“腎主骨”理論 “髓變先于骨變”的腎-髓-骨調節機制構建

王璠琛 何琪 肖嘉聰 潘兆豐 黎淼 黎少聰 王海彬

1．廣州中醫藥大學,廣東 廣州 510405

2．廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣東 廣州 510405

中醫“腎主骨”理論起源于距今2000多年前的《黃帝內經》,其解釋了腎、髓、骨三者生理病理變化的互相作用。《素問·痿論》載:“腎氣熱,則腰脊不舉,骨枯而髓減,發為骨痿。”從生理上來講,腎為先天之本,腎藏精,精生髓,髓養骨。從病理上來看,“腎病及骨”“髓虛則骨失所養”,現代醫學角度揭示了其原因是骨髓內細胞如破骨細胞等及其分泌因子代謝異常,造成內環境紊亂引起骨的異常癥狀。在臨床最為典型的就是慢性腎臟病-礦物質和骨異常(chronic kidney disease-mineral bone disorders,CKD-MBD)、骨質疏松癥(osteoporosis,OP)等。

隨著臨床骨病與科研成果的深入研究,本研究團隊已逐步洞悉了疾病發展的動態過程,創新性地提出“髓變先于骨變”的論點,沿循中西醫基礎理論相結合的路線,嘗試構建腎-髓-骨整體調節機制。本文將從5個方面分析其功能相關及分子基礎,并闡釋中醫“腎主骨”理論指導下“髓變先于骨變”的腎-髓-骨整體調節機制的臨床意義:①中醫學與現代醫學對腎、髓、骨的認識;②“髓變先于骨變”的理論依據;③“髓變先于骨變”在臨床疾病發展中的動態表現;④生理狀態下腎-髓-骨調節機制;⑤病理狀態下腎-髓-骨調節機制。

1 中醫學與現代醫學對腎、髓、骨的認識

在古代醫家的認知中,腎為五臟之一,腎主藏精、主水、主納氣,是人生長發育的重要器官;髓為奇恒之腑,包括腦髓、脊髓和骨髓,其中骨髓具有養骨、生血之功效;骨藏髓,主司支持與運動[1]。三者組成了人體發育、運動的基本結構。

隨著現代醫學的不斷研究,越來越多的理論表明中醫學的“腎”中還存在“功能腎”這一功能單位。功能腎在多個層面影響著骨、髓及其分子水平的物質代謝[2];同時在現代醫學中,骨不僅作為一種支撐人體的組織,還是一種與腎、髓互相影響的內分泌器官[3];對髓的現代醫學認識包括骨髓內各種細胞及細胞因子,如骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、各種骨細胞及其分泌的因子等,這些研究拓展了腎、髓、骨的生理功能。同時有研究認為,受精卵作為全能干細胞其具有生長發育、繁衍生育的功用[4],這一點與腎精中的先天之精相似,其“生髓”分化成為BMSCs等,BMSCs等在特定條件下向成骨轉化,實現“養骨”,這與中醫理論“腎精生髓養骨”高度吻合。

2 “髓變先于骨變”的理論依據

在現代醫學研究中,對于髓內物質種類的認識越發廣泛,常見的與骨病相關的髓內物質包括:骨髓間充質干細胞、脂肪細胞、成骨細胞、破骨細胞、及其所分泌的物質等。髓內細胞及其分泌物直接影響著骨的形態與質量,調控骨代謝過程。骨病的形成是髓內相關物質代謝異常而出現的癥狀,被認為符合“髓變先于骨變”的過程。

2.1 骨髓間充質干細胞

BMSCs是骨髓中能夠自我更新、分化為有限數量的細胞類型、支持造血細胞、調節免疫活性的祖細胞群體,隨著人年齡的增長,BMSCs的增殖和分化水平顯著降低[5]。在老年性骨質疏松癥中,核小體組裝蛋白1樣2(nucleosome assembly protein 1-like 2,NAP1L2)的表達在衰老過程中顯著升高,與BMSCs的成骨能力受到抑制密切相關[6]。相關研究揭示了NAP1L2激活核因子-Kappa B(nuclear factor- kappa B,NF-κB)途徑并通過表觀遺傳調節組蛋白H3K14乙酰化多克隆抗體的組蛋白乙酰化,削弱成骨的可能調節機制[7]。NAP1L2通過NF-κB信號通路調節細胞衰老過程,確定NAP1L2是BMSCs衰老的重要調節劑。在骨質疏松癥發展過程中,BMSCs分化為成骨細胞的能力降低,從而導致骨形成減少,證明BMSCs分化改變導致骨質疏松癥的形成[8]。

