，研究發現DHEA處理后mTORC1激活(mTORC1磷酸化)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值降低、SQSTM1的表達增強，即自噬水平降低；同時，在體外培養的C2C12小鼠成肌細胞中添加睪酮激活mTORC1，自噬減少、線粒體功能受損、發生胰島素抵抗；相反的，抑制mTORC1誘導自噬，線粒體功能得到恢復，胰島素敏感性增加。這項結果表明mTORC1-自噬通路可能通過損害線粒體功能、降低胰島素敏感性參與雄激素誘導的青春期前雌性小鼠骨骼肌的胰島素抵抗。

Cui等[19]在DHT誘導PCOS大鼠模型中揭示了雄激素通過誘導肝臟細胞凋亡和自噬參與非酒精性脂肪肝的分子機制，研究發現DHT誘導的PCOS大鼠肝臟中促凋亡因子Bak的mRNA水平升高，活性caspase-3與caspase-3前體的比值增加；自噬相關蛋白Atg12的表達增加，但是LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的mRNA水平和蛋白水平均降低，且自噬底物p62的表達在兩組中也沒有顯著差異。這項研究結果表明自噬在DHT誘導的PCOS大鼠中沒有顯著增加，但是存在自噬失衡現象。

2.自噬調節PCOS胰島素抵抗：PCOS不僅是一種內分泌紊亂，也是一種代謝紊亂，各種代謝異常在PCOS的進展中起著至關重要的作用[20]。大約50%～75%的PCOS患者存在不同程度的胰島素抵抗[21]。因此，了解PCOS胰島素抵抗的分子機制很有必要。

有研究采用來曲唑誘導PCOS大鼠模型，在口服來曲唑15 d后開始同時口服納米姜黃素(一種新型的姜黃素納米脂質體制劑)，研究納米姜黃素調節PCOS模型鼠胰腺自噬的分子機制[22]。研究發現PCOS組性激素水平紊亂，血糖、胰島素水平顯著升高，表現出胰島素抵抗，同時發現PCOS組miR-223-3p的表達水平下降、自噬標記物p62和LC3-Ⅱ的蛋白水平升高；加入納米姜黃素后miR-223-3p的表達水平上調，異常升高的自噬得到恢復，血糖含量和血清胰島素水平降低，胰島素抵抗減弱。結果表明，納米姜黃素可通過上調miR-223-3p，抑制自噬，減輕胰島素抵抗。

已有研究證明柚皮素和桑色素對自噬具有協同調控作用[23-24]。mTOR信號通路在自噬過程中發揮極為重要的作用。mTOR包含兩種復合體，分別為mTORC1和mTORC2。研究者設計了對照組、PCOS組、PCOS+柚皮素組、PCOS+桑色素組、PCOS+柚皮素+桑色素組5組實驗，其中PCOS組大鼠連續注射胰島素，誘導高胰島素血癥和胰島素抵抗[25]。結果發現添加柚皮素和桑色素后，與PCOS組相比血清胰島素水平降低，mTORC1、mTORC2和p62的蛋白水平降低，LC3-Ⅱ、Caspase-3的蛋白水平升高。該研究結果表明柚皮素和桑色素可能通過mTOR信號通路增強自噬降低PCOS大鼠胰島素抵抗。

還有研究采用來曲唑聯合高脂乳劑構建PCOS胰島素抵抗大鼠模型，之后添加不同劑量的桂枝茯苓丸，探討桂枝茯苓丸致PCOS-IR大鼠排卵障礙的分子機制[26]。結果發現，模型組卵巢組織中PI3K、p-Akt和p-MTOR蛋白的磷酸化水平均降低，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的相對表達量顯著升高；添加桂枝茯苓丸后，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平均升高，在中、高劑量組中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1的相對表達量顯著降低。該研究結果表明桂枝茯苓丸可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制卵巢組織過度自噬，改善卵巢功能和胰島素抵抗，且高劑量效果更佳。

3.炎癥誘導PCOS自噬增強：研究表明，炎癥因子在PCOS患者中高表達，如白介素18(interleukin 18，IL-18)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)[27]。PCOS患者存在持續的低度慢性炎癥，與高雄激素血癥、高胰島素血癥和肥胖等相關，加重了PCOS患者的病理變化。

TNF-α在肥胖型PCOS患者和非肥胖型PCOS患者的血清中表達量均升高；在PCOS患者中，TNF-α的升高引起胰島素敏感組織中胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)絲氨酸磷酸化增加，使胰島素敏感性葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter type 4，GLUT4)的表達下降，最終發生胰島素抵抗[28]。CRP是肝臟受IL-6刺激后產生的急性期反應物，IL-6是一種來自脂肪組織的內分泌細胞因子。有研究表明，CRP是PCOS中最可靠的慢性低級別炎癥標記物，在PCOS患者中的表達量升高，且非肥胖PCOS患者中CRP的表達量低于肥胖PCOS患者[29]。IL-6在卵巢發育和胚胎著床過程中發揮重要作用，影響排卵和妊娠結局[30]。

作為一種細胞內降解途徑，自噬保護細胞免受包括感染在內的外源性危害，以及包括分子聚集和受損細胞器在內的內源性炎癥。PCOS患者體內炎癥因子增加，表明自噬可能通過調節炎癥參與調控PCOS患者胰島素抵抗或者排卵障礙過程。

高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種炎癥介質，在2型糖尿病患者中通過糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)和toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)激活核轉錄因子kappa B(NF-κB)信號通路參與炎癥反應[31]。NF-κB是細胞中重要的轉錄調節因子，參與炎癥反應，在PCOS患者中異常高表達[32]。近年來，HMGB1在調節卵巢內自噬中的作用受到關注，它能夠誘導顆粒細胞的自噬反應，導致顆粒細胞數量下降。HMGB1通過作用于自噬蛋白增強自噬，包括增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和ATG7水平以及降低SQSTM1水平[33]。

