未足月胎膜早破孕婦胎盤中Toll樣受體4/髓樣分化因子/核因子-κB通路表達及臨床意義

劉莎莎， 趙 云， 李曉旭， 張 仙， 陳菲菲

未足月胎膜早破（preterm prelabor rupture of membranes，PPROM）是指未滿37周臨產前發生的胎膜破裂，發病率較低，僅為3%左右[1]，但臨床危害性極大，對產婦及胎兒的生命健康均造成極大威脅。PPROM不僅使胎膜結構發生改變，還會對產婦的免疫功能造成直接影響[2]。宮內感染是PPROM的常見并發癥，同樣也是PPROM發病的主要原因[3]，當孕產婦受到感染時，機體的炎癥反應被激活，穩態平衡被打破，病原菌由產道上行引發宮內感染、早產、新生兒感染甚至死亡等嚴重后果[4]。Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）是免疫應答和病原菌識別的重要受體[5]，可調控下游分子髓樣分化因子（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88） 和 核 因子 -κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）參與介導機體免疫反應、抗炎、抗病毒感染等過程[6]。隨著對PPROM孕婦宮內感染的不斷探索，有研究指出，TLR4、NF-κB等分子在PPROM孕婦宮內感染的發生發展中發揮重要的調控作用，并可一定程度上預測宮內感染的發生[7-8]。然而，目前尚不清楚，TLR4/MyD88/NF-κB通路在PPROM孕婦胎盤中的表達水平是否發生變化，且該通路的表達是否與宮內感染的發生有關。基于此，本次研究對PPROM并發宮內感染孕婦胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達水平進行檢測，對比其與未感染患者的差異，試圖揭示PPROM并發宮內感染新的分子通路和機制，為臨床預防和診斷PPROM并發宮內感染提供更多理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2020年6月湖北省婦幼保健院收治的PPROM患者90例，按照是否合并宮內感染將患者分為感染組（32例）和非感染組（58例），另選同期正常分娩孕婦50名作為對照組。對比各組人群年齡、孕次、產次等一般資料，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 入選各組人員的一般資料Table 1 Clinical data of patients compared in terms of infection

1.2 納入及排除標準

納入標準：所有入組對象均為單胎妊娠；PPROM患者孕周均低于37周；經臨床檢查結合患者癥狀確診為胎膜早破；感染組患者符合宮內感染相關診斷標準[9]；均為22～35歲適齡產婦。

排除標準：前置胎盤產婦；多囊卵巢綜合癥；合并妊娠期高血壓、高血壓史者；合并泌尿系統感染及其他感染性疾病者；35歲以上高齡產婦；對照組孕婦排除胎膜早破和宮內感染等臨床癥狀，且未發現體溫升高情況。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 分娩前，對感染組患者外陰進行消毒處理，以陰道窺器暴露宮頸，采用棉簽刮取宮頸管內分泌物及黏液，將棉簽置于無菌試管內，由檢驗科醫師對病原微生物進行培養和鑒定。此外，于PPROM患者分娩后，取距離胎膜破口處最近的胎盤組織，另取對照組產婦正常胎盤組織，均保存于-80℃條件下，以進行TLR4/MyD88/NF-κB通路的檢測。

1.3.2 病原菌鑒定分析 將收集到的感染組患者的宮頸分泌物和黏液接種于血平板（廠家：上海滬崢生物科技有限公司；貨號：HZZ105）中，置于含CO2的細胞培養箱（廠家：南京貝登醫療股份有限公司；型號：BPN-80CRH）內進行細菌培養，當警報為陽性時，采用全自動細菌分析儀（廠家：濟南童鑫生物科技有限公司；型號：MA120）對感染組標本中病原菌進行鑒定和分析。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測TLR4/MyD88/NF-κB通路的mRNA表達水平 取先前收集到的臨近胎膜破口處的胎盤組織和正常胎盤組織，采用Trizol總RNA提取試劑（廠家：上海邦景實業有限公司；貨號：BJS964333；規格：100 mL）對組織內的總RNA進行抽提，然后將總RNA逆轉錄成cDNA，TLR4、MyD88、NF-κB引物序列設計見表2，設置反應條件為94℃5 min，94℃30 s，72℃30 s，循環40次，72℃5 min，使用qRT-PCR儀（廠家：濟南來寶醫療器械有限公司；型號：MA-6000）檢測以GAPDH作為標準化內參時胎膜中TLR4/MyD88/NF-κB通路的相對mRNA表達水平。

表2 TLR4/MyD88/NF-κB通路引物設計Table 2 Primers used in this study for amplifying TLR4/MyD88/NF-κB pathways