有相關研究表明,BMSCs分泌外泌體長鏈非編碼RNA肺腺癌轉移相關轉錄子1通過介導microRNA-34c/SATB2軸緩解骨質疏松癥;另外,抑制線粒體吞噬可以促進BMSCs衰老,重要的線粒體代謝調節酶Sirtuin-3 (Sirt3)可以通過激活線粒體吞噬作用來延緩BMSCs衰老并表現出良好的抗骨質疏松作用[9-10]。

2.2 骨髓脂肪組織及骨髓成脂譜系前體

骨髓主要分為紅骨髓和黃骨髓兩種類型,其中紅骨髓是由造血細胞組成,黃骨髓主要由脂肪細胞組成,骨髓脂肪組織(bone marrow adipose tissue,BMAT)占全身脂肪的10%以上[11]。長期以來,BMAT被認為是一種惰性填充物,占據了骨丟失和造血減少造成的空隙,而現在,BMAT被認為是一種分泌和代謝器官,并分泌間接影響骨代謝的細胞因子[12],骨髓脂肪細胞不僅作為儲存組織,而且還是內分泌和旁分泌細胞,具有促進局部和全身代謝的潛力。骨髓中脂肪細胞的數量在骨骼生長過程中逐漸增加,但在衰老過程中也逐漸增加[13]。這一過程與骨中的代謝過程平行。在脂肪組織分泌因子中,最重要的是脂聯素和瘦素。BMAT分泌的脂聯素以抗成骨方式發揮作用,通過骨微環境中的旁分泌機制在短期內阻斷成骨細胞增殖[14]。同時,瘦素增強T淋巴細胞反應,通過炎癥反應導致破骨細胞活性增加,因此對骨代謝產生影響[15]。

單細胞RNA測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)的出現為研究組織中的細胞異質性提供了機會。骨髓間充質基質細胞是含有間充質干細胞以及其它細胞類型的高度異質性細胞群,近期一些研究確定了間充質基質細胞的一個突出亞群-骨髓成脂譜系前體(marrow adipogenic lineage precursor,MALP),其不含脂滴,且特異性表達脂肪細胞標志物。并認為它是骨髓脂肪組織的主要細胞成分[16]。有研究表明,MALP具有細胞體和多個突起,形成3 D網絡結構,幾乎接觸骨內的每個細胞,認為MALP的主要功能是調節骨髓環境,包括骨吸收,研究確定MALP在正常骨代謝和病理性骨丟失過程中,在以NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)依賴性的方式控制骨重建中起到了關鍵作用[17]。

2.3 骨髓來源的巨噬細胞

居住在骨中的巨噬細胞 (bone marrow-derived macrophages,BMMs) 可以通過分泌細胞因子和外泌體來調節骨代謝,在維持骨穩態方面起到重要作用[18],常與血管形成相結合,血管內皮細胞 (endothelial cell,EC) 分泌外泌體(endothelial cell-secreted exosomes,EC-Exos),可以被BMMs內化,在體外抑制破骨細胞活性。如:microRNA-155(miR-155)是特異性miRNA前體,破壞BMMs的分化和激活,抑制破骨細胞的分化[19]。BMMs內化大量EC-Exos,EC-Exos通過向BMMs遞送miR-155來抑制破骨細胞骨吸收[20]。

2.4 成骨細胞和破骨細胞

成骨細胞(osteoblast,OB)由BMSCs分化而來,負責骨基質的合成、分泌和礦化[21]。其分化和增殖是通過Runx2轉錄因子[22]、骨保護素 (osteoprotegerin,OPG)/RANKL通路和經典的Wnt信號通路等傳導途徑發揮重要作用。OB產生羥基磷灰石-骨礦物質,形成致密的礦化組織-礦化基質,是維持生理穩態的重要礦物質。OB通過釋放RANKL等分泌物參與破骨細胞(osteoclast,OC)的調節[23]:RANKL與在OC前體上表達的NF-κB的受體激活劑(receptor activator of nuclear factor kB,RANK)之間產生相互作用,誘導OC前體分化為OC。同時,OB還可以通過產生OPG來調節OC的形成,OPG通過與RANKL競爭性結合RANK抑制OC生成[24]。OC由多核巨噬細胞組成,負責骨的吸收。其形成和功能均受巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL的調節[25]。OC釋放組織蛋白酶K,切割處理膠原蛋白基質,溶解、吸收骨基質以及骨礦物質,將礦物質降解以鈣離子的形式排到血液中[26]。

