凍融單囊胚移植中囊胚內細胞團和滋養層評分對妊娠結局及新生兒出生結局的影響

伏海燕，李美玲，許娟娟，陳莉，李曉艷，林瑩，周城，吳蓉花，王慧，黃夢婷，姚兵

(中國人民解放軍東部戰區總醫院生殖醫學科，南京 210002)

隨著囊胚培養技術和體系的不斷成熟和完善，囊胚移植在臨床上得到廣泛應用。囊胚培養跨過胚胎基因組激活階段[1]，通過該階段的自然選擇，淘汰掉發育潛能較差的胚胎，有囊胚形成的胚胎往往具有較高的種植潛能[2]，以此提高胚胎的著床率和活產率[3-4]。與卵裂期胚胎相比，囊胚移植可顯著提高臨床妊娠率和活產率[5]。而相比于兩枚囊胚的移植，單囊胚移植可以達到相似的臨床妊娠率，且由于降低了移植胚胎的個數從而可以顯著降低多胎妊娠的風險[6]。因此如何挑選出發育潛能最佳的囊胚用于移植，是單囊胚移植能否成功的關鍵因素之一。

目前篩選優質囊胚的方法主要還是依賴于Gardner形態性評價體系[7-8]，該體系主要指標是囊胚的擴張程度、內細胞團(ICM)質量和滋養層細胞(TE)質量。有研究發現ICM評級較TE評級對臨床妊娠率和活產率有更高的預測價值，而囊胚不同發育速度和質量評級對新生兒結局無明顯影響[9]。也有研究認為囊胚發育速度、ICM等級、TE等級及囊胚擴張程度均與整倍體胚胎復蘇移植周期早期妊娠結局無明顯相關性[10]。關于囊胚的發育速度和種植潛能的關系目前仍存在爭議，有文獻報道囊胚的發育速度對囊胚的種植潛能影響更為關鍵，其研究發現第5天(D5)形成的囊胚種植潛能高于D6形成囊胚組[11-12]；但也有不一致的觀點，有研究發現D5優質囊胚移植后的臨床妊娠結局與D6優質囊胚類似[13]。因此，本研究回顧性分析本中心行單囊胚凍融胚胎移植(FET)患者的臨床資料，旨在探討FET周期中不同的囊胚質量對臨床結局和新生兒出生結局的影響，為臨床實踐中選擇發育潛能最佳的囊胚進行移植提供依據。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2015年1月至2021年12月期間在本科室接受FET單囊胚移植患者的臨床資料，共1 647個周期。

納入標準：(1)患者年齡≤38歲；(2)行FET單囊胚移植；(3)促排卵方案為激素降調節方案。排除標準：(1)行胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)的周期；(2)存在子宮畸形、子宮內膜異位癥、子宮腺肌病、子宮內膜息肉等影響子宮內膜容受性的疾?。?3)促排卵方案為微刺激、自然周期、黃體期促排卵、高孕激素狀態下促排卵方案等溫和刺激方案；(4)供卵、供精周期；(5)行卵子冷凍的周期。

本研究中所有囊胚的擴張程度均為3～6期。根據囊胚ICM和TE評分級別進行分組：A組(移植AA級囊胚)231個周期；B組(移植AB/BA級囊胚)422個周期；C組(移植BB級囊胚)885個周期；D組(移植CB/BC級囊胚)109個周期。

二、研究方法

1.促排卵及體外受精：納入本研究的所有患者均采用激素降調節方案促排卵。當主導卵泡平均直徑≥18 mm時，予HCG(珠海麗珠醫藥)5 000～10 000 U扳機，36～38 h后采用超聲引導下的卵泡穿刺術取卵。所有獲得的卵母細胞均置于37℃、5%CO2、5%O2培養箱中培養。根據取卵日男方精液狀況決定授精方式，處理后男方精子總數達到IVF加精標準的患者行IVF，男方因素不育或未達IVF加精標準的患者行ICSI。授精后4.5 h脫除卵母細胞顆粒細胞，確定卵母細胞成熟度和雙極體(2PB)情況，若卵母細胞2PB數/MⅡ卵數≤30%，行補救ICSI(R-ICSI)；受精后16～18 h觀察卵子受精情況。

