PEG10對人類絨毛滋養層細胞系HTR-8/Svneo細胞增殖和凋亡影響的初步研究

張云山，董麗娟，許麗華，馬天仲

(廣東醫科大學附屬醫院 1.生殖醫學中心；2.健康管理中心，湛江 524001)

復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)有不同的定義。中華醫學會婦產科分會將RSA定義為與同一性伴侶在妊娠28周前連續遭受3次或3次以上的胎兒丟失[1]。RSA病因復雜，目前研究認為主要包括遺傳因素、子宮解剖異常、感染因素、內分泌異常、血栓前狀態、免疫紊亂、孕婦的全身性疾病及環境因素等[1-3]，此外有40%～50%病因不明，稱為不明原因復發性流產(unexplained recurrent spontan eous abortion，URSA)[4-6]。探究RSA的病因，尤其是URSA的病因，能為診治提供科學的理論依據，為患者提供合理可靠的生育指導依據。

父系表達基因10(PEG10)是父系表達而母系印記的一種來自反轉錄轉座子的印記基因[7]，被發現定位于7q21，在成人和胚胎組織中表達，在胎盤中顯著表達。其在哺乳動物物種中是高度保守的，保留7個核苷酸(GGGAAAC)。該基因在細胞增殖、分化和凋亡中發揮作用，是一個與腫瘤的增殖、凋亡和轉移有關的癌基因。已經發現PEG10在多種癌癥中呈陽性表達，其表達調控機制似乎很復雜。有研究表明PEG10在胎盤發育中的關鍵作用，在妊娠早期保持足夠的PEG10水平可能很重要，PEG10水平較低可能是導致不可避免流產的原因之一[8]。但是，PEG10在胎盤形成過程中的確切功能仍有待闡明。本研究通過研究父系表達印記基因PEG10低表達對人類絨毛滋養層細胞系HTR-8/Svneo細胞增殖和凋亡的影響，推測PEG10與URSA的相關可能機制。

材料與方法

一、材料和試劑

人絨毛膜滋養層細胞系HTR-8/Svneo細胞(購自BeNa Culture Collection并由本實驗室保存)。PEG10干擾載體si-RNA[si-898、si-1854、si-1951及對照(si-NC)]委托蘇州吉瑪生物科技有限公司合成。

胎牛血清(FBS；Gibco，澳大利亞)；lipofectamine 3000轉染試劑(Thermo，美國)；PrimeScript RT reagent試劑盒、STBR GREEN Taq PCR MIX(Takara，日本)；1640培養基(Gibco，美國)；MTT 分析試劑盒(上海艾博抗)；細胞周期檢測試劑盒(杭州聯科生物)；Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(BD，美國)；Trizol試劑(Invitrogen，美國)；其他試劑均為國產分析純。

羅氏LightCycler480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；流式細胞儀(BD FACSCantoTMⅡ，美國)。

二、方法

1.細胞培養與siRNA轉染：轉染前一天，將HTR-8/Svneo細胞以合適的密度接種到6孔板上，10%的FBS培養24 h，待細胞達到80%的融合。配制溶液A：250 μl 無血清培養基+5 μl lipofectamine 3 000/孔，溫育5 min；溶液B：250 μl無血清培養基+5 μl(20 μmol/L) 不同片段的siRNA/孔；溶液A與溶液B混合，室溫下置20 min。與此同時，將6孔板中的細胞用無血清培養基沖洗兩遍后，將溶液A與B的混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻。在37℃、5%CO2孵育5 h，其間每隔30～60 min輕輕搖動細胞培養板一次，以促進轉染。每個孔中加入無血清、無雙抗的培養基2 ml在37℃、5%CO2繼續培養19 h后，熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測轉染效果。

2.細胞RNA提?。杭毎幚斫K點結束，棄去上次培養基，用PBS沖洗一遍，然后每孔加1 ml Trizol，室溫靜止5 min，用移液槍吹打后將液體轉移至1.5 ml EP管中，加入200 μl氯仿振蕩混勻室溫靜止5 min，12 000g4℃離15 min。此時液體分3層，無色上清為RNA層，中間白色薄層為蛋白層，帶顏色的下層為DNA。將上清轉移至新的1.5 ml EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇室溫靜置10 min，12 000g4℃離心15 min。此時可見管底少量白色沉淀，輕輕將管中液體吸干保留沉淀，向沉淀中加入1 ml 75%乙醇清洗沉淀，12 000g4℃離心5 min，棄上清保留沉淀，靜置干燥，然后將沉淀溶解于20 μl DEPC處理水中。

