原發(fā)性不孕患者行早期補救ICSI和常規(guī)ICSI的臨床應(yīng)用分析

任晶輝，土增榮，高瑞璠，段瑞云

(山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030000)

在全球范圍內(nèi)，隨著環(huán)境惡化、人們工作及生活壓力增大，不孕癥的發(fā)生率不斷提升。女性不孕癥根據(jù)是否有妊娠史可以分為原發(fā)性不孕癥和繼發(fā)性不孕癥，原發(fā)性不孕在不孕癥中的比例約為60%[1]。原發(fā)性不孕患者不孕原因較為復(fù)雜且潛在不孕因素較多，使用傳統(tǒng)的體外受精(IVF)技術(shù)，其受精失敗及受精率低的概率較高[2]。

卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)和早期補救ICSI(r-ICSI)是提高受精率的常用方式。ICSI是繞過透明帶、卵膜和細(xì)胞器，將選定的單個精子直接注入取出的每個卵母細(xì)胞的輔助生殖技術(shù)(ART)[3]，其可以避免精子和卵子的融合缺陷所造成的完全受精失敗，大大提高了受精率。然而，ICSI為侵入性操作且價格相對較高，因此主要用于嚴(yán)重男性因素不育、不明原因不孕以及IVF反復(fù)受精失敗的患者。早期r-ICSI與常規(guī)ICSI受精原理相同，但在時間上有所差異。早期r-ICSI是指精子與卵子共孵育6 h后用顯微鏡觀察卵母細(xì)胞中的第二極體，對未排出第二極體的卵母細(xì)胞，進(jìn)行r-ICSI，使未受精的卵母細(xì)胞再次受精[3]，從而提高受精率。

常規(guī)ICSI和早期r-ICSI均能提高受精率，然而關(guān)于常規(guī)ICSI與早期r-ICSI的臨床結(jié)局尚存在爭議[4-6]。且目前關(guān)于早期r-ICSI和常規(guī)ICSI對于原發(fā)性不孕女性臨床結(jié)局影響的研究較少。因此，本研究通過回顧性分析，探討早期r-ICSI和常規(guī)ICSI對原發(fā)性不孕女性臨床結(jié)局的影響，以期為這些患者尋找最佳的輔助生殖技術(shù)提供一定參考。

資料和方法

一、研究對象

收集2017年12月至2021年6月于本院行常規(guī)ICSI治療或因IVF全部/部分受精失敗行早期r-ICSI治療的原發(fā)性不孕患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻雙方為從未有過妊娠史的原發(fā)性不孕不育患者；(2)男方精液符合2010年世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)檢查標(biāo)準(zhǔn)，可用于ICSI/早期r-ICSI；(3)女性年齡<35歲；(4)所有患者均行ICSI或早期r-ICSI授精；(5)均行新鮮周期卵裂期胚胎移植；(6)所有ICSI/早期r-ICSI后妊娠的夫婦隨訪到新生兒出生。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)著床前行遺傳學(xué)診斷、卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)的周期，為冷凍卵母細(xì)胞或冷凍精子者，經(jīng)穿刺取精或為捐贈者卵母細(xì)胞或捐贈者精子者；(2)女性患有高血壓、糖尿病、心臟疾病或甲狀腺疾病，合并子宮異常及其他可能對ART治療或妊娠產(chǎn)生不利影響的疾病。

根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，研究共納入479例患者(479個周期)，對所有患者的一般資料、實驗室指標(biāo)和妊娠結(jié)局進(jìn)行回顧性分析。

二、研究方法

2.促排卵方案：控制性促排卵方案根據(jù)患者情況的個體差異進(jìn)行調(diào)整。采用常規(guī)促排卵方案，主要有激動劑方案、拮抗劑方案、微刺激方案以及高孕激素狀態(tài)下促排卵方案等。經(jīng)陰道超聲監(jiān)測不同時期卵泡的生長情況，當(dāng)至少有1個卵泡直徑≥18 mm或2個卵泡直徑≥17 mm或3個卵泡直徑≥16 mm時，當(dāng)晚肌肉注射HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)6 000～10 000 U，36～38 h后在陰道超聲引導(dǎo)下進(jìn)行穿刺取卵。

3.精液處理：男方禁欲3～5 d，取卵日手淫取精。參照2010年世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)對液化后的精液進(jìn)行精液常規(guī)分析。采用Pureception密度梯度離心法聯(lián)合上游法處理精液后，置于36.5℃、6%CO2培養(yǎng)箱中待授精。

