豬肉中雄烯酮含量不同對(duì)小鼠性腺組織及性激素水平的影響

許爍熙，劉嘉瑩，李育銀，梁曉文，章力建，侯少貞*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院（廣州 510006）；2. 廣州市仙草家園科技有限公司（廣州 510799）；3. 國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專家委員會(huì)（北京 100125）

肉類食品是人類飲食重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，豬肉是我國(guó)主要的動(dòng)物性食品，對(duì)人們生活水平具有極其重要影響。豬肉中含有人體各種必需氨基酸，其必需氨基酸的構(gòu)成比例接近人體需要，可被人體充分吸收，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[1-2]*。豬肉中含有豐富的鈣、鎂、磷、鈉、鉀、氯等微量元素。其中，鈣、磷是影響骨骼發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)要素；鐵元素是合成血紅蛋白所不可缺少的，同時(shí)也是維持人體正常生命活動(dòng)最重要的十幾種酶的組成要素；鈉、氯等元素，可充分補(bǔ)充有機(jī)體消耗的鹽分[3-6]*。因此，這些指標(biāo)是豬肉質(zhì)量評(píng)價(jià)重要依據(jù)。

在豬肉質(zhì)量評(píng)價(jià)中，風(fēng)味是一種重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。豬肉在烹飪時(shí)會(huì)產(chǎn)生膻味，這主要是由雄烯酮及糞臭素過(guò)度累積造成[7-9]*。糞臭素是大腸內(nèi)厭氧微生物降解色氨酸的產(chǎn)物，有極強(qiáng)的糞臭味[10]*。雄烯酮又叫豬烯酮，是公豬睪丸中產(chǎn)生的一項(xiàng)類固醇激素，屬于16-雄甾烯類固醇家族，具有尿騷味，易儲(chǔ)存于肌肉及口水中，作為信息素刺激母豬發(fā)情以促進(jìn)交配，且在母豬中也少量存在，這是豬肉的主要騷味來(lái)源。雄烯酮在睪丸中與類固醇激素、雄激素和雌激素一同形成，連同其他16-雄甾類固醇激素，由睪丸中孕烯酮合成[11-14]*。有研究表明，睪丸類固醇，雄激素和雌激素含量增加的公豬具有較高的雄烯酮水平，雄烯酮與性發(fā)育程度相關(guān)。雄烯酮是公豬氣味劑的主要成分，可用于測(cè)試母豬是否進(jìn)入發(fā)情期或誘導(dǎo)母豬發(fā)情[15]*。

在豬體內(nèi)，雄烯酮與雄激素、雌激素等的合成及代謝息息相關(guān)[16]*。但雄烯酮不僅存在于公豬的口水及脂肪中，還存在于人類的口水和汗腺中，是人類男性體味的一類化合物。已有研究支持雄烯酮傳遞優(yōu)勢(shì)、攻擊及競(jìng)爭(zhēng)的概念，并認(rèn)為雄烯酮是社會(huì)合作意愿降低及婚外性行為可能性增加的信號(hào)[17-18]*。研究表明睪酮水平及雌二醇水平較高的患者對(duì)于雄烯酮的敏感程度更高[19]*，睪酮與雌二醇是影響人體性腺組織分泌的主要性激素。雄烯酮的產(chǎn)生與內(nèi)源性睪酮水平密切相關(guān)，因此，推測(cè)雄烯酮可能能影響機(jī)體的性激素水平。

豬肉作為肉類食品中雄烯酮含量較高的一項(xiàng)肉類食品，其雄烯酮對(duì)于味蕾的影響已被廣泛報(bào)導(dǎo)，然而食用雄烯酮含量偏高的豬肉后是否產(chǎn)生其他不良影響，尤其是對(duì)攝入者體內(nèi)激素水平的影響，仍缺乏相關(guān)研究。因此，試驗(yàn)采用雄烯酮含量不同的豬肉對(duì)小鼠進(jìn)行喂養(yǎng)，觀察小鼠性激素水平和性腺組織的變化，以期初步探討豬肉雄烯酮含量高低不同對(duì)機(jī)體性激素帶來(lái)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

