復(fù)配生物防腐劑對面包防腐效果

王雅妮，孫暢，趙漢青，魏孝宇，鄭朝顯，袁懷波*

1. 合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（合肥 230601）；

2. 安慶師范大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院（安慶 246133）；3. 安徽麥吉食品有限公司（阜陽 236000）

面包生產(chǎn)工藝流程包括面團(tuán)調(diào)制、發(fā)酵、搓圓、整型、二次發(fā)酵、烘烤[1]*。面包的水分活度高，pH呈酸性，碳水和蛋白含量較高，在貯存過程中容易產(chǎn)生微生物，受霉菌污染[2-4]*。向面包等烘焙制品中添加防腐劑是常見的面包保鮮、保質(zhì)手段[5]*。生物防腐劑相比化學(xué)防腐劑具有多重優(yōu)勢：毒性低，抑菌作用明顯，使用量更少和熱穩(wěn)定性好[6]*。生物防腐劑主要通過對動植物分泌的抑菌物質(zhì)進(jìn)行提純和加工制備得到[7]*。試驗(yàn)采用乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸等微生物防腐劑，開展復(fù)配生物防腐劑在面包保鮮防腐中應(yīng)用效果研究，為面包產(chǎn)業(yè)的開發(fā)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

菌種：青霉菌（Penicilliumsp.），子囊菌亞門、青霉屬青霉菌（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院）。

納他霉素、乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸（河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司）；NaCl（AR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；濾膜（0.22 μm）；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖水（PDB）：杭州微生物試劑有限公司；3.0 g/kg納他霉素鹽酸溶液（0.30 g納他霉素用0.02 mol/L HCl溶解，24 h內(nèi)使用）；2.5 g/kg乳酸鏈球菌溶液（24 h內(nèi)使用）；1.5 g/kgε-聚賴氨酸溶液（0.22 μm濾膜過濾，24 h內(nèi)使用）；青霉菌孢子懸液（CFU/mL，于-4℃?zhèn)溆茫?/p>

面包制作原料：高筋面粉、白砂糖、食用鹽、酵母、雞蛋、牛奶、黃油。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 面包制作工藝流程

原料攪拌→和面→發(fā)酵→分塊→搓圓→整型→二次發(fā)酵→焙烤→冷卻

1.3.2 試驗(yàn)方法

1.3.2.1 單一防腐劑對青霉菌的抑制效果

以制備好的菌懸液作為供試樣品，參照GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》等確定防腐劑納他霉素、乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸的最大添加量，分別為0.30，0.25和0.15 g/kg。在PDB培養(yǎng)基中添加不同濃度防腐劑（各防腐劑添加量最大值的100%，85%，70%，55%，40%，25%，10%和0），將防腐劑稀釋2倍，按照此防腐劑添加濃度依次加入無菌96微孔板中，每個(gè)微孔中分別添加200 μL不同濃度防腐劑，向每孔中加入5 μL青霉菌菌懸液，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，使用酶標(biāo)儀測定A580nm，分別測定單一防腐劑對青霉菌的抑制效果。每組試驗(yàn)3次平行，以吸光度較小值為標(biāo)準(zhǔn)選擇優(yōu)化添加濃度范圍。

1.3.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)配防腐劑配比

根據(jù)單一防腐劑的抑菌效果試驗(yàn)結(jié)果，以A580nm為響應(yīng)值（R），設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Bohnken試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配防腐劑配比，每種防腐劑設(shè)3組平行試驗(yàn)。對最優(yōu)配比進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（平行3次）。

有報(bào)道,因子宮異常造成的習(xí)慣性流產(chǎn)占1.8%~37.6%,是晚期流產(chǎn)的常見原因。子宮異常包括先天畸形、子宮肌瘤、宮腔粘連、內(nèi)膜息肉等。對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女進(jìn)行輸卵管子宮碘油造影或?qū)m腔鏡檢查發(fā)現(xiàn),Mtillerian管畸形占8%~10%,其引起習(xí)慣性流產(chǎn)的原因可能為:胚胎和胎盤的血管化不充分,宮腔體積減小或?qū)m頸功能不全[4-6]。經(jīng)驗(yàn)豐富的B超醫(yī)生對子宮畸形的診斷有較高的敏感性,三維超聲的診斷價(jià)值似乎很有前途,因?yàn)樗粌H可以診斷子宮畸形,還可以對畸形進(jìn)行分類,甚至可取代診斷性的宮腔鏡和腹腔鏡檢查。

1.3.2.3 復(fù)配防腐劑抑菌效果驗(yàn)證

按照高筋面粉400 g、酵母5 g、白糖60 g、鹽2 g、牛奶175 g和雞蛋100 g的原料配方制作成品面包，配制最佳配比濃度的復(fù)配防腐劑水溶液。在試驗(yàn)組面包表面均勻地噴涂復(fù)配防腐劑溶液，對照組噴涂相應(yīng)量的無菌超純水。2組面包均在室溫放置3 h后進(jìn)行取樣檢測。參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》和GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》分別測定菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)。取25 g冷卻30 min后的面包加入225 mL無菌生理鹽水中，均質(zhì)器均質(zhì)并混合均勻，即為10-1*的樣品稀釋液，依次梯度稀釋。從若干濃度范圍中選擇3個(gè)合適的稀釋濃度，通過平板傾注的方法，取1 mL稀釋液加到PCA和PDA培養(yǎng)基，充分混勻。這3個(gè)稀釋濃度在2個(gè)培養(yǎng)基中分別做兩個(gè)平行，測定菌落總數(shù)的培養(yǎng)皿于37 ℃培養(yǎng)48 h，霉菌計(jì)數(shù)則在28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一防腐劑對青霉菌的抑制效果