4.人工授精：(1)ICSI組：取卵后1～2 h給予透明質(zhì)酸酶剝除卵母細(xì)胞周邊顆粒細(xì)胞，所有MⅡ卵母細(xì)胞均行ICSI。(2)r-ICSI組：卵泡穿刺獲得卵冠丘復(fù)合物，IVF后4～5 h去除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，根據(jù)是否存在第二極體判斷受精情況，若觀察到兩個極體的卵母細(xì)胞數(shù)占成熟卵母細(xì)胞數(shù)的比例<50%，或成熟卵母細(xì)胞均未排出第二極體者，在6 h后對未受精卵母細(xì)胞行早期r-ICSI。16～18 h后觀察原核(PN)形成情況，見到雙原核(2PN)且看到兩個極體為正常受精。

5.胚胎移植：參照伊斯坦布爾共識[7]對卵裂期胚胎進(jìn)行質(zhì)量評估，正常受精后第3天(D3)卵裂球數(shù)目≥4個、碎片<50%者為可利用胚胎；D3卵裂球數(shù)目7～9個、碎片<20%為優(yōu)質(zhì)胚胎。取卵后第3天，根據(jù)卵裂期胚胎質(zhì)量由高到低移植1～2枚胚胎，剩余優(yōu)質(zhì)胚胎或可利用胚胎于移植當(dāng)日行玻璃化冷凍保存；其中r-ICSI組移植胚胎均為經(jīng)早期r-ICSI受精形成的胚胎(不包含短時IVF受精形成的胚胎)。有卵巢過度刺激綜合征(OHSS)風(fēng)險或存在宮腔積液等不宜移植胚胎的情況時，則取消移植，冷凍所有胚胎。取卵當(dāng)日開始給予患者常規(guī)黃體支持至取卵后第10日，如有特殊情況，根據(jù)患者情況調(diào)整用藥。

6.移植結(jié)局隨訪：所有行胚胎移植的患者均隨訪至有明確的妊娠結(jié)局：未妊娠、生化妊娠、流產(chǎn)或活產(chǎn)。胚胎移植后第14天檢測血HCG，HCG陰性(HCG<10 U/L)者為未妊娠；HCG陽性(HCG>10 U/L)者于移植后第28天行陰道超聲檢測，未見孕囊者為生化妊娠，見宮內(nèi)孕囊及原始心管搏動者為臨床妊娠。早期流產(chǎn)定義為胚胎移植后28 d超聲可檢測到孕囊存在，但妊娠12周內(nèi)胚胎停止發(fā)育或自然流產(chǎn)。活產(chǎn)定義為孕周滿28周，至少有1個存活的新生兒分娩。

7. 觀察指標(biāo)：收集納入對象的一般資料，包括女方年齡、男方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH(bFSH)水平等。記錄各組患者的實驗室指標(biāo)及妊娠結(jié)局，包括MⅡ卵母細(xì)胞率、受精率、2PN率、3PN率、卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、周期取消率、胚胎種植率及臨床妊娠率、生化妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率及異位妊娠率。其中MⅡ卵母細(xì)胞率=MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)/獲卵數(shù)；受精率=受精數(shù)/MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)；2PN率=2PN數(shù)/受精數(shù)；3PN率=3PN數(shù)/受精數(shù)；卵裂率=卵裂數(shù)/受精數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/受精數(shù)；胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)；生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)；早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有計量資料均為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(上下四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，組間比較使用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗或Kruskal-Wallis檢驗，F(xiàn)isher精確概率檢驗用于期望頻數(shù)小于5的情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2對兩組患者治療后不良反應(yīng)發(fā)生情況進(jìn)行對比,結(jié)果顯示,觀察組不良反應(yīng)發(fā)生率為12.19%,對照組不良反應(yīng)發(fā)生率為36.58%,兩組患者組間差異顯著,具有差異統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),具體情況如表2所示:

結(jié) 果

一、各組患者一般資料比較

本研究共納入479例患者(479個周期)。其中，短時IVF授精后未受精或受精率低而行早期補救ICSI(r-ICSI組)77周期，常規(guī)ICSI周期中男方精液參數(shù)正常者(ICSI-1組)144周期和男方精液參數(shù)異常者(ICSI-2組)258周期。

三組患者間女方年齡、男方年齡、BMI、不孕年限、bFSH比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者一般資料比較[M(P25，P75)]

二、各組患者實驗室指標(biāo)比較

1.r-ICSI組和ICSI-1組的實驗室指標(biāo)比較：r-ICSI組的MⅡ卵母細(xì)胞率、受精率、2PN率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于ICSI-1組(P<0.05)。r-ICSI組的周期取消率顯著低于ICSI-1組(P<0.001)。兩組間3PN率、卵裂率、胚胎種植率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