2.胚胎培養和評級：胚胎置于37℃、5%CO2、5%O2培養箱中培養至第3天，觀察胚胎的卵裂情況，并根據伊斯坦布爾共識[14]對卵裂期胚胎進行評分。細則如下：Ⅰ級(4分)：胚胎卵裂球等大，形態規則，胞質均勻清晰，碎片率少于10%；Ⅱ級(3分)：胚胎卵裂球大小不均，形態欠規則，碎片率10%～25%；Ⅲ級(2分)：胚胎卵裂球大小嚴重不均，形態欠規則，碎片率30%～50%；Ⅳ級(1分)：碎片率大于50%。Ⅰ～Ⅱ級卵裂期胚胎為優質胚胎，可以冷凍或移植；Ⅲ級卵裂期胚胎為非優質胚胎，可以繼續培養至囊胚。

囊胚評估采用Gardner評分標準[7-8]進行評分，分別在第5～7天觀察并對形成的囊胚進行評分。評分細則如下：根據囊胚腔的擴張程度分為6個時期，分別為1期(早期囊胚，囊胚腔體積<囊胚總體積的一半)、2期(囊胚腔體積>囊胚總體積的一半)、3期(完全擴張囊胚，囊胚腔體積占據整個囊胚)、4期(擴張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴大，透明帶變薄)、5期(正在孵出囊胚，囊胚正從透明帶裂口孵出)和6期(完全孵化囊胚，囊胚完全從透明帶中孵出)。根據ICM和TE細胞數量多少及形態分為3個等級，分別為A級(ICM細胞數多且排列緊密；TE細胞數多，形成緊密的上皮)、B級(ICM細胞數少，松散；TE細胞數少，上皮松散)、C級(ICM細胞數很少或幾乎沒有，TE細胞很少或僅由幾個稀疏細胞組成)。囊胚的擴張程度在3～6期，TE和ICM評分均在B級以上即定義為優質囊胚；囊胚評分在3BC/3CB及以上即可冷凍或移植。

卵裂期胚胎和囊胚均采用玻璃化冷凍技術進行冷凍，具體操作參照玻璃化冷凍試劑盒(Kitazato，日本)說明書進行。

3.FET：子宮內膜準備方案包括自然周期、人工周期和激素替代周期方案。移植當日內膜厚度達到7 mm方可移植。

移植當日解凍患者囊胚，解凍具體方法參照玻璃化解凍試劑盒(Kitazato，日本)說明書進行。解凍后的囊胚行激光輔助孵化后放入囊胚培養液(SAGE，美國)中置于37℃、5%CO2、5%O2培養箱中培養2 h，觀察囊胚擴張情況。

4.主要觀察指標和妊娠結局判定：本研究主要觀察指標有移植后臨床妊娠率、流產率、活產率等。具體定義如下：移植后14 d測血HCG，移植后28 d行超聲檢查可見孕囊及監測到胎心搏動者為臨床妊娠。分娩妊娠≥28周的存活嬰兒定義為活產；妊娠≥28周且<37周間分娩者即早產。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；活產率=活產分娩周期數/移植周期總數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；早產率=早產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

本研究還觀察了新生兒出生結局方面的指標，主要有新生兒男女性別比、單胎分娩孕周、出生體重，及低出生體重(LBW)、極低出生體重(VLBW)、巨大兒(HBW)、極小于胎齡兒(VSGA)、小于胎齡兒(SGA)、大于胎齡兒(LGA)和極大于胎齡兒(VLGA)的發生情況。且為了排除多胎對新生兒出生體重、出生缺陷、是否早產以及是否剖宮產的影響，本研究僅對單胎分娩新生兒的出生結局指標進行分析。

三、統計學分析

結 果

一、單囊胚FET周期各組患者一般資料及促性腺激素(Gn)使用情況比較

本研究共納入1 647個單囊胚FET周期，其中移植AA級單囊胚231個周期(A組)，移植AB/BA級單囊胚422個周期(B組)，移植BB級單囊胚885個周期(C組)，移植CB/BC級單囊胚109個周期(D組)。4組患者間平均年齡、體質量指數(BMI)、基礎性激素水平、不孕年限、授精方式及Gn總量、Gn天數比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、單囊胚FET周期各組患者妊娠結局和新生兒出生結局比較

