基于類器官培養(yǎng)的艱難梭菌毒素B損傷結(jié)腸上皮機(jī)制的初步研究

呂 婷， 王 莉， 趙 冰， 黃海輝

艱 難 梭 菌（Clostridioides difficile） 是 革 蘭陽性厭氧產(chǎn)芽孢桿菌， 25%～33%的抗生素相關(guān)性腹瀉以及90%的偽膜性腸炎都由艱難梭菌所致，此類感染統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridioides difficileinfection， CDI）[1]。目前認(rèn)為艱難梭菌主要通過分泌毒素而引發(fā)感染，其中艱難梭菌毒素B（Clostridioides difficiletoxins B，TcdB）在致病過程中占據(jù)主要地位，體外機(jī)制研究主要在細(xì)胞模型如Caco2細(xì)胞、NCM 460細(xì)胞中進(jìn)行[2-3]。類器官是體內(nèi)的多能干細(xì)胞在體外培養(yǎng)形成的三維細(xì)胞集合，模擬體內(nèi)器官的空間結(jié)構(gòu)和功能。腸道類器官模型比傳統(tǒng)的體外細(xì)胞模型具有明顯優(yōu)勢，模擬了腸道的復(fù)雜細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性，提供了在體外系統(tǒng)中探索宿主與病原體相互作用的獨(dú)特平臺。盡管結(jié)腸類器官模型取得了很大進(jìn)展，并且已經(jīng)使用這種類器官系統(tǒng)開展了結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制及藥敏方面的研究，但用于CDI研究較為少見[4]。本研究擬通過構(gòu)建小鼠結(jié)腸類器官模型，對艱難梭菌毒素?fù)p傷結(jié)腸上皮的致病機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料來源 實驗動物為6～8周雄性野生型C57BL/6 SPF級小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。表達(dá)重組TcdB（recombinant TcdB，rTcdB）的巨大芽孢桿菌菌株由美國馬里蘭大學(xué)馮漢平教授惠贈。

1.1.2 主要儀器與試劑 乙二胺四乙酸（EDTA）（美國ThermoFisher Scientific公司）、基質(zhì)膠（美國corning公司）、總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]、GoScriptTM試劑盒（美國Promega公司）、SYBR Green qPCR Master Mix（美國Bimake公司）。

3D類器官培養(yǎng)組分：Advanced DMEM/F12、penicillin/streptomycin、glutamax、N2 supplement和 B27 supplement均購自美國Gibco公司，N-acetylcysteine 和Nicotinamide 均購自美國Sigma-Aldrich公司，A83-01、 Rho kinase （ROCK）inhibitor （Y-27632））和前列腺素E2（PGE2）均購自美國MedChemExpress公司，重組 Wnt 3a 蛋白 、重組 R-Spodin 1 蛋白和重組 Noggin 蛋白均購自中國德州奧格銳生生物科技有限公司，表皮生長因子重組蛋白（EGF）（美國ThermoFisher Scientific 公司），Primocin（美國 Invivogen 公司）。

rTcdB表達(dá)用試劑：LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、5 mg/L四環(huán)素，均購自上海生工公司）；木糖（上海生工公司）；HisTrap HP柱（美國General Electric Company公司）；透析卡（美國ThermoFisher Scientific公司）；100 kDa超濾管（美國Millipore公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)體系 在Miyoshi等[5]建立的培養(yǎng)體系上略作修改，將N2 supplement（1×）、B27 supplement（ 1×）、glutamax（1×）、penicillin/streptomycin（1×）、N-Acetylcysteine（1.25 mmol/L）、EGF（50 μg/L）、Noggin（100 μg/L）、Wnt-3a（50 μg/L）、R-Spodin-1（1 mg/L）、A83-01（1 μmol/L）、Y-27632（10 μmol/L）、PGE2（10 nmol/L）、Nicotinamide（10 mmol/L）、Primocin（ 100 mg/L）加至1L Advanced DMEM/F12中，混勻后經(jīng)0.22 μm除菌濾器過濾后備用。

1.2.2 小鼠結(jié)腸上皮隱窩分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼處死C57BL/6小鼠，75%乙醇噴灑消毒，“Y”字剪開腹腔將回盲部后的6～8 cm的結(jié)腸腸段取出；剪開并刮除結(jié)腸黏膜面的糞便和黏液；清洗鼠結(jié)腸組織5～10 min至洗滌液澄清，用剪刀剪成大約2～3 mm的腸塊，置于5 mmol/L EDTA溶液中，4℃消化35 min。將結(jié)腸組織碎片置于含有5 mL DPBS的15 mL離心管中，劇烈搖晃，用基質(zhì)膠重懸，鋪至48孔細(xì)胞板中，37℃10～30 min后加入鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)體系，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d換新的培養(yǎng)體系，連續(xù)培養(yǎng)5～7 d，觀察、拍照并記錄倒置顯微鏡下類器官生長情況。