2.r-ICSI組和ICSI-2組實驗室指標(biāo)比較：r-ICSI組的MⅡ卵母細(xì)胞率、受精率、可利用胚胎率顯著高于ICSI-2組(P<0.05)。r-ICSI組的周期取消率、胚胎種植率顯著低于ICSI-2組(P<0.05)。兩組間2PN率、3PN率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

3.ICSI-1組和ICSI-2組實驗室指標(biāo)比較：ICSI-1組的MⅡ卵母細(xì)胞率顯著高于ICSI-2組(P<0.001)，受精率、2PN率、可利用胚胎率及優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于ICSI-2組(P<0.05)。兩組間3PN率、卵裂率、胚胎種植率及周期取消率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、各組患者妊娠結(jié)局比較

r-ICSI組、ICSI-1組及ICSI-2組間的生化妊娠率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率及異位妊娠率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表2 各組患者實驗室指標(biāo)比較(%)

表3 各組患者妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

近年來，輔助生殖技術(shù)不斷發(fā)展，但仍然避免不了完全受精失敗或部分受精失敗的發(fā)生，IVF發(fā)生完全受精失敗的概率為5%～20%[8]。對于精子與卵子共孵育6 h后受精失敗或受精率低的患者，選擇在下個周期直接行ICSI，還是選擇當(dāng)前周期進(jìn)行短時受精聯(lián)合r-ICSI，是一個值得思考的問題。考慮到高齡女性卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、非整倍體胚胎和自然流產(chǎn)率顯著增加[9]，且移植不同類型胚胎(卵裂期胚胎或囊胚)會對妊娠結(jié)局帶來影響，為了消除年齡及移植胚胎類型所帶來的偏倚，本研究只選擇年齡<35歲、新鮮周期移植卵裂期胚胎的患者進(jìn)行研究。

本研究的數(shù)據(jù)顯示，r-ICSI組和ICSI-1組(男方精液參數(shù)正常)的患者中，r-ICSI組的MⅡ卵母細(xì)胞率、受精率顯著高于ICSI-1組(P<0.001)。這與王雪瑩等[6]、Zeng等[10]的研究結(jié)論相似。王雪瑩等[6]認(rèn)為早期r-ICSI可在不影響胚胎發(fā)育潛能的情況下顯著提高受精率，獲得良好的妊娠結(jié)局；Zeng等[10]認(rèn)為對于原發(fā)性不孕癥及不孕癥持續(xù)時間較長的患者應(yīng)常規(guī)行短時IVF授精聯(lián)合早期r-ICSI。r-ICSI與ICSI的差異主要體現(xiàn)在以下2點：(1)r-ICSI的單精子注射時間晚于ICSI；(2)r-ICSI存在精子與卵子共孵育的過程，而ICSI則沒有。有研究認(rèn)為，卵母細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)成熟的時間晚于細(xì)胞核成熟的時間；早期r-ICSI的卵母細(xì)胞穿刺時間較晚，使得卵母細(xì)胞發(fā)育的時間更長、卵母細(xì)胞更成熟、卵母細(xì)胞核質(zhì)發(fā)育更同步[11]。核質(zhì)共同成熟的卵母細(xì)胞具有更好的發(fā)育潛能，更有利于受精成功，這可能是早期r-ICSI較ICSI有更高受精率的原因之一。此外，卵丘細(xì)胞表達(dá)的基因以及為卵母細(xì)胞提供的一系列因子，包括糖胺聚糖、類固醇激素和營養(yǎng)物質(zhì)等，在調(diào)控卵母細(xì)胞生長、成熟等方面發(fā)揮著重要作用[12]。宋明哲等[13]認(rèn)為，卵母細(xì)胞成熟率和受精率呈正相關(guān)。在早期r-ICSI操作中，精子與卵子共孵育的過程可以通過卵丘細(xì)胞促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，提高卵母細(xì)胞的受精率，這可能是早期r-ICSI受精率較高的另一原因。

r-ICSI組的可利用胚胎率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著高于ICSI-1組(P<0.05)。這與王紫娟等[11]的結(jié)果相似，而與王雪瑩等[6]的結(jié)果相反；這種差異可能是因為納入、排除標(biāo)準(zhǔn)不同。王雪瑩等[6]的研究中未對年齡及不孕類型進(jìn)行分組；而我們的研究集中于年齡<35歲的原發(fā)性不孕患者。有研究表明，卵丘細(xì)胞對胚胎發(fā)育具有雙面性，一方面，卵丘細(xì)胞可以分泌促進(jìn)胚胎發(fā)育的物質(zhì)，如生長因子、氨基酸、雌二醇、孕酮等，從而提高優(yōu)質(zhì)胚胎率；另一方面，卵丘細(xì)胞也會產(chǎn)生對胚胎發(fā)育潛力有不利影響的氧化代謝物。早期r-ICSI通過早期清除卵丘細(xì)胞，限制精子與卵子共孵育的時間，減少卵丘細(xì)胞產(chǎn)生過多的氧化代謝產(chǎn)物，避免了卵母細(xì)胞老化，可能有助于提高胚胎發(fā)育的潛能[14-15]。