昆明種小鼠[SPF級(jí)別，體重18～22 g，珠海百試通生物科技有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0051，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)]；豬肉樣品（市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)豬前腿肉樣品10份、廣州仙草家園提供散養(yǎng)山豬前腿肉樣品10份）；肝臟樣品（市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買豬肝新鮮豬肝樣品10份、廣州市仙草家園提供散養(yǎng)山豬豬肝樣品10份）；豬雄烯酮（ADT）Elisa試劑盒（BS-E14469O1，江蘇博深生物科技有限公司）；小鼠睪酮（T）Elisa試劑盒（RXJ202921M）、小鼠雌二醇（E2）Elisa試劑盒（RXJ203008M）（泉州睿信生物科技有限公司）；小鼠糞臭素（Ska）Elisa試劑盒（ZK-P9738，深圳子科生物科技有限公司）；BCA蛋白定量/濃度測(cè)定試劑盒（MA0082-3，大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 儀器

1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、HP300型組織脫水機(jī)、HBM-1型組織包埋機(jī)、TM-4000型組織切片機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；HF-24M型全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；CKX-41-32型倒置型顯微鏡（日本Olympus公司）；CM-24-11型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；LGJ-60A型冷凍干燥機(jī)（上海豫明儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬肉及肝臟中糞臭素及雄烯酮含量檢測(cè)

從每份樣品中取適量豬肉或者豬肝，按1∶9比例加入生理鹽水，勻漿后離心取上清，使用蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定其蛋白濃度，并將蛋白濃度調(diào)節(jié)至一致，按照雄烯酮及糞臭素試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書檢測(cè)豬肉及豬肝樣品中雄烯酮及糞臭素含量。

1.2.2 豬肉樣品制備

將市售豬肉和天下農(nóng)王提供的豬肉分別用清水洗凈，放入鍋中加清水煮熟，撈出，用吸水紙擦干表面水分，切成等量小塊，放入冷凍干燥機(jī)中干燥至恒重，取出，密封袋密封，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動(dòng)物模型建立、分組及給藥方法

將60只雄性小鼠和60只雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，雌雄各半，分別為：空白組、低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組（低、高投喂劑量組設(shè)為5和10 g/kg組）、高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組（低、高投喂劑量組設(shè)為5和10 g/kg組）。動(dòng)物每12 h光照，相對(duì)濕度50%～80%，給予普通飼料，純水，進(jìn)行普通飼養(yǎng)。動(dòng)物每天給予定量的普通飼料，雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組按供試量及體重每天給予一定量?jī)龈韶i肉以替代等量普通飼料；連續(xù)投喂8周。

1.2.4 小鼠血清睪酮及雌二醇

8周后，小鼠禁食過(guò)夜；隔天早上麻醉，以含有EDTA之真空采血管自下腔靜脈采血后。隨后動(dòng)物進(jìn)一步麻醉處死，解剖取雌鼠子宮、卵巢；雄鼠睪丸及前列腺精密稱重。采用Elisa劑盒測(cè)定雄性小鼠血清睪酮、雌性小鼠雌二醇水平。

1.2.5 卵巢、子宮及睪丸、前列腺組織病理學(xué)觀察

動(dòng)物采血后，進(jìn)一步麻醉處死，解剖卵巢、子宮、睪丸及前列腺精密稱重后，4%多聚甲醛溶液固定后用石蠟包埋，通過(guò)蘇木精-伊紅染色進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源豬肉及肝臟樣品中雄烯酮、糞臭素含量

采用Elisa檢測(cè)試劑盒檢測(cè)2種不同來(lái)源豬肉及豬肝中雄烯酮含量，結(jié)果如圖1所示，與市場(chǎng)銷售的相比，仙草家園供的豬肉及豬肝中雄烯酮含量顯著性降低（P＜0.05）。圖2顯示，與市場(chǎng)銷售組相比，仙草家園提供的豬肉樣品中糞臭素含量顯著性降低（P＜0.05）。

