靜脈注射免疫球蛋白治療對復發性流產患者的外周血自然殺傷細胞及妊娠結局影響的Meta分析

陳遠瑩，黃偉育，楊一華

(廣西醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心，南寧 530021)

在國外，復發性流產(RSA)是指從受孕到24周的妊娠期發生≥2次流產，約占懷孕女性1%～2%；而在我國，則是指與同一性伴侶連續發生≥3次流產[1-2]。RSA在育齡期婦女中的發生率約為1%～5%，其中約50%的患者病因不明[3]，這些不明原因的RSA大部分與免疫紊亂有關。母胎界面免疫失衡可能是導致RSA的原因之一。在孕早期，自然殺傷(NK)細胞約占母胎界面免疫細胞數量的70%～80%[4]，對維持母胎界面的免疫耐受起著重要作用。有研究表明，外周血NK細胞活性及比例的升高與RSA患者的不良妊娠結局有關[5]。

近年來，免疫治療越來越多地用于治療病因不明的RSA，但其療效及安全性仍存在爭議。靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)是目前采用的免疫治療方法之一，尤其是適用于外周血NK細胞數量增多的RSA患者[6]。有研究認為，RSA患者經過IVIG治療后外周血NK細胞數量、活性、各表型比例發生改變，從而有利于改善妊娠結局[7-8]。但也有部分研究認為，IVIG治療對妊娠結局無顯著影響[9-10]。鑒于目前IVIG治療RSA的研究存在治療方案不統一、結論不一致的情況，難以指導臨床實踐。因此，本研究擬采用Meta分析方法，客觀地評價IVIG治療RSA的臨床效果，以期為臨床實踐提供更有價值的參考。

資料與方法

一、文獻檢索

檢索Pubmed、Web of Science、Embase、Cochrane Library、中國知網(CNKI)數據庫；檢索日期自建庫至2022年4月。英文數據庫檢索以“自由詞”和“主題詞”結合檢索。中文數據庫在中國知網上進行檢索。中文檢索詞包括：復發性流產、反復流產、習慣性流產、靜脈注射免疫球蛋白、自然殺傷細胞；英文檢索詞包括：Recurrent Miscarriage、Recurrent Pregnancy Loss、Abortion、Habitual、Recurrent Abortion、Recurrent Spontaneous Abortion、IVIG、Intravenous Immunoglobulin、NK Cell、Natural Killer Cells、CD56、CD16。

納入標準：(1)隨機對照試驗(RCT)、隊列研究、無對照組的單臂試驗研究；(2)以IVIG治療RSA；(3)評價IVIG治療前后NK細胞數量/活性的變化、活產率、流產率及不良反應。

排除標準：(1) 病例報告、綜述、會議摘要；(2)體外研究；(3)數據資料不完整；(4)用藥方案不具體。

二、研究方法

1.原始文獻的篩選及數據提?。河?名研究人員獨立完成對文獻的質量評價及數據提取。采用Prisma流程進行文獻篩選，閱讀文章的標題和摘要排除重復和不相關的研究。閱讀剩余文章的全文，根據納入排除標準確定納入的文獻。隨后提取以下數據：(1)文獻一般信息；(2)研究對象一般情況；(3)干預措施(用藥劑量、開始用藥時機、療程等)；(4)結局指標(IVIG治療前后NK細胞數量/活性的變化、活產率、流產率及不良反應)。文獻篩選及數據提取遇到分歧時，請教專家并討論以達成一致。

2.文獻質量評價：采用Cochrane風險偏倚評估工具評價隨機對照研究(RCT)的文獻質量和偏倚風險[11-12]，評價標準包括，隨機分配方法、分配方案隱藏、施者與參與者的盲法、結果評估的盲法、結果數據完整性、選擇性報道、其他偏倚。每一項的偏倚分為“低風險”、“可能存在風險”或“高風險”，除了評估每項的偏倚，還需要進行整體的偏倚評估，如果每項偏倚評估均為低風險，則整體偏倚評估為低風險，為高質量文獻；如果每項均未被評估為高偏倚風險，但任一項的評估結果為可能存在風險，則整體評價為可能存在風險，為中質量文獻；如果任一項被評估為高偏倚風險，或多項的評估結果為可能存在風險且對研究結果的可信度影響較大，則整體評價為高風險，為低質量文獻。