本研究中，r-ICSI組與ICSI-1組的胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、早期流產(chǎn)率和異位妊娠率比較均無顯著性差異(P>0.05)。Huang等[16]回顧性分析了13 232對接受IVF、ICSI和早期r-ICSI夫婦的臨床資料，發(fā)現(xiàn)早期r-ICSI組與ICSI組的著床率、臨床妊娠率和每移植周期活產(chǎn)率均無顯著性差異(P>0.05)，認(rèn)為早期r-ICSI是一種安全有效的方法。Xiong等[17]也在研究中證實早期r-ICSI是可用于原發(fā)性不孕婦女的一種安全、有效的體外授精方式。我們的觀點與上述研究相似。

但r-ICSI也有其不足之處，容易出現(xiàn)多精受精。卵母細(xì)胞如果在受精前就開始老化，則會影響受精率和胚胎的發(fā)育；若過早進(jìn)行r-ICSI，可能出現(xiàn)第二極體釋放延遲的卵母細(xì)胞多精受精。因此尋找r-ICSI的最佳時機(jī)非常關(guān)鍵。目前比較公認(rèn)的短時授精的時間是精子和卵子共孵育6 h[18]。然而，即使是經(jīng)驗豐富的胚胎學(xué)家，也無法避免多精受精的情況出現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，對于精液參數(shù)正常的原發(fā)性不孕患者，早期r-ICSI的2PN率顯著高于ICSI-1組(P<0.05)，3PN率有低于ICSI-1組的趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這與Chen等[19]的研究結(jié)果相似，Chen等[19]認(rèn)為對第二極體釋放率<80%的卵母細(xì)胞采用r-ICSI授精并未明顯增加3PN率；該結(jié)論再次驗證了r-ICSI的安全性。

此外，本研究結(jié)果中還出現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象。有數(shù)據(jù)表明，在世界范圍內(nèi)，精液參數(shù)正常的不孕不育夫婦使用ICSI助孕的比率持續(xù)上升，在美國，ICSI的使用率從1996年的36.4%上升到2012年的76.2%；在這17年間，精液參數(shù)正常的不孕患者周期中，ICSI的使用率從15.4%上升到66.9%[16]。本研究結(jié)果中，ICSI-2組(男方精液參數(shù)異常)的受精率、2PN率、可利用胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著高于ICSI-1組(P<0.05)；ICSI-2組的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率(40.31%)均有高于ICSI-1組的趨勢，但尚無顯著性差異(P>0.05)。這可能是因為本研究納入的樣本量較少，研究結(jié)果存在一定的偏倚，但是仍能說明采用ICSI助孕對精液參數(shù)異常的患者，可以實現(xiàn)更好的臨床結(jié)局。

臨床工作中，有一些研究將周期取消作為排除標(biāo)準(zhǔn)[6]，然而，比較組間的周期取消率，對分析ICSI和r-ICSI的臨床應(yīng)用價值有一定的幫助。本研究結(jié)果顯示，常規(guī)ICSI組，包括男方精液參數(shù)正常的ICSI-1組和精液參數(shù)異常的ICSI-2組，周期取消率均顯著高于r-ICSI組(P<0.001)，提示盲目地對精液參數(shù)正常的原發(fā)性不孕患者采用ICSI助孕可能會造成周期的取消，增加了時間成本；而早期r-ICSI更能提高周期有效率。

但本研究也存在一些不足：首先，本研究納入的樣本量有限。其次，原發(fā)性不孕患者既往沒有妊娠史，大多相對年輕；而原發(fā)性不孕的高齡患者樣本量較少，此次未納入研究。最后，本研究為回顧性分析，研究結(jié)論可能存在一定的局限性，后續(xù)仍需要更大樣本量的前瞻性多中心隊列研究為早期r-ICSI的有效性提供更多的證據(jù)和資料積累。

綜上所述，對于<35歲的原發(fā)性不孕患者，短時授精聯(lián)合早期r-ICSI可作為一種安全有效的治療方式；雖然其未能顯著提高患者的臨床妊娠率和活產(chǎn)率，但顯著改善了受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率，并且能有效避免周期取消，節(jié)約了時間成本，有利于緩解患者夫婦的心理壓力。