醇酶法提取苦杏仁油工藝優化及微膠囊的制備

韓金承，孟鑫*，吳慎威，閆伊狄

錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121000）

苦杏仁為薔薇科植物山杏成熟的種仁，因其含有3%～5%的苦杏仁苷而得名。脫苦后的苦杏仁除含有蛋白質、糖等營養物質外，還含有約50%的脂肪[1]*?？嘈尤视途哂斜Ｗo心血管等功效，在食品、醫藥等領域有廣泛的應用。常用油脂提取方法有溶劑萃取法、酶法和超臨界CO2法[2-4]*。溶劑萃取法易造成溶劑殘留；超臨界CO2法對設備要求高；酶法是利用酶分解包裹油脂的成分，再通過離心得到油脂，該法條件溫和，但易受底物影響；醇酶法是在酶解液中加入適量乙醇，從而促進物質間的通透性，提高提取率。因此，采用效率更高的醇酶法是苦杏仁油開發需解決的核心問題。

此外，苦杏仁油在儲存過程中易受光、熱、氧等影響，因此解決苦杏仁油氧化穩定性具有實際應用價值。油脂微膠囊是指利用某些兩親物質為壁材包埋油脂，再經過干燥技術，得到結構類似膠囊的粉末。研究表明，微膠囊化可以延緩油脂的氧化進程[5-6]*。

試驗采用醇酶法為提取工藝，以油脂得率為評價指標，考察乙醇體積分數、酶添加量、酶解時間、料液比對油脂得率的影響，利用響應面法優化工藝并驗證結果；以所得苦杏仁油為芯材，大豆分離蛋白和環狀糊精為壁材，采用真空冷凍干燥技術制得苦杏仁油微膠囊，對所得微膠囊進行微觀結構掃描，以鑒定包埋效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁（錦州中藥材市場）；堿性蛋白酶（酶活20萬 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；β-環狀糊精（食品級，河南萬邦實業有限公司）；大豆分離蛋白（食品級，河南興源化工產品有限公司）；改性大豆磷脂（食品級，武漢曙爾生物科技有限公司）；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

UC-9600型超聲波清洗機（深圳市朗杰超聲電器有限公司）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；H01-2A型磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；TDL-5-A型離心機（上海安亭科學儀器廠）；GJB2000-25型均質機（常州市超力均質泵廠）；TF-FD-27S普通型真空冷凍干燥機（上海田楓實業有限公司）；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sigma300型掃描電子顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）；XSP-BM-13CS型數碼落射熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦杏仁的預處理

將苦杏仁投入沸水中保溫10 min后取出脫皮，按照料液比1∶12（g/mL）加入蒸餾水后進行超聲處理60 min（55 ℃，300 W），取出后在100 ℃鼓風干燥機中干燥至恒重[7-8]*。

1.3.2 苦杏仁油的提取

將預處理過的苦杏仁粉碎后，用網眼直徑0.425 mm的網篩篩選，按照料液比1∶7（g/mL）加入體積分數20%的乙醇溶液混勻，調溶液pH 9.5，向溶液中加入3.5%的堿性蛋白酶并混勻，在45 ℃，750 r/min條件下磁力攪拌酶解130 min，結束后將溶液置于90 ℃水浴鍋中水浴滅酶并揮發乙醇10 min，滅酶后的溶液在4 000 r/min條件下離心15 min，吸出油層，得到苦杏仁油[9]*?？嘈尤视偷寐视嬎惴椒ㄒ娛剑?）。

1.3.3 單因素試驗

以苦杏仁油得率為評價指標，研究乙醇體積分數、酶添加量、酶解時間、料液比之間不同配比對苦杏仁油得率的影響，各因素具體變量見表1。固定條件：苦杏仁粉直徑≤0.425 mm、酶解pH 9.5、磁力攪拌條件750 r/min（45 ℃）、滅酶條件90 ℃（10 min）、離心條件4 000 r/min（15 min）。

表1 苦杏仁油提取單因素試驗條件

1.3.4 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合設計原則，在單因素試驗的基礎上以苦杏仁油得率為評價指標進行四因素三水平的響應面優化分析，試驗因素水平見表2。

表2 苦杏仁油提取工藝響應面試驗因素和水平

1.3.5 苦杏仁油微膠囊的制備

壁材溶液：將β-環狀糊精與大豆分離蛋白按照3∶1（m/m）比例混合后加入16倍的蒸餾水，在60℃，800 r/min條件下磁力攪拌至壁材溶解均勻。

芯材溶液：苦杏仁油中加入2%的改性大豆磷脂，攪拌均勻后在60 ℃水浴鍋中烊化20 min。

微膠囊制備：將芯材按照1∶80（g/mL）比例加入到壁材溶液中，在60 ℃，300 W條件下超聲乳化處理20 min，在60 ℃，1 000 r/min條件下磁力攪拌30 min，結束后在25 MPa的條件下高壓均質，得微膠囊乳狀液；將所得乳狀液倒入冷凍干燥物料盤中，高度≤1 cm，在-18 ℃條件下保存12 h，取出后在-80 ℃，1 Pa條件下冷凍干燥12 h，得苦杏仁油微膠囊[10-11]*。