1.2.3 鼠結(jié)腸類器官傳代和培養(yǎng) 棄去原培養(yǎng)體系，用1 mL槍頭將基質(zhì)膠吹打成碎片，1 400 r/min離心2 min，取沉淀加入含2 mmol/L EDTA的DPBS混勻再1 200 r/min離心5 min，沉淀即為類器官; 用基質(zhì)膠重懸類器官沉淀后，垂直接種于48孔培養(yǎng)板中，待膠凝固后加入新培養(yǎng)體系培養(yǎng)。

1.2.4 rTcdB制備 將表達(dá)rTcdB的巨大芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，經(jīng)木糖誘導(dǎo)12～14 h后超聲破菌，獲得的菌體裂解液經(jīng)HisTrap HP柱純化；純化后得到的蛋白使用透析卡磁力攪拌過夜，透析卡中的蛋白用100 kDa超濾管超濾濃縮，得到高純度的蛋白。

1.2.5 建立TcdB損傷結(jié)腸類器官模型 取穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的結(jié)腸類器官接種于48孔板，設(shè)置rTcdB的濃度為：5 pmol/L、10 pmol/L，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，然后分別加入含上述rTcdB濃度梯度的鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)液，以不含rTcdB處理的結(jié)腸類器官作陰性對照，置于37°C、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h、24 h后在倒置顯微鏡下觀察類器官的生長情況。

1.2.6 采用總RNA提取試劑盒 提取對照組和損傷組RNA，提取產(chǎn)物的D260/D280比值1.8～2.0； 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA；以編碼磷酸甘油醛脫氫酶的GAPDH 基因作為內(nèi)參基因（GAPDH 正向引物序列為5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'， 反 向 引 物 序列 為 5'- CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'），Lgr5基因正向引物序列為5'- CGGGACCTTGAAGATTTCCT-3'，反向引物序列為5'-AGCAGGCCGTTCACAACATC-3'，Axin2基因正向引物序列為5'-GCTCCAGAAGATCACAAAGAGC-3’， 反 向引物序列為5'-AGCTTTGAGCCTTCAGCATC-3'，Bmi1基因正向引物序列為5'-AAATCCCCACTTAATGTGTGTCC-3'，反向引物序列為5'-CTTGCTGGTCTCCAAGTAACG-3'。

取稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，采用 SYBR Green 試劑盒對cDNA進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），引物序列同上。qRT-PCR 體系包括 SYBR?Premix Ex Taq（2×）5 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、去離子水3 μL，條件為95 ℃預(yù)變性 3 min，95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s（40個循環(huán)）、72℃ 30 s。重復(fù)3次取平均值。采用 2-ΔΔCt法計算上述基因相對表達(dá)量。

1.2.7 類器官RNA-seq測序和生物信息學(xué)分析 選取對照組和rTcdB 5 pmol/L處理12 h后的艱難梭菌毒素?fù)p傷組的類器官樣本，提取RNA后將樣本送至北京貝瑞公司進(jìn)行RNA-seq測序。edgeR軟件篩選差異基因，DAVID網(wǎng)站進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology， GO） 和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 通路富集分析，對篩選出的差異基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）中進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein Protein Interaction Network， PPI）分析，將得出的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape（3.9.1）得到可視化網(wǎng)絡(luò)，分別利用Cytoscape中的MCODE和CytoHubba插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y選關(guān)鍵基因（Hub gene），MCODE算法取得分最高的集合，CytoHubba中我們采用最常用的MCC算法，取前10位的基因集合，兩種算法的集合作為最終Hub gene的選擇。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

樣品基因表達(dá)量采用t檢驗分析，P值＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代鼠結(jié)腸3D類器官構(gòu)建成功及可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)

小鼠C57BL/6的結(jié)腸隱窩包埋在基質(zhì)膠培養(yǎng)，第0天為長條形，次日可形成單層細(xì)胞球結(jié)構(gòu)，在連續(xù) 7 d的培養(yǎng)過程中隱窩逐漸閉合，體積逐漸增大，形成圓球狀的復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)，鼠結(jié)腸類器官體外構(gòu)建成功[5-6]。構(gòu)建的類器官可連續(xù)增殖傳代10代（圖1）。

