骨質疏松癥中lncRNA可調控的骨代謝相關因子

余子維 陳劍峰 鄧喬松 李冠莘 張楠

南京中醫藥大學無錫附屬醫院,江蘇 無錫 214000

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是由于骨代謝失衡導致的骨吸收大于骨形成、進而使骨的脆性增加而易引起骨折的一種疾病。我國40歲及以上人群中男性的骨質疏松癥患病率為5.0 %,女性為20.6 %,同時具有女性患病率遠高于男性、50歲及以上人群的患病率遠高于其他年齡段、絕經后婦女的患病率遠高于絕經前婦女等特點,尤其對于絕經后婦女而言,骨折的風險大大增加,需要盡早進行預防和治療[1-2]。許多危險因素都可以導致骨密度的降低,例如內分泌疾病(糖尿病)、胃腸道疾病(炎癥性腸病)和風濕性疾病等。此外,一些藥物也能夠導致骨質丟失,如免疫抑制劑、糖皮質激素和抗驚厥藥等[3]。目前抗骨質疏松藥物主要包括抗重塑藥物、骨合成代謝藥物兩大類。這些藥物可維持或改善骨密度并降低骨折風險,然而接受這些藥物治療的患者可能會出現嚴重的副作用。例如,長期使用雙膦酸鹽會增加兩種罕見危害的風險:非典型股骨骨折和頜骨壞死,雌激素-孕激素增加了未指明的骨質疏松癥或骨質減少狀態的女性患心血管疾病和認知障礙的風險,也增加了浸潤性乳腺癌的風險[4]。此外,患者對于藥物治療的依從性和持續性的不理想亦會導致骨折風險的增加[5]。因此,迫切需要為骨質疏松癥的治療尋找新的靶點。

非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一類不具有編碼蛋白質能力的RNA,主要包括小非編碼RNA如miRNA、siRNA、circRNA等以及長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。其中LncRNA的長度大于200個核苷酸,雖然lncRNA不編碼蛋白質,但lncRNA生物學的某些方面與mRNA相似。大多數lncRNA由RNA聚合酶II(Pol II)轉錄,并通過聚腺苷酸化穩定,而非聚腺苷酸化的lncRNA可以通過二級結構穩定,例如3'末端的三螺旋結構[6]。有研究表明lncRNA在表觀遺傳修飾和基因調控中發揮著重要作用,具有調節多種生理和病理過程的能力[7],因此近年來出現了許多有關lncRNA的心血管疾病、自身免疫性疾病、癌癥以及神經退行性疾病的研究。此外,有研究證明,絕經后骨質疏松癥患者(OP組)與健康對照組(NC組)相比,有70種lncRNA存在表達差異[8],因此LncRNA可能為治療骨質疏松癥的潛在靶點。

1 lncRNA與骨保護素

骨保護素(osteoprotegerin,OPG)是由成骨細胞(osteoblast,OB)產生的分泌型糖蛋白,主要通過OPG/RANK/RANKL系統影響骨代謝。此信號傳導通路發現于破骨細胞的分化過程,主要作用機制是OPG與RANK競爭性的結合RANKL,阻隔RANK與RANKL之間的結合,從而延緩破骨細胞的分化,抑制骨吸收[9]。

LncRNA H19在肝癌細胞中過表達可增強其在體外誘導破骨細胞成熟的能力,促進其在體內發生骨轉移。黃昭[10]在研究中發現H19調控的基因主要位于MAPK信號通路。過表達H19的細胞及對應小鼠骨轉移灶中,p-p38及其下游效應蛋白表達水平降低,OPG表達水平下調,敲低H19則表達水平升高。在敲低H19的細胞中抑制p38 MAPK信號通路后,OPG表達水平下調。同時,回復因敲低引起的p-p38上調后,OPG表達水平提高。因此H19可以通過介導p38 MAPK通路的失活來抑制OPG的表達。近幾年有更多的研究表明OPG的甲基化狀態可能是骨質疏松癥發病的重要因素之一[11],Yu等[12]研究發現lncRNA SNHG1能夠通過影響OPG的甲基化狀態來抑制OPG的表達。過表達lncRNA SNHG1對OPG的表達有明顯的抑制作用,而沉默SNHG1則增強了OPG的表達。此外,用DNA脫甲基劑5-Aza處理骨髓間充質干細胞(BMSC)增加了OPG的表達水平,抑制了OPG的甲基化,而SNHG1的過表達則消除了這些影響。為了進一步證實這一結論,又研究了lncRNA SNHG1在體內骨質疏松癥小鼠模型中的影響。轉染sh-SNHG1(沉默SNHG1)可明顯改善雙側卵巢切除術(OVX)組的骨質疏松變化,而與sh-OPG(沉默OPG)共同轉染則部分逆轉了SNHG1沉默的效果。因此,lncRNA SNHG1能夠增強OPG的甲基化,從而下調OPG的表達。