1.3.6 微膠囊包埋率計算

稱取微膠囊粉末于漏斗中，用石油醚反復濾洗3次洗去表面油，烘干至恒重，采用索氏提取法抽提濾洗后的微膠囊中油脂。按照式（2）計算苦杏仁油微膠囊的包埋率。

式中：m1為微膠囊制備前苦杏仁油質量，g；m2為微膠囊提取得到的苦杏仁油質量，g。

1.3.7 苦杏仁油微膠囊微觀結構觀察

取適量的微膠囊置導電膠上，在真空鍍膜機中噴金后固定在樣品臺上，放入顯微鏡腔室中觀察不同倍數下微膠囊的形態結構觀察[12]*。

1.4 數據處理

數據統計類的試驗均作3次，數據用SPSS 18.0軟件進行分析，結果表現為“平均值±標準差”形式；折線圖采用Origin Pro 9制作；響應面法分析采用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

乙醇體積分數、酶添加量、酶解時間、料液比4個條件對于苦杏仁油的得率具有直接的影響作用。乙醇可以影響細胞壁的通透性，酶添加量是反應發生的主要條件，酶解時間決定反應是否完全，料液比的不同決定整個反應體系物質間接觸發生反應的速率[13]*。因此選取這4個條件進行單因素試驗，為響應面優化作基礎?？嘈尤视吞崛我蛩卦囼灲Y果見圖1。

圖1 單因素條件下苦杏仁油得率對比

結果表明，隨著乙醇體積分數的提高，苦杏仁油得率呈現先升高再降低的變化趨勢，乙醇體積分數20%時，苦杏仁油得率達到最高值37.07%。體積分數適宜的乙醇溶液有助于提高酶分解蛋白的能力，但高體積分數的乙醇溶液會降低酶活力，使得酶解能力降低，降低油脂得率。隨著酶添加量的增加，苦杏仁油得率呈現先升高再降低的變化趨勢，酶添加量3.5%時，苦杏仁油得率達到最高值24.43%。酶添加量越高，分解蛋白的含量越多，但分解過多的蛋白也會乳化得到的苦杏仁油，使得油脂得率降低。隨著酶解時間的延長，苦杏仁油得率呈現先升高再略降低的變化趨勢，酶解時間150 min時，苦杏仁油得率達到最高值35.94%。酶解反應充分發生后，進一步延長反應時間對油脂得率無促進作用，甚至游離的蛋白質會乳化部分苦杏仁油，使得油脂得率略降低。隨著料液比中液體占比的增加，苦杏仁油得率呈現先升高再降低的趨勢，料液比1∶8（g/mL）時，苦杏仁油得率達到最高值30%。料液比影響底物之間接觸概率，溶液含量過多時，底物之間的接觸概率低，影響反應發生，使得苦杏仁油得率降低[14-15]*。綜上，將乙醇體積分數、酶添加量、酶解時間、料液比分別控制為20%，3.5%，150 min和1∶8（g/mL）。

2.2 響應面試驗

2.2.1 模型的建立與結果

結合單因素試驗的結果，以苦杏仁油得率（Y）作為響應值，將乙醇體積分數（A）、酶添加量（B）、酶解時間（C）、料液比（D）作為自變量，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合進行四因素三水平的響應面試驗設計，苦杏仁油得油率結果分別見表3。對表3中的試驗數據進行多元回歸擬合，得到當前條件下苦杏仁油得油率與各因素間的二次多項回歸方程式：Y=38.43+1.89A+0.18B-1.81C+0.84D+2.03AB+2.84AC-0.47AD-0.38BC-0.23BD-1.59CD-5.4A2*-5.99B2*-5.22C2*-9.15D2*。

表3 苦杏仁油提取響應面試驗設計及結果

方差分析結果見表4。模型P值小于0.000 1，說明模型極顯著，P值的大小是衡量所建立模型中各個因素顯著的指標，P值越小表明試驗模型出現極端結果的概率越低，試驗方法可靠；模型失擬項的P值為0.123 0（＞0.05），說明模型差異不顯著，證明該方程與試驗失擬較小，結果能更好地反映試驗的真實性；回歸模型的R2*和Radj2*為0.979 6和0.959 2，R2*和Radj2*的值越接近1，表明模型呈線性回歸，擬合效果好，可用于分析與計算[16]*；由F值可知，單因素對苦杏仁油得率的影響順序為A＞C＞D＞B。