圖1 鼠結(jié)腸類器官構(gòu)建和傳代Figure 1 The construction and passage of mice colon organoid

2.2 TcdB損傷結(jié)腸類器官模型

借鑒Tao等[6]、Saavedra等[7]的實驗方案，100 pmol/L rTcdB加入到結(jié)腸類器官中，導(dǎo)致類器官全部死亡，后采用5 pmol/L和10 pmol/L rTcdB分別處理結(jié)腸類器官24 h和48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在作用24 h時均可使類器官生長緩慢及部分死亡，10 pmol/L rTcdB 作用48 h時類器官死亡最為明顯，此系列濃度的選擇也與Alonso等[8]發(fā)表的人結(jié)腸內(nèi)TcdB毒素濃度相近（圖2）。考慮到rTcdB為5 pmol/L時即可損傷類器官，為此我們選擇5 pmol/L為后續(xù)實驗濃度，并將作用時間設(shè)置為12 h和24 h，結(jié)果顯示相較于對照組，損傷組類器官體積相對較小，狀態(tài)相對較差，作用12 h類器官狀態(tài)好于24 h（圖2）。同時收取類器官樣本檢測數(shù)個代表性的干性基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示損傷組Lgr5、Axin2、Bmi1表達(dá)顯著上調(diào)（圖3）。為了進(jìn)一步研究TcdB作用機(jī)制，我們選取5 pmol/L rTcdB組和對照組作用12 h時的樣本進(jìn)行RNA-seq分析。

圖2 rTcdB （5 pmol/L、10 pmol/L）損傷鼠結(jié)腸類器官12 h、24 h、48 hFigure 2 Injury of mice colon organoids after addition of rTcdB （5 pmol/L， 10 pmol/L） for 12 h， 24 h， and 48 h

圖3 rTcdB （5 pmol/L）感染鼠結(jié)腸類器官12 h和24 h基因表達(dá)Figure 3 Relative expression of genes in mice colon organoids after being infected by rTcdB （5 pmol/L） for 12 h and 24 h

2.3 差異基因表達(dá)水平分析

根據(jù)樣本基因表達(dá)水平不同，篩選出損傷組和對照組之間的差異表達(dá)基因，以|log2Fold Change|＞1，P＜0.05為篩選條件，共篩選出差異基因3 140個，與對照組相比，損傷組表達(dá)上調(diào)基因有1 936個，下調(diào)基因有1 204個，使用火山圖展示差異基因的分布情況（圖4A）。

2.4 差異基因的GO分析

根據(jù)差異基因的結(jié)果，利用GO富集分析對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行功能注釋，GO分析結(jié)果表明，在生物過程（biological progress， BP）中富集了244個功能，在細(xì)胞組成（cellular component， CC）中富集了54個功能，分子功能（molecular function，MF）中富集了72個功能。其中損傷組上調(diào)基因主要涉及的BP通路有低氧應(yīng)答、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和上皮細(xì)胞分化等，圖4B列出了BP、CC和MF的前10個富集通路。損傷組下調(diào)基因涉及的BP通路包括細(xì)胞增殖正向調(diào)控、免疫系統(tǒng)過程、對γ干擾素的細(xì)胞應(yīng)答、對β干擾素的細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)等（圖4C）。

圖4 差異基因的火山圖和GO分析Figure 4 Volcano plot and GO analysis of differentially expressed genes

2.5 差異基因的KEGG分析

KEGG分析結(jié)果表明，共有47條通路顯著富集，其中損傷組上調(diào)基因涉及通路主要與視黃醇代謝、膽汁分泌、花生四烯酸代謝和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體等相關(guān)（圖5A）；損傷組下調(diào)基因涉及通路主要包括Wnt信號通路、細(xì)胞黏附模塊、腫瘤壞死因子信號通路和轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路等（圖5B）。其中，細(xì)胞黏附模塊中CLDN1和CLDN10為黏膜屏障的代表性基因，二者表達(dá)在損傷組中均顯著下調(diào)。

圖5 差異基因的KEGG分析Figure 5 KEGG analysis of differentially expressed genes

2.6 差異基因編碼蛋白質(zhì)的PPI分析

蛋白之間通常通過相互作用結(jié)合成復(fù)合物行使相應(yīng)的功能，具有相互作用的差異基因通常具有相似的功能。采用Cytoscape的MCODE和CytoHubba（MCC算法）分別篩選出重要基因作圖，結(jié)果見圖6。二者模塊的基因集取交集得到的基因作為關(guān)鍵基因，分別編碼IFI44、IFIT3、IFIT1、RTP4、CXCL10、GBP3、GBP2、RSAD2 和 IFI47的基因，關(guān)鍵基因的表達(dá)在損傷組中均為下調(diào)。其中IFIT3、IFIT1、GBP3和GBP2與α/β干擾素、γ干擾素的細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)。

