肺癌的液體活檢

張驍 馬麗芳 王佳誼

肺癌是當今社會發病率最大的惡性癌癥之一。據美國癌癥學會數據，2020年全球肺癌發病人數為220萬，居惡性腫瘤第二位，死亡人數為180萬，居惡性腫瘤第一位。肺癌按照組織病理學類型可分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）。液體活檢算是臨床上病人經常看見卻不太了解的檢查之一。我國惡性腫瘤發生率不斷增加，但受限于當前檢驗設備的多種原因，腫瘤篩選與檢測的敏感性、特異性不理想。隨著液體活檢技術的進展，癌癥的早篩、早診獲得了諸多突破性進展。液體活檢具有高特異度、高靈敏度、高性價比的特點，可以同時檢測多種癌癥，并提供準確的組織溯源結果，被認為是下一代癌癥早篩技術的突破口，得以不斷發展和推廣使用。

肺癌與液體活檢

什么是液體活檢

液體活檢（liquid biopsy），也稱液態活檢或液相活檢，是一個相對于組織活檢的概念，是指以體液為檢材獲得腫瘤生物信息的體外診斷技術。可用于液體活檢的體液包括血液、尿液、腦脊液、胸腔或腹盆腔積液等。目前醫學與科研工作中較常用的血液活檢測試項目根據檢測對象一般分為循環腫瘤DNA（ctDNA）、循環腫瘤細胞（CTC）及外泌體等。

其實，液體活檢的前身由來已久，早在1869年CTC便在癌癥患者的血液中被第一次發現。但是由于技術的限制，液體活檢進入商業應用卻是在一個世紀之后。 液體活檢于1994年由一個叫作Immunicon的公司創造，很快該公司被強生子公司——Veridex收購，隨后Veridex公司在2000年首推一款名為CellSearch的商業液體活檢測試。2004年，一款叫作CellSearch循環癌癥細胞檢測系統的產品得到美國食品藥品管理局（FDA）許可，用于轉移性結直腸癌、乳腺癌和前列腺癌的CTC篩查。2011 年基于 CTC 檢測的液體活檢概念被提出來，此后利用循環腫瘤 DNA檢測基因突變獲取腫瘤生物學信息的技術被引入液體活檢技術。2014年，歐盟批準利用 ctDNA 檢測 EGFR 突變可用于肺癌靶向治療（易瑞沙）的伴隨診斷。同年，可用于早期大腸癌血液檢測的Septin 9基因甲基化檢測試劑盒通過中國國家藥品監督管理局（NMPA）審核，獲得中國進口醫療器械產品注冊證，將液體活檢的應用拓展至腫瘤早篩領域。2015 年，液體活檢被《麻省理工科技評論》評為年度十大突破技術。在這以后，液體活檢技術開始高速發展。外泌體和腫瘤誘導血小板等的檢測也納入液體活檢范疇。2016年，美國FDA批準了基于熒光定量 PCR（qPCR）技術的用于肺癌 ctDNA 突變檢測試劑盒。2018年中國國家藥品監督管理局首次批準血漿 EGFR 基因突變檢測用于非小細胞肺癌患者的臨床評估，標志著我國液體活檢進入了新的發展階段。2019年一種用于檢測前列腺癌篩查的外泌體液體活檢技術獲得美國突破性醫療器械認定。2020 年，首個基于二代測序（NGS）的液體活檢產品獲得美國 FDA 批準，用于實體瘤綜合基因組分析和肺癌伴隨診斷，進一步指導臨床治療決策。2021年ctDNA 液體活檢獲得紐約州衛生部臨床實驗室評估項目的許可， 可用于實體瘤微小殘留病變（MRD）的檢測，拓展了液體活檢的臨床應用范圍，標志著液體活檢技術的發展進入了一個新階段。2021年 7 月，中國國家藥品監督管理局批準了 CytoSorter?循環上皮細胞分離儀獲得三類醫療器械注冊證，該產品基于微流控和免疫捕獲技術，通過對肺癌、乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等多中心臨床試驗驗證，在臨床上用于人外周血中的循環上皮源腫瘤細胞進行分離富集。這在中國 CTC 領域，具有標志性意義。與此同時，伴隨液體活檢檢測對象和臨床應用領域的不斷擴展，實時熒光定量 PCR、數字 PCR、高通量測序、微流控芯片等多種檢測和分析手段也逐漸進入臨床應用。