激素類藥物治療能夠抑制BMSC的增殖[13],Fu等[14]研究發現LncRNA NORAD在股骨頭壞死(SONFH)組織和地塞米松(Dex)處理的骨髓間充質干細胞中表達下調,而miR-26a-5p表達上調。通過RT-qPCR發現,敲低NORAD后,檢測到OPG表達水平降低,RANK、RANKL表達水平升高。NORAD過表達后,OPG表達量增加,RANK和RANKL表達量減少,而轉染miR-26a-5p模擬物則明顯抑制了這些影響。此外,NORAD的過表達使細胞增殖能力增強,細胞凋亡受到抑制,而miR-26a-5p的過表達則削弱了這些效應,因此lncRNA NORAD能夠通過調控miR-26a-5p影響OPG的分泌。

2 lncRNA與骨特異性堿性磷酸酶

骨特異性堿性磷酸酶(bone specific alkaline phosphatase,BALP)是非特異型堿性磷酸酶的一種亞型,由成骨細胞分泌的一種細胞外酶,主要在成骨過程中水解磷酸酯,促進沉積羥基磷灰石并水解焦磷酸鹽,解除對骨礦物質形成的抑制作用,有利于骨形成。因此,BALP是反應成骨細胞活性和骨形成的特異性指標,其濃度反映了骨代謝的總體情況[15]。

lncRNA H19在骨和軟骨發育中起著重要作用,可導致軟骨細胞外基質降解,能夠用作評估骨關節炎(OA)進展和預后的診斷[16],Zhou等[17]研究發現lncRNA H19在骨關節炎患者的外周血表達量顯著高于對照組,這提示lncRNA H19可能與骨關節炎的發生有關。此外,Pearson相關性分析顯示,lncRNA H19與骨關節炎患者中骨代謝指標Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)、骨鈣素N端中分子片段(N-MID)、骨鈣素(BGP)和BALP呈負相關。其他研究報告了miR-141可以通過調節lncRNA H19和其靶基因miR-675來調節成骨細胞的增殖[18],因此猜測BALP的分泌可能與miR-141/lncRNA H19/miR-675通路有關。Pan等[19]的研究采用qRT-PCR定量檢測發現lncRNA HAGLR在骨折組織中下調。敲低HAGLR降低了小鼠成骨細胞(MC3T3-E1)的增殖,提高了凋亡率,下調了BALP、骨鈣素以及轉化生長因子β受體2(TGFBR2)的表達。Yang等[20]研究發現OP模型組的血清雌二醇(E2)水平比lncRNA p21組顯著下降,血清骨形成標志物[BGP、Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)和BALP]模型組顯著高于lncRNAp21組,然而模型組中Wnt/β-catenin信號通路[21](一種成骨細胞通路,活化后能夠上調BALP活性的表達)的表達水平顯著低于lncRNAp21組。因此,lncRNAp21能夠通過增加E2分泌激活Wnt/β-catenin信號通路,最終刺激模型組的成骨分化,促進分泌BALP。Shen等[22]研究發現骨質疏松癥大鼠股骨組織中lncRNA NEF、ALP表達水平低于正常組,抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP)、組織蛋白酶K(CTSK)表達水平高于正常組。Pearson相關分析顯示lncRNA NEF與骨質疏松大鼠的ALP表達呈正相關,與TARP、CTSK呈負相關性。此外,與陰性對照組相比,感染敲低LncRNA NEF的慢病毒細胞的ALP活性與LncRNA NEF水平均降低。因此,lncRNA可能通過調控ALP的表達,參與成骨分化的過程。

3 lncRNA與腫瘤壞死因子α

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)有α和β兩種亞型。TNF-β激活凋亡和炎癥信號與TNF-α相似,通過淋巴毒素-β(LTβR)受體發出信號,并激活典型和非典型的NF-κB信號。LTβR通過刺激NF-κB途徑在炎癥、淋巴器官形成以及保留B和T淋巴細胞的結構和分區中發揮重要作用[23]。TNF-α是破骨細胞的重要調節因子,可以參與骨骼系統和免疫系統代謝。TNF-α可以促進破骨祖細胞的分化以及破骨細胞前體細胞的有絲分裂,刺激破骨細胞增殖[24],增強破骨細胞的形成與活性。在病理性骨缺失如絕經后骨質疏松、慢性炎癥引起的骨吸收組織中,TNF-α濃度均有提高,說明TNF-α是調節骨代謝的重要因子[25]。