表4 苦杏仁油得率二次模型方差分析

2.2.2 響應面分析

響應面曲線圖反映2個因素之間交互作用的變化幅度，如果2個因素之間交互作用明顯，則曲面越陡；等高線反映2個因素之間交互作用的顯著情況，如果2個因素之間交互作用顯著，則越趨近橢圓形[17]*?？嘈尤视偷寐蔄、B、C、D因素之間兩兩組合相互作用的響應面分析見圖2。

圖2 兩兩組合相互作用的響應面圖和等高線圖

根據各因素相互影響的曲面圖可以看出，各因素兩兩組合之間均產生較明顯的交互影響，2個因素之間其中一個因素條件變化均會對另一個條件產生影響；根據等高線圖可以看出，各因素兩兩組合之間的等高線呈現出橢圓形，說明2個因素之間交互影響顯著。與P值結合可以看出，兩兩因素交互作用顯著程度從大到小的順序為AC＞AB＞CD＞AD＞BC＞BD。

2.2.3 最優條件的預測與驗證

結合回歸模型優化后得到醇酶法提取苦杏仁油最佳工藝條件：乙醇體積分數20.71%、酶添加量3.52%、酶解時間147.11 min、料液比1∶8.05（g/mL），預測結果為38.717 2%。結合預測結果采用條件：乙醇體積分數20.5%、酶添加量3.5%、酶解時間147 min、料液比1∶8（g/mL），進行3次平行試驗驗證模型準確性，最終苦杏仁油平均得率為39.11%±0.21%，結果符合預測值。

2.3 微膠囊包埋率及微觀結構分析

2.3.1 微膠囊包埋率評價

以β-環狀糊精和大豆分離蛋白為壁材進行苦杏仁油微膠囊制備，經過試驗測得微膠囊平均包埋率達到82.89%±0.37%，說明微膠囊在制備過程中制備效率高，所浪費苦杏仁油較少，可應用于實際生產中。

2.3.2 微膠囊電子顯微鏡掃描結果

顆粒立體結構大小適宜且分散均勻的微膠囊有利于貯存及消化過程中控釋；壁材表面完整性和致密性的顆粒對于芯材具有重要的保護作用。不同倍數下微膠囊結構見圖3。

圖3 不同分辨率微膠囊形貌

由掃描結果可以看到，干燥后物質整體呈現出干燥且分散的狀態，此種狀態下的顆粒有利于長時間貯藏。主要有2種大小的顆粒，小顆?？赡苁遣糠直怀暡栈螽a生的壁材碎屑和乳化劑干燥后產生的；觀察較大顆粒可以看到顆粒呈現明顯且完整的立體結構，初步判斷微膠囊包埋成功。在微膠囊表面呈現細微裂痕，這可能是由于水分子在冷凍時形成冰晶體，不規則的冰晶體升華時刺破微膠囊表面后形成。除此之外微膠囊表面較為致密，說明微膠囊對于苦杏仁油可以起到隔絕氧氣、光照等不利條件；顆粒大小均勻，表明微膠囊在消化吸收過程中，其中的苦杏仁油可以呈現勻速的釋放[18]*。

2.3.3 熒光顯微鏡掃描結果

熒光顯微鏡觀察是指通過發射特定波長來使有機物質產生熒光反應，從而觀察物質的形態及分散情況[19]*。熒光顯微鏡掃描結果見圖4。

圖4 熒光顯微鏡掃描結果

根據掃描結果可以看到，微膠囊顆粒中呈現一定的熒光反應，表明苦杏仁油被成功包埋進了壁材中。微膠囊表面呈現較好的密封性，顆粒與顆粒之間較為分散，無粘連、漏油等不良情況，每個顆粒相當于一個獨立個體，使得微膠囊在儲存過程中顆粒之間相互影響較小，有利于延長儲存期。芯材與壁材貼合度較高，說明包埋的苦杏仁油含量較為豐富。

3 結論

通過單因素試驗和響應面法優化苦杏仁油的制備工藝，最佳條件為乙醇體積分數20.5%、酶添加量3.5%、酶解時間147 min、料液比1∶8（g/mL），苦杏仁油平均得率為39.11%±0.21%，符合預測值。采用真空冷凍干燥法制備苦杏仁油微膠囊，微觀結構掃描發現呈現較好的立體結構并存在熒光反映，表明苦杏仁油成功被包埋成微膠囊。該試驗為苦杏仁油的提取及利用提供一定數據支撐，從而在提高苦杏仁資源利用率提供試驗基礎。