液體活檢的發展歷程

液體活檢與傳統的組織活檢相比具有不少優點。組織活檢可能引起病人出現氣胸、腦出血等并發癥，液體活檢對就醫患者的傷害較小，可以實時得到結果，并且可以在疾病的早期發現問題。如患者做普通穿刺活檢損傷大，而液體活檢則對患者的損傷更小，會較大的程度地減輕病人的痛苦。同時，在做液體活檢的過程中臨床醫生可以用其來監測腫瘤對治療的反應，預測預后、腫瘤復發及藥物療效。在一定時間內采集多個血液樣本的可操作性使得醫生能更好了解腫瘤在分子生物學層面的發生發展情況。另外，大約25%的肺癌活檢由于獲取的組織樣品過少而影響患者診斷和病情評估，組織活檢難以重復，獲取的腫瘤信息受樣本異質性影響較大，只能反映取材部位信息，而液體活檢獲取較為輕松，可以提供準確的組織溯源結果。但是液體活檢對檢測技術靈敏度和特異性要求高，質量控制難度大，在早期腫瘤患者檢測結果與組織活檢結果會存在不一致。目前組織活檢仍是腫瘤分子診斷的金標準，在能獲取組織樣本的情況下，組織檢測仍為首選，液體活檢還不能全面取代組織活檢，但是二者相互補充可為臨床提供更可靠的結果。

液體活檢的取材

液體活檢的開展依賴于體液。體液是人體的重要組成部分，在成年男性和女性的所占比重分別為60%和55%。人體各種組織和器官通過體液不斷進行物質和能量交換，維持機體功能正常運轉，腫瘤來源的相關物質可進入體液中，為液體活檢的開展提供了可能。

血液血液是目前在液體活檢中應用最廣泛的樣本類型，更重要的是作為人體進行物質和能量交換的樞紐，其中匯集了腫瘤細胞生長、代謝及凋亡（死亡）所釋放的能夠反映腫瘤生物學特征的物質。

尿液尿液是除血液外可匯集全身代謝產物和各種組織相關物質的樣本類型，尿液來源的脫落腫瘤細胞還可作為泌尿系統腫瘤檢測對象。尿液收集時已在膀胱中儲存過一段時間，成分相對穩定，質控相對容易。更重要的是尿液不像血液那樣被內環境穩態的機制控制在一個穩定的范圍之內，尿液收集更早期的變化，是早期標志物的更好來源。吸附干燥真空技術可用于在膜上保存尿液中的大分子成分，做到長期保存，為早期腫瘤標志物探索和鑒定提供重要的生物樣本支持。

腫瘤局部體液在腫瘤的原發部位或轉移部位，腫瘤的侵襲會導致體液的滲（漏）出，包括胸水、腹水、腦脊液等。這些體液靠近腫瘤組織，含大量腫瘤來源的細胞及其他腫瘤相關成分，十分適合用來液體活檢。胸腹水和腦脊液的獲取一般需要通過穿刺引流，雖然有創，但可在治療性引流同時獲取，患者更好接受。在液體活檢標本的選擇上，這類樣本的優先級更高，優于血液樣本。

唾液正常人每天分泌唾液大約為1.0～1.5 L。唾液中的有機物質一般是黏蛋白、淀粉酶等，含有游離核酸，可用于檢測基因變異。目前的研究已經證實采用唾液樣本進行液體活檢的可行性。

其他體液除了上述的體液類型之外，痰液、淚液、淋巴液、汗液、痰液以外的黏液、乳汁以及精液等也都是常見的體液標本，但是這些標本用于液體活檢的報道少見。

液體活檢的檢測對象

液體活檢的檢測對象主要有游離核酸、腫瘤細胞、細胞外囊泡、血小板等。

循環腫瘤DNA（ctDNA）在體內環境中，包括血漿、腦脊液、尿等，可以檢查到一種游離的DNA片斷，被稱之為循環游離DNA。人體細胞在生理和病理情況下的凋亡和壞死會釋放片段化 DNA，成為游離DNA。它們既有來源于正常細胞的DNA，又有來源于癌癥細菌的DNA，而它們又稱之為循環腫瘤DNA，因為具有分解快的特點，其濃度的改變能夠更精準地表達腫瘤負荷，為癌癥檢測、微小殘留病灶預后研究、轉移控制等帶來關鍵數據。

循環腫瘤 RNA（ctRNA）游離的長片段 RNA（mRNA、rRNA、tRNA、lncRNA）在體液中很易降解，循環腫瘤 RNA 主要指 microRNA（miRNA），負責調控轉錄后基因表達。人類目前已發現超過2 500種不同的 miRNA。每一種可直接或間接調節關鍵細胞進程，例如增殖、分化，DNA 修復和凋亡，發揮癌基因/抑癌基因的功能，因此可通過對其的檢測補充腫瘤診斷。有指南提出tRNA可以作為腫瘤標志物，但個人觀點，tRNA 因為無法區別來自正常細胞還是腫瘤細胞，較難作為腫瘤標志物。miRNA 在體液中較為穩定。血清 miRNA置于各種極端苛刻環境下，仍可保持穩定，且能長期儲存。這些優勢使循環 miRNA 成了非常有前景的生物標志物，但 miRNA檢測的特異性和重復性是臨床轉化需要解決的問題。多數 miRNA并不特異針對某一種腫瘤類型，因此，以單個 miRNA 作為某種腫瘤診斷或預后的生物標志物并不可行，多個miRNA 的組合（miRNA 表達譜）的定量檢測可能更有應用潛力。