LncRNA在絕經后骨質疏松癥(POP)中起著重要的關鍵作用,Yu等[26]的研究通過隨訪POP患者發現,lncRNA CASC11和TNF-α的血漿水平在POP患者中顯著上調,此外在破骨細胞中過表達CASC11后,TNF-α上調,POP患者接受治療后CASC11和TNF-α的血漿水平下降。因此,lncRNA CASC11可通過上調TNF-α促進骨吸收并推動POP的發展,但具體調控的分子機制尚不清楚,缺乏體內實驗去進一步證明它們之間的作用。TNF-α可通過激活MAPK/NFATc1通路誘導破骨細胞的分化和成熟[27],Zhu等[28]研究發現miR-454-3p在293 T細胞中被敲低后,lncRNA MEG8和TNF-α的表達水平顯著增加,MEG8在293 T細胞中過表達后,miR-454-3p的表達量下降,TNF-α的表達量升高,促進小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)細胞破壞骨骼。因此,lncRNA MEG8/miR-454-3p靶向TNF-α形成調控網絡促進骨破壞。Hippo/YAP通路是成骨細胞分化的重要信號通路之一,TNF-α可以通過調節Hippo/YAP信號通路影響BMSC的成骨分化[29],Han等[30]研究發現TNF-α濃度越高,小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)增殖率越低,lncRNA TUG1的表達水平越低,而過表達lncRNA TUG1后能夠逆轉TNF-α對MC3T3-E1細胞的凋亡作用,抑制Hippo/YAP通路活性,促進成骨分化,但敲低TUG1則減弱了這些效果。因此,可以確定lncRNA TUG1能夠改善TNF-α對成骨分化的抑制作用,但這兩者之間的調控作用還不清晰,需要進一步探索。

4 lncRNA與轉化生長因子β

轉化生長因子β(transforming growth factor,TGF-β)是能夠刺激細胞表型發生轉化的生長因子,是參與骨形成和骨修復的重要調節因子。在骨組織中,TGF-β廣泛存在,是參與骨代謝的重要細胞因子,能夠刺激成骨細胞的增殖和分化,促進骨形成,而對破骨細胞具有促進和抑制的雙重作用。TGF-β還可影響膠原合成,參與調節骨和軟骨形成,促進骨修復[24]。當血中TGF-β濃度下降時,可誘發骨質疏松癥等代謝性骨病,而在癌癥的骨轉移過程中,TGF-β卻能夠促進大量破骨細胞成熟,導致骨溶解,形成骨質破壞。

lncRNA-SOX2OT在促進骨轉移(BoM)中起著至關重要的作用,Ni等[31]研究發現用敲低lncRNA-SOX2OT的外泌體誘導處理后,RAW264.7細胞中TGF-β的表達水平降低,過表達lncRNA-SOX2OT后,細胞中則觀察到相反的結果。此外,BoM的特征是通過調節TGF-β/pTHrP/RANKL信號通路導致破骨細胞異常分化和功能障礙。因此,lncRNA-SOX2OT可以通過調節破骨細胞中的TGF-β/pTHrP/RANKL信號通路來調節破骨細胞分化并刺激BoM。在癌癥的骨轉移中,轉移到骨骼的癌細胞由TGF-β信號驅動,這可能導致異常的骨重塑過程,Lang等[32]研究發現在lncRNA PCAT7高表達樣本中TGF-β信號傳導也顯著富集,PCAT7過表達和miR-324-5p敲低均有效增強TGF-β信號傳導的熒光素酶活性,而敲低PCAT7或miR-324-5p過表達均抑制其活性。此外,miR-324-5p模擬物能夠逆轉過表達PCAT7促進TGF-β活性的作用,且敲低PCAT7導致TGF-β活性減弱的作用,能夠被miR-324-5p抑制解除。因此,認為PCAT7通過抑制miR-324-5p激活TGF-β信號促進骨轉移。骨髓間充質干細胞(BMSC)是多潛能干細胞,在一定條件下可以分化成各種細胞,其增殖和凋亡的調控是影響骨質疏松的關鍵因素之一[33],Li等[34]研究發現敲低lncRNA RAD51-AS1促進了BMSC細胞凋亡,減弱細胞活力和成骨分化,而過表達RAD51-AS1則起到了相反的作用。此外,敲除RAD51-AS1后,SMAD7和SMURF2蛋白水平明顯增加,然而,RAD51-AS1的過表達則出現相反的效果。在機制上,有研究發現SMURF2能與SMAD7結合形成E3(泛素-蛋白質連接酶),針對TGF-β受體進行降解以抑制TGF-β通路[35]。因此,lncRNA RAD51-AS1能夠通過SMAD7和SMURF2激活TGF-β信號通路進而促進BMSC的細胞增殖和成骨分化。