OB與OC有助于維持和修復骨量,兩者形成動態平衡穩態,當一者功能異常,臨床出現生長發育障礙、骨骼畸形、骨折不愈合、骨質疏松等。在骨骼成長及代謝更新過程中,OB和OC作用相反、相輔相成[27]。

2.5 “髓變先于骨變”中腎臟的作用

同樣,髓與骨的變化也反作用于腎臟,如:Klotho-成纖維細胞生長因子23(fibroblast growth factor,FGF23)系統在慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)中礦物質和骨代謝的改變中起著至關重要的作用[28]。細胞分泌的骨鈣素與CKD、糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)的發病密切相關,骨硬化蛋白由骨細胞分泌產生并發揮作用。以上作為細胞產生的分泌物,被認為是髓的一部分,既導致了骨質的改變,又作用于腎臟的代謝,參與腎性骨營養不良的過程。

2.5.1機體磷酸鹽穩態與FGF23因子:大多數循環FGF23來自骨細胞和OB。在Klotho-FGF23系統中,腎臟上分布了大部分的Klotho蛋白和FGF23受體,因此腎臟是Klotho-FGF23系統中發揮FGF23作用的主要靶器官[29]。研究表明,FGF23的循環隨著腎功能的下降而急劇上升,并且在CKD患者異常礦物質代謝的發展中起關鍵的起始作用[30]。輕度CKD中,FGF23似乎起著保護因子的作用,因為它觸發了適應性變化維持正常磷酸鹽血癥。機體的磷酸鹽穩態是一個復雜的激素過程,涉及多個器官,包括腸、腎、骨和甲狀旁腺等[31]。FGF23可通過增加尿磷酸鹽排泄調控腎臟的代謝功能[32]。

2.5.2骨鈣素:骨鈣素(osteocalcin)是一種由成熟OB表達的特異性分泌蛋白[33]。骨鈣素的升高是CKD患者骨量減少、出現骨質病變的最敏感標志。同時,骨鈣素的血漿水平與胰島素敏感性呈正相關,較低的骨鈣素水平與糖尿病和DKD的發病風險增加相關[34]。然而迄今,從一些小樣本橫斷面研究中得出的關于骨鈣素和DKD關聯的一些結論仍然存在爭議[35]。

2.5.3骨硬化蛋白:骨硬化蛋白(sclerostin)是一種由骨細胞產生的旁分泌糖蛋白,主要由成熟的骨細胞表達,是Wnt信號傳導的骨形成的負調節劑,以及骨表面OB和OC的活性調節劑[36]。硬化蛋白通過占據Wnt共感受器LRP5/6和阻止其與Wnt配體的結合來拮抗Wnt信號傳導,從而抑制下游經典Wnt信號傳導,抑制成骨分化和OB活性,高水平的表達可以顯著抑制CKD-MBD患者的骨生成[37]。此外研究表明硬化蛋白可以通過對近端小管細胞的直接作用和通過FGF23間接調節活化的維生素D[1,25(OH)2D3]的合成,調節能量平衡和腎臟中的礦物質代謝[38]。

3 “髓變先于骨變”在臨床疾病發展中的動態表現

“功能腎”是下丘腦-垂體-多個靶腺系統的體現,分泌性激素等及其他物質,與髓、骨關系密切,而現代研究表明“腎虛證”是一種“功能腎”系統紊亂影響代謝、全身生理功能減退的一種機體反應狀態[39]。BMSCs來自于髓,在特定情況下向OB轉化率降低導致骨質疏松癥(osteoporosis,OP)的形成[40],除此如非創傷性股骨頭壞死(nontraumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH)[41]、骨關節炎(osteoarthritis,OA)[42]等骨科疾病也與“髓變”有著密不可分的聯系(圖1)。

3.1 骨質疏松癥

骨質疏松癥是常見骨病,分為原發性和繼發性。原發性骨質疏松癥是隨著年齡增長發生的一種生理退行性病變,又可分為絕經后骨質疏松癥(I型)和老年性骨質疏松癥(Ⅱ型),分別是由于雌激素減少導致骨吸收大于骨形成及人體衰老后單位體積骨量低于正常值造成的[43]。繼發性骨質疏松癥是除了與年齡相關、性腺功能減退的骨丟失外,人體自身循環代謝異常引起的骨質疏松[44]。其機制包括慢性炎癥導致高水平的OC刺激細胞因子、體重減輕伴合成代謝激素量減少等。糖皮質激素主要通過OB和骨細胞凋亡導致骨形成減少而引起骨丟失[45]。其與“功能腎”系統分泌的性激素等物質密切相關。這些因素在長時間內都是被學者們一直所研究的。