3.逆轉錄反應：(1)根據說明書配制去基因組混合液10 μl(2.0 μl 5×gDNA Eraser Buffer、 1.0 μl gDNA Eraser、2.0 μl Total RNA、5.0 μl RNase Free dH2O)，混勻后42℃反應2 min。(2)逆轉錄反應：根據SYBRGreen qPCR反應的檢測條件，配制逆轉錄反應液(10.0 μl去基因組反應的混合液、4.0 μl 5×PrimeScript Buffer2、1.0 μl PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、1.0 μl RT Primer Mix、4.0 μl RNase Free dH2O)，混勻后37℃反應15 min。

4.實時熒光定量PCR反應：配制熒光定量PCR反應液，反應體積為20 μl(10.0 μl SYBRPrime Ex TaqTMⅡ 、0.8 μl PCR Forward Primer、0.8 μl PCR Reverse Primer、2.0 μl DNA模板、 6.4 μl dH2O)。人PEG10、CytochromeC、Bid、Bak、Bax、Caspase3、CyclinD1和內參β-actin引物序列均由上海生工公司設計并合成(表1)。反應條件為95℃ 30 s；然后按95℃ 5 s、60℃ 20 s擴增40個循環。

表1 PCR引物序列

熒光定量PCR結果分析：熒光定量PCR反應結束后，PCR擴增儀會自動分析并得出Ct值，采用2-△△CT法計算樣品mRNA的表達量。

5.細胞周期的檢測：細胞經轉染24 h后，棄去培養液，收集細胞，加入預冷PBS洗滌細胞1次，離心棄去上清，加入-20℃預冷的無水乙醇1 ml，輕輕吹打混勻，-20℃固定過夜；離心去除乙醇，PBS清洗兩次，加入100 μl RNase A并充分懸浮細胞，37℃水浴20 min，加入400 μl的PI溶液并充分混勻，4℃避光孵育30 min。流式細胞儀在激發波長488 nm處檢測紅色熒光，并用分析軟件進行DNA含量分析。

6.HTR-8/Svneo細胞凋亡檢測：根據Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明書，具體操作如下：取轉染后24 h的細胞，PBS清洗2次，每管加入預先配制的1×binding buffer 100 μl，吹打細胞使細胞充分重懸，避光條件下每管分別加入7-AAD和Annexin V-PE各5 μl，并用移液槍輕輕混勻；室溫避光孵育30 min，每管在加入400 μl的1×binding buffer，混勻后避光條件下將細胞懸液轉移到流式管中，30 min內在流式細胞儀上機檢測。

7.MTT法檢測細胞增殖活力：取生長狀態良好的細胞按1×104/孔接種到96孔板中，培養過夜；根據實驗分組處理后，去除培養基，向每孔加入配制好的100 μl的MTT工作液，繼續孵育2 h，取出加入DMSO溶液150 μl，孵育15 min后，酶標儀下測定570 nm處的吸光度。

三、統計學分析

結 果

一、PEG10 si-RNA轉染效率的檢測

PEG10不同干擾載體(si-898、si-1854、si-1951)及對照(si-NC)分別轉染到HTR-8/Svneo細胞中，24 h后收集細胞，提取RNA反轉錄，熒光定量PCR檢測PEG10的表達。結果表明：與對照組比較，轉染si-898、si-1854、si-1951的si-RNA，HTR-8/Svneo細胞中PEG10基因表達均顯著下降(分別為t=5.947，P=0.004；t=11.41，P=0.003；t=3.819，P=0.018 8)，并且si-898和si-1854的抑制效果更顯著(圖1)。因此在后續研究中我們選取si-898和si-1854做進一步研究。

與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。圖1 PEG10 si-RNA轉染效率檢測

二、干擾PEG10基因，增加細胞促凋亡基因的表達

1.qRT-PCR檢測CytochromeCmRNA表達：與對照組相比，轉染si-898和si-1854組，CytochromeC的基因表達顯著上升(分別為t=7.275，P=0.001 9；t=6.603，P=0.002 7)(圖2)。

與對照組比較，*P<0.01。圖2 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后Cytochrome C mRNA的表達水平