1.3.4 Western bolt法檢測 TLR4/MyD88/NF-κB 通路的蛋白表達水平 取先前收集到的臨近胎膜破口處的胎盤組織和正常胎盤組織，采用全蛋白試劑盒（廠家：上海博湖生物科技有限公司；貨號：BH-S63616）提取各組織中的總蛋白，采用BCA法測定蛋白水平后將緩沖液加入目標蛋白中，凝膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，以濃度為5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，分別滴加TLR4、MyD88、NF-κB p65和 β-actin一抗，稀釋比均為1∶1 000，4℃下孵育一夜，次日滴加辣根過氧化物酶標記的相應羊抗兔二抗，室溫下孵育2 h后以增強化學發光法顯色，以上所有試劑盒均購自上海Abcam公司，均嚴格按照試劑盒說明書要求操作，采集圖像后對比各組條帶灰度值。

1.3.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件處理數據，計量資料以表示，多組比較采用方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗。受試者工作特征（ROC）曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對于PPROM并發宮內感染的診斷效能，計數資料率用n（%）表示，單因素分析以χ2檢驗，多因素分析采用logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病原菌分析

32例感染患者陰道分泌物中檢出78株病原菌，其中革蘭陽性菌36株，占46.2%，革蘭陰性菌33株，占42.3%，真菌9株，占11.5%，見表3。

表3 感染患者陰道分泌物病原菌種類及株數Table 3 Species of pathogens isolated from vaginal secretions of patients with intrauterine infection

2.2 胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達

與對照組相比，非感染組和感染組患者胎盤 組 織 中 TLR4、MyD88、NF-κB 的 mRNA 和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），且感染組患者TLR4、MyD88、NF-κB的 mRNA 和蛋白水平顯著高于非感染組（P＜0.05），見表4、圖1、圖2。

圖2 各組胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的蛋白表達Figure 2 Protein expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

表4 各組胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達Table 4 Expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

圖1 各組胎盤中TLR4/MyD88/NF-κB通路的mRNA表達Figure 1 The mRNA expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

2.3ROC曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對PPROM并發宮內感染的診斷價值

ROC 曲 線 評 估 TLR4、MyD88和 NF-κB 的mRNA表達水平對PPROM并發宮內感染的診斷價值，結果發現，當TLR4表達高于13.8、MyD88表達高于24.0、NF-κB表達高于26.6時，診斷PPROM并發宮內感染有較高的效能（P＜0.05），見表5、圖3。

圖3 ROC曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對PPROM并發宮內感染的診斷價值Figure 3 ROC curves for evaluating the performance of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in diagnosing preterm premature rupture of membranes-associatd intrauterineinfection

表5 ROC曲線評估TLR4/MyD88/NF-κB通路對PPROM并發宮內感染的診斷價值Table 5 ROC curves illustrating the value of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in diagnosing preterm premature rupture of membranes-associated intrauterine infection

2.4 PPROM并發宮內感染單因素分析

收集PPROM患者臨床資料，分析導致PPROM并發宮內感染的危險因素，結果發現，PPROM并發宮內感染與患者的破膜孕周和陰道檢查次數有關（P＜0.05），而與破膜后待產時間、流產史和引產史無關（P＞0.05），見表6。

表6 PPROM并發宮內感染單因素分析Table 6 Univariate analysis of the risk factors for preterm premature rupture of membranes-associated intrauterine infection

2.5 PPROM并發宮內感染多因素分析

將上述影響PPROM并發宮內感染的危險因素納入logistic多因素回歸分析，以是否并發宮內感染（是=1，否=0）作為因變量，TLR4 mRNA水平（＞13.8=1，≤13.8=0）、MyD88 mRNA水平（＞24.0=1，≤24.0=0）、NF-κB mRNA 水 平（＞26.6=1，≤26.6=0）、破膜孕周（≤33周=1，＞33周=0）和陰道檢查次數（＞5次=1，≤5次=0）作為自變量，分析引起宮內感染的獨立危險因素，結果發現，TLR4/MyD88/NF-κB通路異常高表達、破膜孕周越小、陰道檢查次數越多，并發宮內感染的風險越高（P＜0.05），見表7。

表7 PPROM并發宮內感染多因素分析Table 7 Multivariate analysis of risk factors for intrauterine infection associated with preterm premature rupture of membranes