新的研究表明,年齡相關的DNA損傷,會減少骨細胞的產生[46]。BMSCs在老化過程中相關DNA損傷,使得它們更有可能轉化為脂肪細胞而不是OB,也會導致BMSCs表達p53蛋白,這種蛋白質可以阻止其分化成為OB。

3.2 骨關節炎

骨關節炎屬中醫學“痹癥”范疇。其關節退化的發病機理還不完全清楚,但是導致合成代謝和分解代謝之間不平衡的低度炎癥是一個公認因素。BMSCs可以定向分化為軟骨細胞并可調控軟骨細胞的代謝。軟骨細胞對微環境的反應來維持細胞外基質(extracellular matrix,ECM)合成和降解之間的平衡。基質降解酶的表達增加、基質合成抑制和促炎介質的過量產生,造成ECM成分丟失,在耗盡區域中擴張的軟骨細胞聚集,細胞環境中誘導氧化,發生軟骨細胞凋亡[47];軟骨細胞退變,炎癥細胞因子上調T淋巴細胞發生免疫反應,阻礙骨吸收,加重軟骨退化[48]。另外“痹癥”還包括類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA),有研究顯示其是由于“功能腎”下丘腦-垂體-腎上腺軸失調導致,“髓變”引起了機體免疫力、應激反應等變化,最終造成炎癥反應及自身免疫疾病[49]。

3.3 非創傷性股骨頭壞死

中醫“髓”與BMSCs及組織微環境高度相似,而非創傷性股骨頭壞死(nontraumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH)發病機制與“髓”狀態改變密不可分,如脂質代謝紊亂、凝血機制紊亂、骨內壓增高等狀態[41]。長期大劑量使用類固醇激素,引起脂肪代謝紊亂,抑制BMSCs的成骨分化,促進更多的向脂肪細胞轉化。此外,激素可誘導細胞凋亡,延長OC的存活期,造成股骨頭的塌陷壞死[50]。同時研究發現,還可由miR-132-3p和miR-335等外泌體通過Wnt、Foxo和Rap1信號通路誘導內皮細胞凋亡,在激素誘導的ONFH中發揮重要作用[51]。

綜上臨床與科研上的長期深究,印證了“髓變”與“骨變”是存在順序的動態改變,“髓變先于骨變”,并且其過程與“功能腎”的病變息息相關。

4 生理狀態下腎-髓-骨調節機制

腎臟與髓、骨的關系高度復雜且密切。正常生理狀態下腎對二者的指導調控作用體現在電解質離子、蛋白質分子的穩態調控。腎臟是參與調節鈣、磷酸鹽穩態的主要器官,腎臟合成的許多物質,例如1,25(OH)2D3、骨形態發生蛋白7和促紅細胞生成素,都參與了骨形成、重塑和修復的不同階段。一些可受腎臟影響的細胞因子也為髓、骨的正常生理活動提供物質基礎[52]。同時,腎臟的重吸收作用,供給髓內細胞的分化調控功能,吸收必要元素供給骨正常生理活動。

4.1 鈣、磷酸鹽穩態

腎臟通過調節鈣和磷酸鹽的穩態來影響骨骼的結構和功能。腎臟過濾的鈣和磷酸鹽在腎小管不同部位被重吸收[53]。鈣直接刺激OB的形成,同時抑制OC通過鈣敏感受體形成[54]。磷酸鹽可以通過NF-κB (RANK)-(RANKL) 信號傳導和OPG的受體激活劑,直接促進OC凋亡并抑制其分化[55]。

在循環中,鈣和磷酸鹽的吸收與重吸收,主要是受1,25(OH)2D3通過增加其轉運蛋白在腎小管細胞中的表達來發揮作用[56]。1,25(OH)2D3是維生素D的一種激活形式,通過結合腸、腎和骨中的維生素D受體來調節鈣和磷酸鹽的穩態以及骨骼的發育和修復[57]。在OB中,1,25(OH)2D3影響膠原蛋白I的合成以及堿性磷酸酶等表達,刺激骨基質礦化,促進骨鹽沉積、骨形成鈣化[58]。在OC中,起到雙向作用:一方面,它通過增加軟骨細胞和OC上RANKL的表達來刺激OC生成[59];另一方面,在OC前體中,1,25(OH)2D3通過下調集落刺激因子-1受體直接抑制RANK的表達[60]。