2.qRT-PCR檢測Caspase3 mRNA表達：與對照組相比，轉染si-898和si-1854組Caspase3的基因表達顯著上升(t=7.200，P=0.002 0；t=4.715，P=0.009 2)(圖3)。

與對照組比較，*P<0.01。圖3 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后Caspase3 mRNA表達水平

3.qRT-PCR檢測BaxmRNA表達：與對照組相比，轉染si-898和si-1854組Bax基因表達顯著上升(分別為t=10.890，P=0.000 4；t=20.200，P<0.000 1)(圖4)。

與對照組比較，*P<0.001。圖4 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后Bax mRNA表達水平

4.qRT-PCR檢測BakmRNA表達：與對照組相比，轉染si-898和si-1854組Bak基因表達顯著上升(分別為t=5.200，P=0.006 1；t=9.877，P=0.000 6)(圖5)。

與對照組比較，*P<0.01。圖5 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后Bak mRNA表達水平

5.qRT-PCR檢測BidmRNA表達：與對照組相比，轉染si-898和si-1854組Bid基因表達顯著上升(t=2.998，P=0.007 7；t=4.698，P=0.000 2)(圖6)。

與對照組比較，*P<0.01。圖6 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后Bid mRNA表達水平

三、干擾PEG10基因，降低細胞周期Cyclin D1 mRNA的表達

qRT-PCR檢測CyclinD1 mRNA表達：與對照組相比，轉染si-898和si-1854組CyclinD1基因表達顯著降低(分別為t=2.822，P=0.047 7；t=3.518，P=0.024 5)(圖7)。

與對照組比較，*P<0.05。圖7 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后Cyclin D1 mRNA表達水平

四、干擾PEG10基因后HTR-8/Svneo細胞周期檢測

與對照組比較，轉染si-898和si-1854組細胞主要停滯在G1期，分別為70.2%和75.6%(分別為t=6.501，P=0.002 9；t=9.893，P=0.000 6)(圖8)。

五、干擾PEG10基因后HTR-8/Svneo細胞凋亡檢測

與對照組比較，轉染si-898和si-1854組Q2期細胞早期凋亡和Q4期細胞晚期凋亡均顯著升高(t=5.365，P=0.005 9；t=9.203，P=0.000 9)(圖9)。

六、干擾PEG10基因后細胞增殖活力的表達

MTT法檢測干擾PEG10基因后HTR-8/Svneo細胞增殖活力。結果表明：與對照組比較，轉染si-898和si-1854組24 h后，細胞增殖活力差異無統計學意義(分別為t=0.575 2，P=0.596 0；t=1.270，P=0.272 9)；轉染si-898和si-1854組48 h后，細胞增殖活力與對照組相比顯著降低(分別為t=2.924，P=0.043 1；t=2.881，P=0.045 9)；轉染si-898和si-1854組72 h后，細胞增殖活力與對照組相比顯著降低(分別為t=4.138，P=0.014 4；t=4.784，P=0.008 8)(圖10)。

A：流式細胞檢測；B：S+G2期細胞比例；與對照組比較，*P<0.01,#P<0.001。圖8 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后的細胞周期表達

A：流式細胞檢測；B：細胞凋亡水平比較；與對照組比較，*P<0.01，#P<0.001。圖9 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA后細胞凋亡水平

與對照組比較，#P<0.05，*P<0.01。圖10 HTR-8/Svneo細胞轉染PEG10 si-RNA不同時間點(24 h、48 h、72 h)的增殖活力

討 論

PEG10的過度表達與一些惡性腫瘤發生相關，如肝細胞癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤及乳腺癌[9-11]。PEG10在滋養層細胞增殖中起著重要的作用，通過TIMP-1促進滋養細胞侵襲[12]。敲除PEG10基因的小鼠表現出早期胚胎停止發育與胎盤缺陷，表明這種基因對胚胎發育的重要性[13]。在人類也有同樣的發現，PEG10基因印記丟失與胎兒存活和胎盤發育不良相關[14]。在對流產胚胎研究發現，中期流產PEG10基因表達上調，晚期流產PEG10基因表達下調[15]。我們團隊通過基因芯片篩選出重要的印記基因的DMR區甲基化水平，其中不明原因復發性流產和早期妊娠自愿人工流產兩組絨毛中印記基因PEG10的DMR區平均甲基化水平有差異，PEG10基因的DMR區平均甲基化水平在不明原因復發性流產者絨毛(35.7%)和早期妊娠自愿人工流產者絨毛(23.8%)間有顯著差異(P<0.05)[16]。Su等[17]在對克隆牛的研究中發現，PEG10在存活的轉基因克隆牛的胎盤上的甲基化水平與對照組差異不顯著，但PEG10基因在圍產期死亡且有發育缺陷的轉基因克隆牛的胎盤上表現超甲基化水平。說明PEG10基因在胎盤上可能重編程紊亂，該去除的印記反而保留，該保留的印記卻去除，導致胎盤發育異常，后者可能進而導致胚胎停止發育。