循環腫瘤細胞（CTC） 1869年，病理學家從腫瘤死亡病人血液中發現有一種細胞，其形狀和癌細胞形態類似，將它命名為循環腫瘤細胞，它的主要來源為實體腫瘤病灶。原發或繼發的實體腫瘤病灶自動脫離或受外科手術、切片取出等外部影響而被動脫離，使CTC作為腫瘤轉移的“種子”進入外周血。CTC以不同形態存在于外周血中，既有游離的單個CTC，也有聚集成團的細胞團， 通過循環系統完成轉移播散。腫瘤細胞突破基底膜進入血流形成循環腫瘤細胞是腫瘤進展的重要標志。這個細胞群體有異質性，彼此間在細胞大小和形狀、分子表型、活力程度、轉移潛力、繁殖潛力等各方面可能均有差異。作為惡性腫瘤遠處轉移的“種子”，CTC 在患者血液中出現與否及其數量多少，一方面代表著原發惡性腫瘤浸潤入血液中的時間，另一方面預示著在較遠端器官形成轉移灶的可能性。CTC 在外周血中數量稀少，其稀有性和異質性為檢測提出了極大挑戰。獲得數量和質量都能滿足下游分析要求的 CTC 是開展相關檢測和研究的先決條件。除外周血的 CTC 外，腫瘤局部體液也會含有大量腫瘤脫落細胞，這些細胞在數量上比 CTC 更多，收集相對方便，也是非常理想的液體活檢材料。

外泌體（EVs）外泌體為外表呈凹半球狀的類囊泡小體，帶有立體膜構造 ，口徑大約為30～150 nm。外泌體廣泛分布于各種體內環境，外泌體可以對其內含物質進行較好保存，使外泌體成為液體活檢的重要潛在目標。腫瘤微環境能增加外泌體的異質化，改變外泌體大小及內容物的功能，促進外泌體釋放，不同的癌癥衍生的外泌體差異很大。外泌體的分離和純化仍是一個技術挑戰，目前耗時費力難以質控的分離純化步驟仍然是外泌體液體活檢臨床應用的主要限制因素。

液體活檢的取材和檢測對象

腫瘤誘導血小板（TEP）血小板細胞指直徑為2～4 μm的無核人血細胞，取自人骨髓內的巨核細胞，半衰期短，僅為7～10天，在人體血液循環中數量僅次于紅細胞。除了參與止血和血栓形成，血小板在癌癥發展的全過程中有著至關重要的地位。在血液中，循環腫瘤細胞導致血小板凝聚，產生血小板細胞-腫瘤細胞復合體，幫助腫瘤細胞抵抗因血液剪接力造成的機械傷害和保護腫瘤細胞逃脫免疫系統的攻擊。循環血小板在其整個生命周期內一方面與腫瘤細胞相互作用，獲取腫瘤相關的生物分子；另一方面還可以不斷攝取并富集循環中游離的蛋白質、核酸以及囊泡、顆粒等。經此，血小板如同被“教育”了一般，其蛋白質組和 RNA 表達譜發生顯著變化，因此被稱為"腫瘤誘導血小板"。同時得益于其封閉的膜結構，其獲得腫瘤相關的生物學信息得以完整保存，成為腫瘤來源的生物活性分子的大而濃縮的生物儲存庫。基于以上這些原因，腫瘤誘導血小板成為腫瘤液體活檢的新型檢測對象。

小結

由于非小細胞肺癌靶向與免疫治療的廣泛應用，液體活檢的相對非侵入方法對血漿或體液中癌癥細胞和相應癌癥分子標志進行檢測成為最活躍的應用領域。CTC、ctDNA 以及外泌體是腫瘤液體活檢最主要的三個檢測對象。三者提供的檢測內容不同，互為補充。液體活檢的意義在于可對腫瘤的治療過程進行動態檢測，如治療反應、進展、耐藥確定。液體活檢在即時性、準確度、無創性等方面都有著巨大的優越性。液體活檢的無創性能夠減少肺癌病人的恢復期，利用ctDNA、CTC和外泌體的探測方法能獲得組織活檢不能獲得的動態數據，可以即時觀察病人診斷后的癥狀改變以及推測病人的預后情況。醫學上還無法把液體活檢獲得的數據當作唯一的依據，但是可以把液體活檢和組織活檢、影像技術及其他檢驗技術結合到一起進行病人的醫學診斷。