圖1 不同來(lái)源豬肉及肝臟中雄烯酮含量

圖2 不同來(lái)源豬肉及肝臟中糞臭素含量

2.2 不同來(lái)源豬肉對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

根據(jù)2.1結(jié)果，隨機(jī)購(gòu)買的市售豬肉樣品雄烯酮含量更高，因此作為高雄烯酮含量豬肉樣品進(jìn)行喂養(yǎng)；仙草家園公司提供的豬肉樣品雄烯酮含量偏低，列為低雄烯酮含量豬肉樣品進(jìn)行喂養(yǎng)。空白組小鼠給與常規(guī)試驗(yàn)鼠飼料、未進(jìn)行任何飲食干預(yù)，其狀態(tài)良好、活潑，毛發(fā)有光澤。各豬肉干預(yù)組在保證基礎(chǔ)飲食供應(yīng)的基礎(chǔ)上，替換一定量豬肉樣品進(jìn)行飼喂。其中，高雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)組雄性小鼠飼養(yǎng)1周后開始出現(xiàn)部分動(dòng)物有躁狂及攻擊行為，表現(xiàn)為喜打架撕咬；將其中撕咬情況最為嚴(yán)重的雄性小鼠分離后，其余小鼠仍出現(xiàn)嚴(yán)重的撕咬狀況，多數(shù)小鼠尾部及背部出現(xiàn)明顯咬痕，個(gè)別動(dòng)物甚至出現(xiàn)斷尾、眼睛受傷等極端損傷現(xiàn)象；低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組小鼠與高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組組相比，撕咬狀態(tài)明顯緩解，喜打架撕咬小鼠分離后其他小鼠撕咬情況明顯降低，與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。

雌性動(dòng)物喂養(yǎng)豬肉后未出現(xiàn)明顯的異常行為或狀態(tài)改變。

2.3 各組雄性小鼠睪丸及前列腺指數(shù)

如圖3所示，與空白組比較，高雄烯酮及低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組喂養(yǎng)一定量豬肉后，小鼠睪丸指數(shù)及前列腺指數(shù)等沒有顯著性差異。

圖3 各組小鼠睪丸及前列腺指數(shù)

2.4 各組雄性小鼠睪酮、雌性小鼠雌二醇含量

如圖4所示，與空白組相比，經(jīng)過(guò)高雄烯酮及低雄烯酮豬肉飼養(yǎng)后，雌鼠雌二醇水平有所降低，其中高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組（供試量10 g/kg）雌鼠雌二醇水平顯著降低（P＜0.05），而雄鼠睪酮水平顯著性增加（P＜0.01），低雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)組喂食后小鼠血清中睪酮及雌二醇水平均沒有顯著性差異。

圖4 不同喂養(yǎng)組小鼠雌二醇、睪酮水平的比較

2.5 各組小鼠卵巢組織病理學(xué)

如圖5所示，空白組小鼠卵巢皮質(zhì)及髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，顆粒細(xì)胞排列整齊、層次多；高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組與空白組相比，有個(gè)例出現(xiàn)正常卵泡數(shù)量有所減少，閉鎖卵泡較空白組有所增加；而低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組與空白組相比，個(gè)別動(dòng)物有些許閉鎖卵泡；整體上各組間形態(tài)結(jié)構(gòu)差異不顯著。

2.6 各組小鼠子宮組織病理學(xué)

如圖6所示，小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞呈柱狀排列，表面有纖毛覆蓋，間質(zhì)疏松，呈蛻膜化改變，血管、腺體數(shù)量多，腺腔面積大。各組豬肉喂養(yǎng)后小鼠子宮與空白組相比無(wú)顯著性差異。

2.7 各組小鼠睪丸組織病理學(xué)

如圖7所示，空白組小鼠睪丸精小管排列緊密整齊，精管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量密集、分布均勻、形態(tài)良好；與空白組相比，個(gè)別高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組動(dòng)物睪丸精管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量有所減少，而低雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組與空白組相比無(wú)明顯差異，睪丸精小管排列整齊，形精管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量密集、分布基本均勻，整體上各組間的組織形態(tài)差異不顯著。