采用紐卡斯爾-渥太華量表(NOS)評價隊列研究[13-14]，NOS評估分為8個特定項目的3個質量參數(選擇、可比性和結果)。NOS評價范圍從0～9顆星。除了與可比性相關的項目允許分配2顆星之外，量表上的每個項目最多可獲得1顆星。滿分9分，<4分為低質量文獻，4～6分為中等質量文獻，7～9分為高質量文獻。

采用Minors量表評價無對照組的單臂試驗研究[15]。Minors量表的最終版本包含12個項目，前8個項目專門用于非比較研究，比較研究則需要包括全部項目。各項目得分“0”為未報告，“1”為報告但不充分，“2”為報告且充分，非比較研究的總分數為16分，總得分越多，研究的質量越高。

三、統計學方法

采用RevMan5.4.1統計軟件進行Meta分析。采用I2檢驗進行異質性分析，若I2<50%時，認為異質性較小，選用固定效應模型進行分析；若I2>50%時，認為多個獨立研究的結果有高度異質性，分析異質性產生原因，并根據不同的給藥時間進行亞組分析，對無法消除異質性的文獻用隨機效應模型合并分析。以P<0.05和95%可信區間(95%CI)表示差異有統計學意義。發表偏倚通過采用“倒漏斗”圖形分析法進行評估。

結 果

一、文獻檢索及篩選流程圖

通過檢索初步得到的研究文獻有1 004篇，其中，中文文獻227篇，英文文獻777篇。閱讀文獻題目及摘要剔除重復，排除文獻968篇，對剩余的36篇文獻通過閱讀全文復篩，排除文獻22篇，最終篩選出14篇文獻[16-29]，檢索及篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程及結果

二、納入研究基本特征

納入的14篇文獻[16-29]，共包含1 393例患者，其中564例采用了IVIG治療、336例采用脂肪劑治療、416例不干預或采用安慰劑治療。其中，12項研究[16-26，28]研究了IVIG治療RSA患者外周血NK細胞數量變化；6項研究[19，22，25-27，29]研究了IVIG治療RSA患者外周血NK細胞活性變化；11項研究[16，18，20，22-29]報告了IVIG治療RSA患者的活產率及流產率，其中4項研究[16，18，20，22]在治療組為IVIG治療而對照組為不干預或安慰劑治療的情況下，研究了RSA患者的活產率及流產率(表1)。

表1 納入文獻的基本特征

三、納入文獻的質量評價

本Meta共納入14篇文獻[16-29]，其中RCT文獻4篇[16，21，24-25]，根據Cochrane風險偏倚評估工具評分均為中質量文獻(圖2)；隊列研究6篇[17-20，22-23]，根據NOS評分，其中4篇[17，19-21]為中質量文獻，2篇[18，22]為高質量文獻(表2)；單臂研究4篇[26-29]，根據Minors量表評分，3篇[26-28]總分為13分，1篇[29]總分為14分，均為高質量文獻(表3)。因中質量文獻為RCT或隊列研究，高質量文獻多數為單臂研究，少數為隊列研究，所以納入的文獻對本Meta的結果穩定性造成一定程度的影響。

圖2 RCT研究的質量評價

表3 單臂研究的質量評價

四、Meta分析結果

1.外周血NK細胞數量：納入的文獻中有12篇[16-26，28]文獻探討了外周血NK細胞數量。經整體異質性檢驗I2=94%，即納入12項研究具有顯著異質性，故選擇隨機模型分析方式，其整體檢驗結果為[I2=94%，95%CI(3.25，6.44)]，合并區間完全位于無效線右側，即具有顯著差異(Z=5.96，P<0.05)。故根據兩次檢測外周血NK細胞數量期間不同的給藥時間來進行亞組分析，Meta分析結果顯示：一次性IVIG給藥治療(1～5 d)的RSA患者，治療后外周血NK細胞數量均顯著低于治療前[I2=22%，95%CI(1.99，3.82)，P<0.05]；連續IVIG給藥的RSA患者，無論是治療至孕12周左右[I2=56%，95%CI(6.46，8.27)，P<0.05]，還是治療至孕中晚期(26～34周)[I2=64%，95%CI(1.15，6.51)，P<0.05]，治療后外周血NK細胞數量均顯著低于治療前(P<0.05)(圖3)。