5 lncRNA與白細胞介素

白細胞介素(interleukin,IL)是由多種細胞產生的、具有重要調節作用的一類細胞因子,在傳遞信息、激活與調節免疫細胞,介導T、B細胞活化、增殖與分化及參與炎癥反應中起到重要作用。其中IL-1和IL-6都屬于細胞因子家族成員之一。大多數的有核細胞皆可以產生IL-1,IL-6可由內皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞和T細胞等合成。IL-1和IL-6可以促進破骨細胞增殖與分化,加強骨吸收、抑制成骨細胞活性、破壞骨形成,最終導致骨代謝失衡、骨密度下降,誘發骨質疏松[36]。

有研究表明,癌細胞分泌的因子會影響骨細胞的生長和分化,而骨微環境分泌的因子會促進癌癥向骨轉移[37],Aimy Sebastian等[38]研究發現將溶骨性前列腺癌細胞系(PC3)與WT成骨細胞共培養,可使PC3細胞中與癌癥相關的lncRNA MALAT1上調,與單獨的PC3相比,MALAT1在與WT成骨細胞共培養的前列腺癌細胞中被上調,這表明成骨細胞分泌的因子會上調MALAT1。另外,由成骨細胞分泌的因子已被證明在調節癌癥向骨轉移方面起著重要作用[39],而IL-6是成骨細胞分泌的因子且在成骨細胞共培養中出現了差異性表達。因此,IL-6的分泌可能影響到lncRNA MALAT1的表達。Gao等[40]研究發現RANKL能夠促進小鼠巨噬細胞RAW264.7分化為破骨細胞,但IL-10削弱了這一作用,同時破骨細胞的標志物表達水平下降,表明IL-10可以抑制巨噬細胞向破骨細胞的分化。在RANKL誘導RAW264.7后,lncRNA MEG3的表達升高,然而,IL-10的添加削弱了這個效果,通過檢測發現IL-10的添加增加了細胞中MEG3的甲基化水平,抑制MEG3表達。此外,敲低MEG3,破骨細胞標志物水平顯著降低。因此,IL-10可能通過lncRNA MEG3抑制破骨細胞分化,從而抑制骨溶解。

除上述五個和骨質疏松相關的因子能夠被lncRNA調控外,還有甲狀旁腺素(PTH)、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽(CTX)、胰島素樣生長因子(IGF)等,能夠被lncRNA GAS5[41]、lncRNA HHIP-AS1[42]、lncRNA BCAR4[43]、lncRNA AC132 217.4[44]、lncRNA PCAT6[45]等長鏈非編碼RNA所調控。

6 小結

綜上所述,許多lncRNA可以通過不同的信號通路影響與骨形成和骨吸收相關因子的分泌。目前,研究中發現最多的lncRNA有H19、HAGLR、NORAD、MALAT1和DANCR可通過充當內源性miRNA海綿來調節基因表達。此外,一些lncRNA,如lncRNA TUG1、lncRNA TUG1、lncRNA RAD51-AS1也可以通過調控Wnt/β-catenin、Hippo/YAP、TGF-β信號通路來影響骨代謝。然而,對于骨質疏松癥相關領域的lncRNA研究仍處于初期,在未來的研究中,仍有許多問題亟待解決。盡管本綜述概括了lncRNA調控的相關因子,但大多數lncRNA的作用機制尚未得到完整研究,且研究僅進行了體外實驗,并沒有進行骨質疏松動物模型的體內驗證實驗。因此,需要進一步研究lncRNA對OP相關因子調控的具體作用機制。其次,目前已知lncRNA能夠調控的OP相關因子的種類較少,僅僅只有一小部分。因此,研究人員應加大對lncRNA其他相關因子的研究。