四、PCOS患者卵巢顆粒細胞的自噬

顆粒細胞作為卵巢組織的重要組成部分，在卵泡的生長發育過程中發揮著至關重要的作用。隨著卵泡發育至竇卵泡期，顆粒細胞分化為在空間和功能上不同的2個種群，即圍繞在卵母細胞周圍的卵丘細胞和排列在卵泡壁上的壁層顆粒細胞。卵丘細胞主要為卵母細胞的生長發育提供營養和能量，而壁層顆粒細胞主要承擔內分泌功能。這些細胞通過分泌營養物質和激素來促進初級和次級卵泡的生長和發育，從而為卵母細胞在卵泡中進行減數分裂和成熟提供適宜的微環境。顆粒細胞凋亡導致卵巢激素合成減少，從而降低卵泡卵母細胞的生長發育，誘導卵母細胞凋亡[34]。顆粒細胞的自噬與凋亡密切相關，影響PCOS患者的胚胎質量和妊娠結局。

Qin等[35]用DHT構建小鼠PCOS模型，自然交配后收集后代小鼠的卵巢組織，免疫組化染色結果發現LC3-Ⅱ在PCOS后代小鼠卵巢中的表達高于對照組，透射電鏡結果顯示PCOS后代小鼠顆粒細胞中自噬體的數量增加。這些結果表明PCOS后代小鼠卵巢中的自噬水平顯著增加。研究者進一步將模型小鼠的卵巢組織進行了甲基化測序分析，發現MAPK通路上的Map3k1(編碼MEKK1)和自噬通路上的Map1lc3a(編碼LC3-Ⅱ)啟動子區甲基化水平降低，并伴隨著Map3k1和Map1lc3a的表達水平上調，且MAPK通路上的自噬相關基因Beclin-1的表達量也上調；另外，將小鼠顆粒細胞用DHT處理后，發現Map3k1、Map1lc3a和LC3-Ⅱ的表達水平顯著上調，并伴有Map3k1的甲基化水平下調[35]。該研究結果表明DHT可能通過調節Map3k1的甲基化和表達水平，導致MAPK信號通路的激活，進而影響顆粒細胞自噬水平。

二甲雙胍是PCOS治療中應用最廣泛的藥物之一，可以改善胰島素敏感性，恢復PCOS患者的排卵功能，促進胚胎著床，提高妊娠率。二甲雙胍可通過PI3K/AKT/mTOR通路抑制氧化應激誘導的自噬[36]，但二甲雙胍對PCOS患者卵巢顆粒細胞的作用機制尚不清楚。研究者用二甲雙胍治療來曲唑構建的PCOS模型大鼠，發現PCOS組卵巢組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表達以及氧化應激水平高于對照組和PCOS+二甲雙胍組；然后，收集大鼠的顆粒細胞，用H2O2處理后建立氧化應激細胞模型，并用二甲雙胍處理模型細胞，發現H2O2+二甲雙胍組中LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-PI3K的表達低于H2O2組，且PI3K/AKT/mTOR通路干擾組(H2O2+3-MA、H2O2+LY294002和H2O2+Rapa)中AKT磷酸化(p-AKT)和mTOR磷酸化(p-mTOR)水平低于H2O2+二甲雙胍組；此外，加入PI3K和mTOR抑制劑后，Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高[37]。該研究結果表明，二甲雙胍能夠通過PI3K/AKT/mTOR通路降低氧化應激改善PCOS顆粒細胞自噬。

已有大量研究表明異常表達的miRNA在PCOS發病機制中起重要作用，對PCOS有潛在的診斷價值[38]。在卵丘卵母細胞復合物(cumulus oocyte complex，COCs)和KGN細胞(人卵巢顆粒細胞)中let-7家族是表達最豐富的miRNAS，并參與調節妊娠、卵泡發育、卵母細胞成熟和激素反應[39-40]。研究者發現let-7e在PCOS患者顆粒細胞中異常高表達，并利用KGN細胞系探究了let-7e影響顆粒細胞功能的分子機制[41]：抑制let-7e后發現LC3-Ⅱ水平升高，p62水平降低，p21的表達被激活；相反，過表達let-7e后LC3-Ⅱ水平降低，p62水平增加，p21的表達被抑制；同時也發現在PCOS患者顆粒細胞中LC3-Ⅱ和p21蛋白水平下降。因此，該研究結果表明let-7e可能通過抑制p21信號通路調節PCOS顆粒細胞的自噬。

五、小結與展望

正常情況下，自噬是維持卵母細胞發育、卵泡生長分化、卵泡閉鎖和生殖周期所必需的。相關研究表明由于受影響的細胞類型不同，自噬可能會以激活或抑制的狀態參與PCOS的發展。例如，在人、大鼠或小鼠的卵巢組織、胰腺組織和顆粒細胞中，自噬是顯著激活的；而在PCOS小鼠的骨骼肌中，自噬是被抑制的；另外，在PCOS大鼠的肝臟組織中自噬相關蛋白的表達變化不一致，結果導致整體自噬沒有顯著增加。自噬參與PCOS患者的高雄激素血癥、胰島素抵抗、慢性炎癥等內分泌代謝調節過程，并通過調節卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡降低卵母細胞質量，導致排卵障礙和不孕不育；同時，PCOS動物模型或患者使用的調節藥物也可以通過自噬發揮作用。因此，完善PCOS的自噬模型，探究自噬在PCOS中的作用機制，可為進一步了解PCOS的發病機制以及藥物治療提供新的思路和方法。