根據(jù)圖1（A）可知，吸光度隨著乳酸鏈球菌素添加量增加呈現(xiàn)先下降后緩慢上升趨勢，乳酸鏈球菌素添加量0.1 g/kg時(shí)有最小吸光度A580nm，即意味此防腐劑在該濃度下的抑菌效果最佳。根據(jù)圖1（B）可知，吸光度隨著納他霉素添加量增加呈現(xiàn)先下降后緩慢上升趨勢，納他霉素添加量0.075 g/kg時(shí)，吸光度最低，此防腐劑在該濃度下抑菌效果最好。根據(jù)圖1（C）可知，吸光度隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加呈現(xiàn)先下降后緩慢上升趨勢，ε-聚賴氨酸添加量0.06 kg時(shí)有最小的吸光度A580nm，表明此防腐劑在該濃度下的抑菌效果明顯。結(jié)果表明，吸光度最小值對應(yīng)的防腐劑濃度對青霉菌的抑制效果最佳，選擇相鄰濃度為優(yōu)化區(qū)間，因此乳酸鏈球菌素、納他霉素和ε-聚賴氨酸的優(yōu)化濃度范圍分別為0.062 5～0.137 5，0.03～0.12和0.037 5～0.082 5 g/kg，用于防腐劑最佳配方的研究。

圖1 單一防腐劑對青霉菌的抑制效果

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)因素及水平

根據(jù)防腐劑的單因素抑菌試驗(yàn)的優(yōu)化濃度范圍從而設(shè)置因素水平表，見表1。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表 單位：g/kg

2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果分析

Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過Design Expert 13軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得回歸方程模型：R=0.408 4+0.018 4A+0.031 4B-0.006 7C+0.023 3AB-0.016 5AC+0.064BC+0.026 4A2*+0.061 9B2*+0.101 7C2*。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得到回歸方程模型的方差分析與系數(shù)估計(jì)值，如表3所示。響應(yīng)面模型的相關(guān)系數(shù)R2*=0.910 0，模型回歸效果具有顯著性（P＜0.01），失擬項(xiàng)沒有顯著性（P＞0.05），說明該回歸方程模擬的三因素三水平分析可靠；模型的相關(guān)系數(shù)R2*=0.910 0，矯正決定系數(shù)Radj2*=0.794 2，說明選擇的自變量合適，模型能較好描述試驗(yàn)結(jié)果，可進(jìn)行進(jìn)一步分析。

從表3可以看出，B和BC的P值小于0.05，說明納他霉素及納他霉素和乳酸鏈球菌素的交互作用對吸光度的影響顯著。防腐劑對吸光度A580nm的影響大小為納他霉素（B）＞ε-聚賴氨酸（A）＞乳酸鏈球菌素（C）。

表3 回歸方程的方差分析

響應(yīng)面圖反映各因素及其交互作用對吸光度A580nm的影響。由圖2可知，響應(yīng)面整體呈現(xiàn)中心凹陷的形狀，圖2（C）等高線呈橢圓形，可以看出BC因素具有顯著性。其中，圖2（C）的響應(yīng)面坡度變化最明顯，且等高線圖相比其他更接近橢圓形。納他霉素和乳酸鏈球菌素兩者之間的交互作用對吸光度的影響很大，即抑菌效果的影響最大。

圖2 防腐劑之間的交互作用

2.2.3 復(fù)配防腐劑配比的確定

通過Design Expert 13的軟件處理數(shù)據(jù)，得到復(fù)配防腐劑最佳的各組分配比，此時(shí)的吸光度最小，為0.402，生物防腐劑各配比為ε-聚賴氨酸0.056 g/kg、納他霉素0.063 g/kg、乳酸鏈球菌素0.104 g/kg，這種配方抑菌效果最好。各類防腐劑各自用量占其最大使用量比例之和不應(yīng)超過1，防腐劑比例之和為0.999 3，使用量符合GB 2760—2014規(guī)定。

按照該組合進(jìn)行平行3次的驗(yàn)證試驗(yàn)得到吸光度A580nm，其平均值為0.421，與理論值的相對誤差為4.73%，無顯著差異，說明試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，該模型可信。

2.2.4 復(fù)配防腐劑的抑菌效果驗(yàn)證

根據(jù)面包的國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，面包安全有許多的鑒定指標(biāo)，試驗(yàn)中測定的是面包的微生物指標(biāo)以判斷防腐效果。分別經(jīng)過48 h和5 d，測定菌落總數(shù)和霉菌數(shù)。由表4可知，試驗(yàn)組和對照組的菌落總數(shù)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，遠(yuǎn)小于國標(biāo)規(guī)定的可接受水平限量值（104*CFU/g），但對照組的菌落總數(shù)遠(yuǎn)大于試驗(yàn)組。在霉菌數(shù)方面，試驗(yàn)組未檢出霉菌，而對照組霉菌數(shù)量超出國標(biāo)規(guī)定的限量（150 CFU/g）。

表4 面包防腐效果的微生物指標(biāo)評價(jià) 單位：CFU/g

3 結(jié)論

以ε-聚賴氨酸、納他霉素和乳酸鏈球菌素為主要原料，通過單因素體外抑菌試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定面包的最佳復(fù)配防腐劑配方，并對優(yōu)化效果進(jìn)行驗(yàn)證。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ε-聚賴氨酸濃度0.056 g/kg、納他霉素濃度0.063 g/kg、乳酸鏈球菌素濃度0.104 g/kg的條件下，復(fù)配防腐劑的抑菌效果最好。試驗(yàn)結(jié)果對開發(fā)生物防腐面包提供理論支持，隨著食品科學(xué)和微生物技術(shù)的不斷發(fā)展，未來生物防腐劑將有更廣闊的發(fā)展前景。