3 討論

雄烯酮是豬的一種性費(fèi)洛蒙，也是豬的膻味來(lái)源，有研究表明，雄烯酮在豬體內(nèi)與雄激素及雌激素一起合成，而性激素對(duì)性腺組織的發(fā)育具有重要影響[13]*。因此推測(cè)雄烯酮可能對(duì)性腺組織產(chǎn)生一定影響。雄烯酮主要存在于豬肉脂肪中，通過(guò)豬肉攝入一定量雄烯酮是否會(huì)產(chǎn)生對(duì)激素水平的不良影響，尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

經(jīng)檢測(cè)，仙草家園提供的散養(yǎng)山豬豬肉樣品與市場(chǎng)銷售隨機(jī)采豬肉購(gòu)樣品相比，其肌肉及肝臟中雄烯酮含量顯著性降低。根據(jù)前期觀察發(fā)現(xiàn)，仙草家園散養(yǎng)的雄豬發(fā)情的次數(shù)與其他常規(guī)飼養(yǎng)場(chǎng)的雄豬明顯降低，這或許是與其體內(nèi)雄烯酮含量不高有關(guān)。此外，經(jīng)檢測(cè)仙草家園提供的豬肉與市場(chǎng)銷售豬肉相比其糞臭素含量顯著性降低。綜合2項(xiàng)指標(biāo)，可以推測(cè)糞臭素、雄烯酮含量偏低是仙草家園豬肉風(fēng)味更好的重要原因。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察雄烯酮含量不同的2種豬肉喂食后對(duì)小鼠性激素及性腺組織的影響。采用Elisa試劑盒檢測(cè)雄性小鼠血清睪酮水平。與空白組相比，高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)組小鼠的睪酮水平顯著增加；且喂養(yǎng)后雄性小鼠出現(xiàn)一定的躁狂狀況，隨著飼養(yǎng)周期的逐漸增加，部分小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重打架行為，這可能是因?yàn)椴G酮水平的增高影響雄性小鼠，增加雄性小鼠的攻擊性[20-21]*。低雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)后小鼠相比高雄烯酮含量豬肉喂養(yǎng)的小鼠，其打架行為明顯緩解。其隨著飼養(yǎng)周期的增加其躁狂狀態(tài)變化不大。研究表明，雄烯酮可能會(huì)傳遞一種優(yōu)勢(shì)、攻擊及競(jìng)爭(zhēng)的概念，因此，推測(cè)雄烯酮水平過(guò)高可能會(huì)影響雄性小鼠的睪酮水平，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)躁狂狀態(tài)，影響動(dòng)物的相關(guān)性激素水平及動(dòng)物狀態(tài)。

同時(shí)，檢測(cè)雄烯酮含量不同的2種豬肉喂食后雌鼠體內(nèi)雌二醇水平。結(jié)果表明，經(jīng)高雄烯酮豬肉喂養(yǎng)后雌鼠雌二醇水平可出現(xiàn)明顯降低。這是因?yàn)槭澄镏懈咝巯┩獢z入直接引起還是由其他物質(zhì)引起的，需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行研究及探索。

綜上，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)銷售豬肉及仙草家園提供的自然散養(yǎng)豬豬肉樣品中的雄烯酮、糞臭素等含量有明顯差異。除了引起膻味外，雄烯酮含量較高的豬肉樣品還可能影響攝入動(dòng)物小鼠的性激素水平，改變雄性動(dòng)物行為。具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

雄烯酮是豬飼養(yǎng)過(guò)程中一種常用的刺激發(fā)情的激素。試驗(yàn)初步揭示高雄烯酮含量肉樣對(duì)攝入動(dòng)物性激素的影響，但其具體量效關(guān)系、時(shí)效關(guān)系考察還不全面，尤其是長(zhǎng)期攝入是否會(huì)對(duì)性器官產(chǎn)生明顯的不良影響，也有待進(jìn)一步研究。