HPLC法同時(shí)測(cè)定辣椒粉中5種紅色合成著色劑

曹永梅，吳薇

上海旺旺食品集團(tuán)有限公司（上海 201103）

辣椒粉是一種常用的辛香調(diào)味料，為牟取利益、降低成本，辣椒粉的摻假摻雜時(shí)有報(bào)道[1-2]*，歐盟調(diào)查報(bào)告列出10大易摻假食品名單中辣椒粉就被列入其中[3]*。有的不法商家為使辣椒粉有一個(gè)好的賣相，非法添加非食用色素或超范圍使用人工合成著色劑[4-6]*，“涉紅”的辣椒粉屢禁不止。非法添加非食用紅色素主要指蘇丹紅、羅丹明B、酸性橙II等，針對(duì)這類色素的檢測(cè)方法研究較多[7-12]*。

GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)食品中允許使用的合成著色劑種類、使用范圍和限量進(jìn)行詳細(xì)規(guī)定，未在該標(biāo)準(zhǔn)使用范圍內(nèi)使用此類合成著色劑就屬于超范圍使用。GB 5009.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》中，方法的適用范圍不含辣椒粉。辣椒粉因基質(zhì)復(fù)雜，使用國(guó)標(biāo)方法中的前處理?xiàng)l件目標(biāo)物回收率低，提取不完全[13]*，針對(duì)辣椒粉中人工合成著色劑的檢測(cè)方法相關(guān)文獻(xiàn)也較少。試驗(yàn)采用高效液相色譜法（二極管陣列檢測(cè)器），測(cè)定辣椒粉中的新紅、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅B這5種紅色合成著色劑，對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜、二極管陣列檢測(cè)器（安捷倫）；XS205分析天平（美國(guó)梅特列-托利多）；ELGA Classic UV超純水機(jī)（英國(guó)ELGA）；Sigma2-16P離心機(jī)（西格瑪）；漩渦混合儀XH-D（上海皓莊）；超聲波清洗儀SCQ（上海安譜）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Laborota 4000（海道夫）；氮吹儀DC12H（上海安譜）。

1.1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品：新紅（CAS 220658-76-4，上海安譜），莧菜紅（CAS 915-67-3，上海安譜），胭脂紅（CAS 1390-65-4，百靈威），誘惑紅（CAS 25956-17-6，上海安譜），赤蘚紅B（CAS 16423-68-0，百靈威）。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（均為色譜純，Merck）；乙醇、氨水、正己烷（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)）。

提取劑采用氨水-70%乙醇水溶液1∶99（V/V），混勻。

SPE小柱ProElut PLS 500 mg/6 mL（Dikma，cat.#68005）。

試驗(yàn)用水均為經(jīng)超純水機(jī)處理后的水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

樣品提取：稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）辣椒粉于50 mL離心管中，加入30 mL正己烷，渦旋1 min，超聲15 min，以6 000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入20 mL提取劑，渦旋5 min，超聲10 min，以6 000 r/min離心5 min，立即取上清液于100 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中。下層殘?jiān)^續(xù)用15 mL提取劑重復(fù)提取2次，合并3次上清液。

待凈化液：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中收集的液體，于50 ℃真空濃縮至約6 mL，加入80 μL甲酸酸化，混勻后得到待凈化液。

樣品凈化：分別用5 mL甲醇、5 mL水將SPE小柱進(jìn)行活化、平衡，加入待凈化液，用少量乙醇淋洗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶并全部轉(zhuǎn)移到小柱上，棄去流出液，加入5 mL水洗脫，棄去流出液，將SPE柱抽干，加入6 mL 2%氨水甲醇溶液，收集洗脫液，將洗脫液在45 ℃下氮?dú)獯抵良s0.5 mL，用水定容至2 mL，0.45 μm濾膜過濾后，待上機(jī)。

累計(jì)預(yù)扣預(yù)繳應(yīng)納稅所得額=累計(jì)收入-累計(jì)免稅收入-累計(jì)減除費(fèi)用-累計(jì)專項(xiàng)扣除-累計(jì)專項(xiàng)附加扣除-累計(jì)依法確定的其他扣除