我們在本研究中細胞水平上發現，下調絨毛細胞PEG10 mRNA的表達，CytochromeC、Caspase3、Bid、Bak、BaxmRNA的表達明顯增高，而CyclinD1 mRNA的表達明顯降低。眾所周知Bid、Bak、Bax為Bcl-2家族促凋亡蛋白，由于各種不良因素的觸發，細胞內部的凋亡信號激活并傳遞到線粒體，通過存在于線粒體外膜上的Bid、Bim等能直接激活Bax和Bak，觸發CytochromeC的釋放[18]。CytochromeC是線粒體啟動凋亡程序的關鍵物質[19]，CytochromeC即可通過與一個大的蛋白Apaf-1 相互作用，使后者發生構象變化，成為激活的形式，再與輔因子ATP(或dATP)結合，形成凋亡復合體(Apoptosome)。凋亡復合體的主要功能是招募Caspase9 的前體Pro-Caspase9，激活其切割自身的一段序列。被切下的蛋白片段仍然與Caspase9的其他部分相互結合，這些組分一同構成了凋亡全酶(Holoenzyme)。凋亡全酶隨后招募并切割Caspase3和Caspase7，Caspase3、7是細胞凋亡的效應胱天蛋白酶，是細胞凋亡的執行者[20-21]，而這兩者隨后切割細胞中已知超過100種的底物，并導致細胞凋亡。本實驗在一定程度上說明Cytochrome C、Caspase3、Bid、Bak、Bax等在PEG10誘導的絨毛細胞凋亡中發揮了作用。由此可以推斷，絨毛細胞凋亡的確可能在胎盤發育缺陷繼而引起胚胎停止發育中發揮著重要的作用。

細胞周期是增殖細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束所經歷的時期和順序變化，是保證細胞進行生命活動的基本過程，服從G1-S-G2-M的演變過程，其中G1/S和G2/M為兩個關鍵點[22-23]。細胞周期蛋白(Cyclin)是一類對細胞周期起關鍵調控作用的蛋白。其中，Cyclin D1是細胞周期G1/S期轉換的重要正向調控因子，在G1期細胞增殖過程中起關鍵作用[24]。Cyclin D1通過結合并激活G1時期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的Rb蛋白從其所結合的E2F轉錄因子上解離，E2F轉錄因子起始轉錄活細胞周期的基因，從而推動細胞周期由G1時期進入到S時期。細胞一旦從G1期進入S期，細胞則自動完成分裂過程。G1期決定細胞繼續增殖進入G2期，還是進入終末分化或死亡。在腫瘤的研究顯示，Cyclin D1的過度表達能促進癌細胞的增殖，其與過量表達促進細胞G1-S期的轉換有關，降低Cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平，引起細胞周期的停滯，顯著抑制細胞的增殖和移植瘤的生長[25]。在我們的研究中發現，下調絨毛細胞PEG10 mRNA的表達，CyclinD1 mRNA的表達明顯降低，同時流式細胞檢測結果顯示干擾PEG10后，HTR-8/Svneo細胞G1期的細胞數量明顯增多，S+G2期的細胞數量減少。說明由于Cyclin D1的低表達阻止了G1期到S期的進程，引起細胞周期的停滯，誘導絨毛細胞的凋亡。MTT法細胞增殖活力檢測顯示干擾PEG10后，HTR-8/Svneo細胞48 h、72 h后增殖活力下降，說明下調PEG10的表達，可以降低絨毛細胞的增殖活力，從而影響胎盤的發育。

總之，本研究表明下調絨毛細胞PEG10 mRNA的表達，可通過激活細胞凋亡通路及阻滯細胞周期，從而誘導絨毛細胞凋亡，降低其增殖活力。然而，這些僅是體外mRNA水平的研究，蛋白水平的研究及動物模型體內的相關研究才能更進一步驗證其作用機制。