2.外周血NK細胞活性：納入的研究中有6篇[19，22，25-27，29]探討了外周血NK細胞活性。經整體異質性檢驗I2=64%，即納入6項研究具有顯著異質性，故采用隨機效應模型進行分析。Meta分析結果顯示，IVIG治療后NK細胞活性顯著低于治療前[I2=64%，95%CI(4.30，12.07)，P<0.05](圖4)。

3.活產率：納入的研究中有4篇[16，18，20，22]探討了IVIG治療RSA后活產率的變化情況。經整體異質性檢驗I2=0%，異質性較小，采用固定模型進行分析。Meta分析結果顯示，IVIG治療組的活產率顯著高于不干預或安慰劑治療組[I2=0%，95%CI(3.70，8.56)，P<0.05](圖5)。

4.流產率：納入的研究中有4篇[16，18，20，22]探討了IVIG治療RSA后流產率的變化情況。經整體異質性檢驗I2=0%，異質性較小，故采用固定模型進行分析。Meta分析結果顯示，IVIG治療組流產率顯著低于不干預或安慰劑治療組[I2=0%，95%CI(0.12，0.27)，P<0.05](圖6)。

5.用藥安全性：納入的研究中有5篇[16，18，20，25-26]文獻報告了IVIG治療的不良反應。其中，Morikawa等[26]研究報道了2例頭痛、2例紅斑及2例瘙癢。Meng等[25]研究報道了5例輕度發熱，2例頭痛。劉冬玲等[20]研究報道了6例惡心、26例注射側上肢疼痛、5例頭痛及3例胸悶。岑振考等[16]研究報道了9例輕微性頭痛。雷蕾等[18]研究報道了2例頭痛及1例胃腸道反應(表4)。

圖3 IVIG治療后改善外周血NK細胞數量的Meta分析

圖4 IVIG治療后改善外周血NK細胞活性的Meta分析

圖5 IVIG治療后改善活產率的Meta分析

圖6 IVIG治療后改善流產率的Meta分析

表4 IVIG治療后不良反應發生情況[n(%)]

五、文獻偏倚性分析

對納入研究數量≥10且異質性大(I2>50%)的結局指標(外周血NK細胞數量)檢測發表偏倚，結果可見漏斗圖中各散點分布呈現不對稱分布，提示該結局指標Meta分析納入的文獻存在發表偏倚或其他偏倚(圖7)。

圖7 IVIG治療后外周血NK細胞數量變化的漏斗圖

討 論

RSA的病因主要包括染色體異常、子宮解剖結構異常、內分泌紊亂、感染、遺傳因素、免疫因素和血栓前狀態等。免疫因素是導致RSA的主要原因之一。目前RSA的免疫治療主要包括IVIG，宮腔注射免疫藥物或制劑，如粒細胞集落刺激因子、脂肪乳劑、外周血單個核細胞，或口服糖皮質激素、環孢素、羥氯喹等[6]。IVIG開始是被用作免疫缺陷個體的替代療法。IVIG 制劑的主要成分是血清IgG，它是從數千名供體中匯集而成的，現主要用于治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病，如免疫性血小板減少癥、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經根神經病、川崎病和格林-巴利綜合征等[30]。IVIG可以影響Th1/Th2細胞因子比率并使之向Th2反應轉變，增加調節性T細胞(Tregs)并減少Th17，同時阻斷抗HLA抗體的功能，防止補體激活，并下調不同免疫細胞表面的刺激性Fc受體(FcgRI和FcgRIII)和上調抑制性受體(FcgRIIB)[31-32]。此外，IVIG還可以通過降低NK細胞數量、細胞毒性和增加NK抑制受體來改善妊娠結局[22，33]。