1.FET妊娠結局：各組患者的臨床妊娠率、流產率及活產率組間比較均有顯著性差異(P<0.01)，且隨著ICM和TE評分的下降(從A組到D組)，臨床妊娠率和活產率有逐漸下降的趨勢，流產率則有逐漸上升的趨勢。各組間的早產率比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

2.新生兒出生結局：截至2021年12月31日，A、B、C及D組活產的新生兒分別是113例、167例、357例和25例。新生兒出生性別比4組間有顯著性差異(P<0.05)，A、B組出生的男嬰比例有明顯上升趨勢，而D組出生女嬰比例有明顯上升趨勢(表3)。各組分娩的新生兒出生孕周、出生體重(表3)及LBW、HBW、SGA、LGA等異常出生體重發生率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表1 各組患者的一般資料比較 [(-±s)，n(%)]

表2 各組患者妊娠結局比較(%)

表3 各組新生兒出生情況比較 [(-±s)，%]

表4 各組新生兒異常出生體重分類比較[n(%)]

三、影響囊胚發育潛能的其他相關因素在各組間的比較

根據囊胚的發育特點，對可能影響囊胚發育潛能的其他因素(包括D3胚胎評分、D3胚胎細胞數以及囊胚擴張程度、囊胚發育速度)進一步分析。各組間不同D3胚胎評分和D3胚胎細胞數的周期數占比存在顯著性差異(P<0.01)。A組AA級囊胚中既往D3胚胎評分為Ⅰ級和Ⅱ級的優質胚胎占比達77.49%(179/231)，7～9細胞占比達76.62%；而在D組CB/BC級囊胚中既往D3胚胎評分為優質胚胎的比例顯著下降，僅為45.87%(50/109)，7～9細胞數占比為60.55%(表5)。

各組間不同囊胚擴張程度和囊胚形成時間的周期數占比亦存在顯著性差異(P<0.01)。各組間囊胚的擴張程度分布不均，但均以4期囊胚為主；囊胚的形成時間也不均衡，A組(AA級囊胚)在D5發育為囊胚的周期數占比高達93.94%，而D組(CB/BC級囊胚)較多于D6發育為囊胚，占比達74.31%(表5)。

表5 不同D3胚胎評分、胚胎細胞數及囊胚擴張程度、形成時間在各組間的分布情況[n(%)]

四、對單囊胚FET周期臨床妊娠率和活產率的多因素Logistic回歸分析

對臨床妊娠率的影響因素進行多因素Logistic回歸分析發現，女方年齡、BMI、不孕年限、D3胚胎細胞數、D3胚胎評分、囊胚擴張程度、囊胚形成時間對臨床妊娠率的影響無統計學意義(P>0.05)。而隨著囊胚ICM和TE評級的增高，臨床妊娠率越高，且其影響具有統計學意義(P=0.000)(表6)。

對活產率的影響因素進行多因素Logistic回歸分析發現，BMI、不孕年限、D3胚胎細胞數、D3胚胎評分、囊胚擴張程度、囊胚形成時間對活產率的影響無統計學意義(P>0.05)。而女方年齡、囊胚ICM和TE評級對活產率的影響具有統計學意義(P<0.05)(表6)。