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 μg/mL）：稱取適量（精確至0.1 mg）各標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL棕色容量瓶中，分別用10%甲醇溶解后定容，混勻，置于-4 ℃下密封保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10 μg/mL）：依次吸取0.5 mL單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL棕色容量瓶中，用超純水稀釋后定容。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

依次從1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10 μg/mL）中吸取0.1，0.5，1.0，2.0和5.0 mL分別于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，制作成0.1，0.5，1.0，2.0和5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，過膜，待測(cè)。

辣椒粉HPLC色譜圖（5種目標(biāo)物混標(biāo)圖譜及辣椒粉樣品加標(biāo)圖譜）詳見圖1。

圖1 辣椒粉HPLC色譜圖

色譜柱Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)509 nm。流動(dòng)相配比及梯度洗脫時(shí)間見表1。

表1 流動(dòng)相配比及梯度洗脫時(shí)間

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，各物質(zhì)在表2所示波長(zhǎng)具有明顯吸收，因此探討在254，509和520 nm這3個(gè)波長(zhǎng)的譜圖后發(fā)現(xiàn)，254 nm處除了目標(biāo)物還有很多細(xì)小的雜峰，509 nm下的譜圖目標(biāo)物響應(yīng)最大，且無基質(zhì)干擾，故試驗(yàn)選擇509 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 各目標(biāo)物的光譜掃描波長(zhǎng) 單位：nm

2.1.2 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)中5種合成著色劑均為水溶性色素，能溶于水和乙醇，選用水、乙醇、氨水-70%乙醇水溶液作為提取試劑進(jìn)行測(cè)試，氨水-70%乙醇水溶液溶解度最大，并且用氨水-乙醇溶液可大幅減少氮吹時(shí)間。綜合考量，選取氨水-70%乙醇水溶液為此次試驗(yàn)提取溶劑。

2.1.3 前處理優(yōu)化

樣品經(jīng)提取劑提取3次后直接真空濃縮，試驗(yàn)中會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，且在過SPE柱時(shí)導(dǎo)致柱堵塞。增加正己烷除脂步驟后，不僅降低油脂對(duì)小柱凈化的影響，同時(shí)能很好地消除雜質(zhì)的干擾。

2.2 線性范圍

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用HPLC分別測(cè)其峰面積，5種目標(biāo)化合物在0.1～5 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其濃度和峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999以上。保留時(shí)間、峰面積、線性方程及相關(guān)系數(shù)詳見表3。

表3 混標(biāo)之峰面積及相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率及精密度試驗(yàn)

稱取樣品，在2個(gè)添加水平下加標(biāo)，按1.2.1步驟處理，加標(biāo)回收率及精密度見表4。在2個(gè)添加水平下目標(biāo)物樣品平均加標(biāo)回收率分別在81.23%～88.92%和87.82%～96.24%之間，SRSD＜7.76%，能滿足定量檢測(cè)的要求，詳見表4。

表4 樣品回收率及精密度（n=6）

2.4 檢出限和定量限

吸取加標(biāo)樣品（添加0.5 μg）重復(fù)進(jìn)樣10次，以3倍信噪比及10倍信噪比計(jì)算，得出檢出限及定量限，詳見表5。

表5 各目標(biāo)物的檢出限和定量限 單位：mg/kg

3 結(jié)論

試驗(yàn)使用高效液相色譜分離系統(tǒng)，梯度洗脫進(jìn)行辣椒粉中5種紅色合成著色劑的測(cè)定，前處理采用正己烷脫脂后提取，過SPE小柱，可很好地消除雜質(zhì)的干擾，有效提取目標(biāo)物，峰形尖銳，分離效果良好。試驗(yàn)方法可用于定性篩查辣椒粉中超范圍使用紅色合成色素，同時(shí)也可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。試驗(yàn)結(jié)果可為企業(yè)和監(jiān)管部門提供科學(xué)依據(jù)及技術(shù)支撐，從而更好保證辣椒粉的質(zhì)量安全，維護(hù)廣大企業(yè)及消費(fèi)者的利益。