NK細胞是母胎界面的主要免疫細胞，子宮蛻膜中包含大量的NK細胞，在維持母胎界面免疫耐受中起重要作用。NK細胞通過產生粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α等細胞因子，生產特定的趨化因子如白細胞介素-8、干擾素誘導蛋白-10和基質細胞衍生因子1，表達血管生成素1、血管生成素2、血管內皮生長因子-C以及轉化生長因子-1等血管生成因子，促進子宮內膜蛻膜化、促進血管生成及子宮螺旋動脈重塑、促進滋養細胞侵襲，從而維持母胎界面的免疫耐受，增加妊娠成功的可能[34-36]。NK細胞具有獨特的表型特征，外周血NK細胞的表型絕大多數為CD56dimCD16+，少部分為CD56brightCD16+或CD56brightCD16-；而子宮內膜NK細胞(dNK)的表型主要是CD56brightCD16-，少數為CD56brightCD16+；CD56dim型NK細胞比CD56bright型NK細胞有更大的細胞毒性，而CD56bright型NK細胞較CD56dim型NK細胞分泌功能更強[37-40]。因此，dNK相較于外周血NK細胞具有細胞毒性低、細胞因子產生能力強的特點。有研究認為，IVIG治療可以通過改變NK細胞數量及活性等來改善RSA患者的妊娠結局[7-8]，而部分研究認為，IVIG治療對妊娠結局無益[9-10]。因此，通過Meta分析對存在爭議的研究進行合并以期得出較為合理的結論。

研究表明，RSA患者外周血NK細胞數量及活性顯著高于正常婦女[38-39]。Wang等[40]利用單細胞 RNA測序比較了正常妊娠和不明原因RSA患者在妊娠早期蛻膜和外周白細胞的細胞和分子特征，研究發現，與正常妊娠的患者相比，RSA患者促炎狀態明顯增強，支持胚胎生長的蛻膜NK1細胞(dNK1細胞)比例顯著降低，而具有細胞毒性和免疫活性特征的dNK3細胞比例顯著增加，同時，因高表達“記憶”NK細胞的標記基因LILRB1而被認為參與不明原因RSA反復不良妊娠結局的dNK4細胞比例也顯著增加。由以上結果推測，dNK1細胞百分比增加，dNK3細胞及dNK4細胞的百分比減少可能對妊娠結局有益。IVIG治療有抗炎及免疫調節作用[30，41]，通過降低外周血NK細胞數量及毒性來改善妊娠結局[7-8，22]。王柳柳等[42]研究發現，IVIG治療后的有反應組(外周血NK細胞比例較治療前下降≥15%)的活產率顯著高于無反應組(外周血NK細胞比例較治療前下降<15%)。本Meta研究結果表明，IVIG治療能顯著降低外周血NK細胞數量及活性，顯著提高活產率、并顯著降低流產率。這可能是由于IVIG治療減輕了RSA患者的炎癥反應，降低了部分蛻膜NK細胞(dNK細胞)亞型的數量與毒性，從而提高了RSA患者的活產率、降低流產率。目前，關于外周血NK細胞與dNK細胞的關系仍不是非常清楚。有研究發現，dNK細胞由外周血NK細胞招募而來[43]，流產時RSA患者外周血NK細胞變化情況能反映流產期間dNK細胞的變化[44-45]，但以上結論證據較少且機制不明。另外一些研究則認為，外周血NK細胞和dNK細胞無顯著相關性[46-47]。由于內膜活檢為有創操作，關于IVIG治療前后dNK細胞改變相關的研究較難以進行，因此，IVIG治療RSA，雖然其外周血NK細胞數量及活性變化顯著，但沒有足夠的證據能夠表明dNK細胞與外周血NK細胞成正相關。

由于IVIG治療RSA對改善外周血NK細胞數量的Meta分析存在較大的異質性(I2=94%)，本Meta分析按不同的用藥療程進行了亞組分析，降低了各亞組間的異質性(各亞組I2分別為22%、56%、64%)，說明不同的研究方案是異質性的來源。但是，本Meta分析仍存在一些局限性，如納入的文獻質量中，中質量文獻較多，高質量較少；納入多種文獻類型，異質性較大；總樣本量不大，關于活產率及流產率的樣本量更少。這是由于在篩選文獻的過程中發現，陰性結果的文獻較少，有部分陰性結果的文獻無法提取數據，致使樣本量更少且存在偏移。由于大部分納入的文獻是在確定妊娠后給予IVIG治療，因此不能分析IVIG治療RSA能否提高妊娠率。

總之，雖然本Meta分析結果顯示，IVIG治療有利于改善RSA患者的妊娠結局，可以在符合適應證人群應用。但因本研究納入多種類型的研究、異質性大、總樣本量不大等局限性，因此本Meta分析結論需謹慎解讀，仍需大規模、多中心的高質量RCT研究針對不同人群、用藥時機及用藥劑量及療程、治療機制，而且外周血NK細胞與dNK細胞的相關性及其機制仍需納入大量研究來進一步探索。