4.2 骨形態發生蛋白7和促紅細胞生成素

骨形態發生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)主要合成部位是腎臟,參與骨的形成與生長過程,對骨骼的生長發育起到一定的促進作用。BMP-7的表達可以促進骨質的改善和骨折的愈合[61]。BMP-7在腎臟內產生后,不斷被釋放到體內循環系統,參與人體內循環,以激素樣方式在遠端發揮作用[62]。

而人體大部分全身性促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是由腎小管周圍間質成纖維細胞在腎皮質和腎外髓質中的腎促紅細胞生成細胞產生的[63]。EPO可以通過JAK2/Stat3信號通路增加造血干細胞的BMP2表達,誘導體外OB從BMSCs分化和體內骨形成[64]。其在骨形成、骨折愈合之中起著重要的促進作用。

5 病理狀態下腎-髓-骨調節機制

腎、髓、骨三者形成整體調節機制,一者出現功能障礙則整體代謝過程改變,導致機體出現異常表現。CKD是一種復雜的多因素疾病,在慢性腎臟病的過程中,CKD-MBD伴生化和激素的改變是其病程進展相關并發癥的一部分,同時隨著糖尿病的患病率不斷提升,DKD也逐漸成為CKD的主要病因之一,DKD合并骨質疏松癥更是現代醫學研究的重點。

慢性腎臟病-礦物質和骨異常(CKD-MBD)包括:鈣、磷、甲狀旁腺素(PTH)或維生素D的異常; 骨轉換、骨礦化、體積、線性生長或強度的異常;血管或其他軟組織鈣化[65]。腎臟疾病是骨質下降的重要因素,骨質疏松癥、骨折等疾病的風險與腎臟功能下降之間也存在著正比關系[66]。CKD-MBD導致骨質疏松癥的形成,控制鈣和磷酸鹽代謝的經典激素在3～4級CKD期間變得異常: PTH增加,1,25-二羥基膽鈣化醇減少。其他激素在早期階段變得異常,包括FGF23以及主要來自腎臟的Klotho。它們相互關聯并且涉及OB發育所必需的Wnt信號通路[67]。

目前的多數研究將DKD合并骨質疏松癥歸于CKD-MBD的范疇[68],但是與其他CKD導致的骨質疏松不同的是,在糖尿病患者中,腎臟未出現損害時,胰島素的缺乏、飲食的限制及體內分泌物質等的變化也可以導致骨質疏松的發生[69]。

上述疾病在腎臟發生病變后,腎臟代謝和重吸收功能異常,髓內分泌物產生異常,導致骨質出現異常表現,符合“腎-髓-骨整體調節機制”理論范疇。

6 構建中醫“腎主骨”理論指導下“髓變先于骨變”的腎-髓-骨整體調節機制的臨床意義

“腎主骨生髓”是中醫經典理論,也是與現代醫學研究相吻合的正確理論。迄今為止,“髓變先于骨變”論點是王海彬教授團隊在長期探究中首次提出的。在臨床上,本團隊收集各類骨病患者臨床樣本,運用“補腎填髓強骨法”遣方用藥,探究髓變與骨變的內在聯系;在科研上,本團隊利用先進技術,圍繞骨髓微環境、骨髓間充質干細胞、成骨破骨細胞進行持續研究,由此發現BMSCs介導的骨脂代謝失衡在骨質疏松癥發病的過程中具有關鍵作用,如何尋求調控骨脂平衡的新切入點已經成為抗骨質疏松癥亟待解決的問題。因此,本研究團隊突破性地提出“髓變先于骨變”這一論點,為治療骨病提供一種嶄新的思路-“治骨先治髓、髓充骨自強”。該論點的提出將有助于揭開更多組織、器官、系統之間的潛在聯系,為進一步研究腎、髓、骨整體指明研究方向。該理論體系的構建發揮了中醫學臨床特點,對骨病進行中醫系統化診察;同時包融現代醫學,在“腎主骨”的中醫理論指導下,利用分子生物學論證“髓變先于骨變”的腎-髓-骨整體調節機制,為中醫學的現代化發展做出表率。