圖6 關(guān)鍵基因Figure 6 Hub genes

3 討論

本研究運(yùn)用結(jié)腸類器官構(gòu)建了TcdB損傷結(jié)腸上皮的模型，TcdB可以導(dǎo)致結(jié)腸類器官生長緩慢及死亡，多個代表性干性基因（stemness-related genes）表達(dá)發(fā)生顯著改變。并利用RNA-seq技術(shù)從整體水平上研究正常結(jié)腸類器官組和損傷組的基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示正常結(jié)腸類器官組和損傷組之間存在著多種差異基因的上調(diào)和下調(diào)，涉及多種細(xì)胞信號和生物學(xué)過程。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，兩組在多個通路中均富集了大量的差異基因，說明TcdB對結(jié)腸類器官的作用是多條途徑相互作用的結(jié)果。上調(diào)基因富集通路有低氧應(yīng)答，與以往臨床報道CDI導(dǎo)致腸道內(nèi)缺氧、低灌注相符[9]。下調(diào)基因富集的通路有對β、γ干擾素的細(xì)胞應(yīng)答。同時，PPI分析中得到的9個關(guān)鍵基因，其中的Ifit3、Ifit1、Gbp3和Gbp2參與了α/β干擾素以及γ干擾素等信號通路的調(diào)節(jié)，在TcdB對結(jié)腸上皮細(xì)胞的作用中起到了關(guān)鍵作用。除了細(xì)菌因素外，宿主免疫反應(yīng)也是CDI嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素[10]，目前對干擾素研究主要集中在γ干擾素上，Abt等[11]報道了γ干擾素在小鼠CDI中具有保護(hù)作用，McDermott等[12]隨后報道了γ干擾素是通過獨(dú)立于炎性細(xì)胞因子表達(dá)和粒細(xì)胞募集的機(jī)制在艱難梭菌結(jié)腸炎中起保護(hù)作用，但其詳細(xì)機(jī)制仍未完全闡明。近期Hamo等[13]通過測定CDI患者血清樣本細(xì)胞因子和趨化因子的濃度，首次報道了α干擾素與嚴(yán)重CDI密切相關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)除了γ干擾素外，α/β干擾素也參與了艱難梭菌的致病過程，且與α/β干擾素相關(guān)的基因在整個致病過程中低表達(dá)，這為后續(xù)探索艱難梭菌致病機(jī)制提供了新方向。

在KEGG通路分析中特別引起注意的是花生四烯酸代謝通路相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。有文獻(xiàn)報道，TcdB通過上調(diào)磷脂酶A2（Phospholipase A2）的表達(dá)，促進(jìn)14-碳-花生四烯酸的表達(dá)[14-15]。雖然目前研究者僅報道了TcdA對腸道的損傷可能由內(nèi)源性大麻素花生四烯酸乙醇胺介導(dǎo)[16]，但鑒于TcdA和TcdB結(jié)構(gòu)上一定相似性，TcdB對上皮的損傷也可能與花生四烯酸相關(guān)。在下調(diào)基因涉及的通路富集中，Wnt通路和細(xì)胞黏附模塊中富集的基因表達(dá)明顯。Tao等[6]提出TcdB與結(jié)腸上皮細(xì)胞的Wnt信號通路受體Frizzleds結(jié)合起作用，Wnt信號通路的減弱直接損害結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖，另外，細(xì)胞黏附模塊中的CLDN1和CLDN10為黏膜屏障的代表性基因，其在損傷組中的表達(dá)較對照組顯著下調(diào)，研究顯示TcdB會破壞腸道緊密連接，導(dǎo)致黏膜屏障受損[17]。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建TcdB感染鼠結(jié)腸類器官模型，篩選出了與感染密切相關(guān)的通路，發(fā)現(xiàn)TcdB可能通過調(diào)節(jié)干性基因表達(dá)，增強(qiáng)低氧應(yīng)答通路，減弱α/β干擾素、γ干擾素的細(xì)胞應(yīng)答通路，調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝通路和Wnt信號通路來介導(dǎo)毒素?fù)p傷結(jié)腸上皮細(xì)胞。為深入探究艱難梭菌致病機(jī)制提供了新思路。后期將針對差異基因的篩選結(jié)果驗證后開展進(jìn)一步研究，探討艱難梭菌毒素?fù)p傷結(jié)腸上皮細(xì)胞的機(jī)制。