表6 臨床妊娠率和活產率的多因素回歸分析

討 論

如何篩選具有較高發育潛能的囊胚是單囊胚移植中非常重要的問題。本研究納入1 647個單囊胚FET周期進行分析，結果表明囊胚的ICM和TE評級對判斷囊胚的發育潛能具有一定價值，這與之前較多的文獻報道類似。目前Gardner囊胚的評分標準[7-8]和人類IVF-ET實驗室操作專家共識[15]均將ICM和TE評級作為評估囊胚質量的重要指標之一。Guo等[16]研究發現囊胚的ICM和TE評級為活產率的獨立影響因素。Shi等[17]的研究結果表明囊胚的ICM質量是整倍體囊胚發生流產的潛在因素，A級ICM的囊胚移植后流產率顯著低于B級。因此本研究以囊胚的ICM和TE評級這兩個指標進行分組，分析發現隨著囊胚ICM和TE評級的逐漸下降，囊胚移植后的臨床妊娠率和活產率亦逐漸下降，流產率則逐漸上升。本研究結果顯示，ICM和TE評級均為A的囊胚移植后(A組)的臨床妊娠率為66.67%、活產率為48.92%，數據在4組中最高；流產率11.69%，為4組中最低。而ICM和TE評級為CB/BC的囊胚移植后(D組)的臨床妊娠率37.61%、活產率22.94%，顯著低于其他組；流產率34.15%，顯著高于其他組(P均<0.05)。提示囊胚的ICM和TE綜合評級可作為預測囊胚發育潛能的重要指標之一。

關于囊胚的發育速度是否會影響移植后的臨床結局仍存在爭議。Ferreux等[11]研究發現D6囊胚移植組與D5囊胚移植組相比活產率顯著下降(29.6% vs. 17.0%，P<0.01)，D6優質囊胚形成率亦顯著低于D5優質囊胚形成率(82% vs. 68%，P<0.001)，提示D6囊胚組的活產率下降可能是由于優質囊胚率下降導致的。而陳麗娜等[9]對938個優質單囊胚FET周期的數據進行分析發現，D5單囊胚移植組與D6單囊胚移植組有相似的活產率。本研究中以囊胚形成時間作為囊胚發育速度的指標，Logistic多因素分析的結果顯示，囊胚的發育速度不是臨床妊娠率和活產率的獨立影響因素(P>0.05)。因此我們認為只要是優質囊胚移植，囊胚自身的發育速度并不明顯影響囊胚種植后的妊娠結局。

本研究中，不同D3胚胎評分和細胞數在各組間的分布是不一致的，A組的AA級囊胚主要來源于Ⅰ級和Ⅱ級胚胎(占比達77.49%)，而D組CB/BC級囊胚來源于Ⅰ級和Ⅱ級胚胎的比例顯著下降，僅為45.87%；形成的可移植囊胚中來源于4～6細胞D3胚胎的比例從A組的3.46%上升至D組的30.28%；且D3胚胎中發育速度較慢的胚胎在D組的分布相對較多(6.42%)。提示低評分囊胚多來源于D3評分較低且發育速度較慢的胚胎。Li等[18]研究發現，隨著D3胚胎評級的下降，囊胚形成率也顯著下降(P<0.01)，尤其是Ⅲ級胚胎與Ⅰ級胚胎之間，下降趨勢有顯著性差異(P<0.01)。Herbemont等[19]研究發現，D3/D2胚胎的評級對優質囊胚的種植潛能沒有明顯影響；我們的研究結果與之類似，本研究中多因素Logistic回歸分析結果表明D3胚胎評分和細胞數不是臨床妊娠率和活產率的獨立影響因素，提示只要有囊胚形成，D3胚胎的評分和細胞數的多少并不明顯影響該囊胚的種植潛能。

本研究還觀察了不同ICM和TE評級的囊胚移植后新生兒出生結局情況，4組間早產率、新生兒出生孕周、出生體重和LBW等發生率比較均無顯著性差異(P>0.05)。提示不論是優質囊胚還是非優質CB/BC級囊胚，雖然臨床妊娠率和活產率有顯著性差異，但是一旦獲得活產，新生兒出生情況差異并不明顯；但尚不能排除由于樣本量較少而造成的結論偏倚。本研究結果與何于夏等[20]的研究類似。然而，本研究中4組間的出生嬰兒性別比有顯著性差異(P<0.05)，提示囊胚ICM和TE評級可能與出生性別比有一定關聯。Maalouf等[21]也有類似的發現，他們分析了英國10年間經ART治療出生的106 066個新生兒，其數據顯示單囊胚移植后分娩的新生兒出生性別比顯著上升(P<0.05)。

綜上所述，在單囊胚FET周期中，囊胚的ICM和TE評分較為關鍵，是臨床妊娠率和活產率的獨立影響因素；其可作為移植后預測妊娠結局的一個重要參數，為臨床上單囊胚移植策略的制定提供一定參考。