3 討論

目前學術界普遍認為，PPROM和宮內感染具有相互影響、互為因果的關系，宮內感染既是PPROM的病因，又是其重要并發癥之一[10]。孕婦懷孕期間，通過羊水和胎盤與胎兒進行營養物質交換，若胎兒在母體內未發育成熟，胎膜即出現破裂情況，極易導致病原菌侵入，激活機體炎癥反應[11]，中性粒細胞等免疫細胞聚集于絨毛膜和羊膜，逆行感染引起子宮腔內感染，進而導致早產、死胎、新生兒感染、腦損傷等嚴重后果[12]。因此，如何在早期對PPROM孕婦并發宮內感染進行監測和診斷對提高母嬰預后至關重要。基于此，本研究檢測PPROM并發及未并發宮內感染孕婦的胎盤內TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達，分析導致宮內感染的影響因素，旨在為PPROM并發宮內感染患者的早期預防、監測和治療提供更多方向。

本研究從32例感染患者陰道分泌物中檢出78株病原菌，革蘭陽性菌占46.2%，以金黃色葡萄球菌為主；革蘭陰性菌占42.3%，以大腸埃希菌為主；真菌11.5%，均為白念珠菌。過往研究指出，細菌、病毒、衣原體、支原體等病原微生物均可通過血源性等方式入侵宮腔，引發絨毛膜羊膜炎[13]。當孕婦出現PPROM時，陰道流液和漿性分泌物增多，陰道pH值由弱酸性變為堿性[14]，而金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等病原菌最適宜在37℃、堿性環境下繁殖，胎膜破裂導致的陰道環境改變加速了病原菌增生，使其更易上行感染至宮腔[15]。因此，在對PPROM并發宮內感染患者進行治療時，應選擇對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌抗菌活性更強的抗生素，防止產褥期感染、新生兒感染等疾病的發生發展。

PPROM并發宮內感染的致病因素較為復雜，宮腔內壓力過大、羊膜囊受力不均、孕期缺乏必需的微量元素均會導致感染風險加劇[16]。相關資料顯示，妊娠期高血壓、高血糖、胎盤前置等因素均是引發宮內感染的危險因素[17]。本研究在排除基礎疾病和前置胎盤等因素的干擾后，發現PPROM并發宮內感染與患者的破膜孕周和陰道檢查次數有關（P＜0.05），而與破膜后待產時間、流產史和引產史無關（P＞0.05），這也與曹怡等[18]的研究結果較為一致。推測原因可能為，破膜孕周越小，胎兒發育尚不成熟，此時分娩可能會影響胎兒的存活率，且極易對胎兒心、腦、肝臟、肺部等功能造成永久不可逆損傷[19]，因此臨床多采用醫學手段延長胎兒在母體中的發育時間，并通過多次陰道檢查確定胎兒發育狀況，而長時間的胎膜破裂和多次陰道檢查等人工干預手段顯著增加了病原菌逆行感染的風險[20]。

最近的研究證實TLR4在單核細胞、巨噬細胞、絨毛膜和羊膜細胞中廣泛表達，參與影響機體抗病毒感染和免疫反應的過程[21]。MyD88是一種胞質可溶性蛋白，可受TLR4調控，參與上下游信息傳遞過程[22]，影響疾病進展。NF-κB是細胞內調控先天性免疫應答和適應性免疫應答的關鍵轉錄因子，在多種惡性腫瘤、急慢性炎癥性疾病和神經退行性疾病中異常高表達[23]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路作為機體識別病原體、發揮防御功能的重要通路之一，與過敏性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的發病有關[24]。本研究結果顯示，TLR4/MyD88/NF-κB通路在PPROM并發宮內感染孕婦胎盤組織中高表達，且當TLR4 mRNA表達高于13.8、MyD88 mRNA表達高于24.0、NF-κB mRNA表達高于26.6時，診斷PPROM并發宮內感染有較高的效能（P＜0.05）。TLR4可與大腸埃希菌等革蘭陰性菌結合產生脂多糖，并識別白念珠菌等真菌細胞壁內的甘露聚糖等蛋白質復合物，激活MyD88信號轉導途徑[25]，細胞因子水平增加，進而上調NF-κB的表達，促進炎性介質等細胞因子的合成、分泌和釋放，激活巨噬細胞等免疫細胞介導的炎性反應，影響機體天然免疫反應和對病原菌的易感性。因此，TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達水平可作為反映機體免疫反應和抗病毒反應的有效標志物。

綜上所述，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在PPROM并發宮內感染的孕婦胎盤組織中的表達顯著升高，破膜孕周低于33周、陰道檢查次數多于5次及TLR4/MyD88/NF-κB通路異常活化與PPROM并發宮內感染的發生與發展有關，可作為臨床篩查和診斷PROM并發宮內感染新指標。