特異性促炎癥消退介質在骨病治療中的研究進展

馬成 謝興文 李寧 閆文 高亞雄 高亞偉

1.甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730000

2.甘肅中醫藥大學附屬醫院,甘肅 蘭州 730099

骨骼是一個獨特的器官,它不斷地進行骨重塑,為身體提供支持。負責成骨的成骨細胞和參與骨吸收的破骨細胞的協同作用對維持骨內穩態至關重要。炎癥是組織對有害刺激的保護性反應,炎癥的產生在一定程度上是有益的,可以將免疫細胞招募到組織損傷或感染的部位,引導有害刺激的移除和愈合過程的啟動[1]。炎癥不能及時消退則會導致局部或全身性炎癥慢性化,各種應激源引起的慢性炎癥可通過分泌各種炎癥細胞因子,激活骨微環境,破壞成骨細胞和破骨細胞之間的微妙平衡[2],從而引起和加重各種嚴重疾病[3]。許多骨病中長期伴隨的慢性炎癥會導致骨吸收并影響骨骼健康,包括骨質疏松癥(osteoporosis, OP)、類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)和牙周炎[3]。隨著慢性炎癥性疾病的治療方法從“抗炎”向“消炎”轉變[4],在促進慢性炎癥消退的過程中,參與促進炎癥消退的分子是否也有助于骨病的緩解或逆轉是值得思考的問題[5],以解決慢性炎癥為切入點或許能為骨病的治療提供新的機會。特異性促炎癥消退介質(specialized pro-resolving mediators, SPMs)是一類多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)的脂類代謝產物,目前較多研究[4,6]證明,SPMs可以促進炎癥消退和組織的再生,清除微生物,并通過特定的細胞和分子機制減輕疼痛,因此考慮通過SPMs控制慢性炎癥來治療骨病是一個可實現的目標。

1 慢性炎癥對骨骼的破壞

炎癥的觸發因素目前尚不清楚,但是許多內源性和外源性因素導致了炎癥過程[7]。炎癥是一把雙刃劍,它是免疫監視和宿主防御的重要組成部分,在骨骼急性損傷(例如骨折)的情況下,會引發重要的局部炎癥反應,有利于損傷部位的恢復。然而,如果這種適應性反應持續時間長、程度低、癥狀少(如慢性炎癥性疾病),反而會阻礙損傷的恢復,并導致負鈣平衡、骨丟失和骨質疏松[8]。成骨細胞、骨細胞和軟骨細胞在骨骼發育和修復過程中形成骨和軟骨,而破骨細胞則介導骨吸收。在正常的生理條件下,骨基質的合成和破骨細胞引起的骨吸收之間的平衡可以維持骨的平衡。但是骨骼系統對慢性炎癥非常敏感,在存在促炎癥細胞因子的情況下,骨形成滯后于骨吸收。不同慢性骨病中骨丟失機制的相似之處可能與炎癥細胞有關[9],在持續的慢性炎癥中,免疫系統的長時間激活和相互作用導致骨破壞性自身免疫疾病,如RA和OP[10]。先天免疫系統激活產生的炎癥信號使免疫細胞募集[11],導致促炎癥細胞因子釋放,促進了破骨細胞的形成和活動,對成骨細胞的存活產生不利影響[12]。其特點是中性粒細胞、巨噬細胞和T細胞對受影響組織的慢性浸潤,隨后破骨細胞被激活,骨轉換加速,最終導致骨質流失[13]。過往研究[14]已多次提出在OP中建立全身性、慢性、低水平炎癥作為其發病機制的一部分。在包括牙周炎和RA在內的骨骼疾病中,持續的慢性炎癥會導致骨量和體積的損失[15],并且一直伴隨著核因子KappaB受體激活劑配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)的局部表達增加[16]。也有動物模型表明,慢性炎癥可能會抑制局部成骨細胞的骨形成[31]。

2 SPMs概述

PUFAs是哺乳動物細胞膜的主要成分,包括花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)與二十二碳五烯酸(docopentaenoic acid, DPA)。簡言之,所有SPMs的生物合成是由四種PUFAs氧化啟動的,SPMs包括四個主要的生物活性脂類家族:源自AA的脂氧素(LXA4和LXB4)、源自EPA的E系列消退素(RvE1-RvE4)、源自DHA的D系列消退素(RvD1-RvD6)、保護素(PD1和PDX)和Maresins(MaR1-MaR2)。這些脂質介質主要由組織駐留的巨噬細胞、招募的單核細胞和樹突狀細胞在局部產生,也可以由中性粒細胞、破骨細胞和血管內皮細胞產生,并通過同源的G蛋白偶聯受體發揮作用[6],產生抗炎介質、阻止白細胞浸潤、刺激非炎性單核細胞募集以及減少促炎癥細胞因子和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的分泌,誘導巨噬細胞吞噬細胞碎片,殺死和清除病原體來激活內源性炎癥消退程序,縮短炎癥消退時間,促進組織再生和愈合[18-19]。

3 SPMs促消炎的優勢

對于伴隨著慢性炎癥的骨病來說,促進炎癥消退是維持骨平衡的關鍵環節[3]。傳統的非甾體抗炎藥對骨愈合有負面作用,此外還誘發嚴重的副作用[20]。雖然目前一些抗骨質疏松藥物也具有抗炎活性,但是這種抗炎活性似乎不足以減少慢性炎癥,在服用抗骨質疏松藥物的OP患者中仍不斷檢測到全身性、慢性、低水平炎癥[21]。在這方面,糖皮質激素是最有效的抗炎藥物,但是它導致OP和骨折風險升高[22]。因此,這些藥物在促進慢性炎癥消退方面的應用是有限的。相比之下,SPMs主要被證明可以在各種炎癥性疾病的實驗模型中緩解炎癥,且沒有副作用。在炎癥與骨吸收或骨破壞同時存在的情況下,SPMs不僅有利于局部炎癥消退,也可能是一種新的骨保護因子[16]。研究結果[23]表明,RvE1在炎癥條件下影響骨重塑,這種影響部分是由于對骨細胞的直接作用,針對骨病中的慢性炎癥,SPMs是活躍的生化信號分子,促進凋亡細胞通過淋巴管清除,并恢復到平衡狀態以主動消退炎癥。同時在慢性炎癥動物模型中的研究報告[24]顯示,SPMs具有明顯的骨保護活性,從而抑制骨丟失。在這種情況下,通過無毒副作用的SPMs成功促進炎癥消退,對于減少各種慢性炎癥相關疾病的發展至關重要。在包括OP在內的慢性炎癥相關疾病的臨床前模型中,SPMs特別是消退素顯示出令人鼓舞的治療效果[23]。

4 SPMs在骨病治療中的應用

4.1 SPMs通過促消炎作用保護骨骼

4.1.1SPMs控制炎癥發展:腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)被證明直接作用于破骨細胞及其前體,與RANKL協同促進破骨細胞生成[25]。在TNF-α誘導的局部小腿骨溶解的小鼠模型中,RvE1的全身給藥降低了小腿骨的吸收率[23]。輔助性T細胞17(T helper 17cells, Th17)的激活是炎癥慢性化的關鍵步驟,白細胞介素(interleukin-, IL-)17是由Th17細胞亞群誘導的炎癥細胞因子,通過刺激RANKL的表達起到破骨的作用,并激活先天免疫系統產生促炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1和IL-6),使疾病狀況惡化[26-27]。RvE1通過抑制IL-17的表達,逆轉Th17的激活來調節炎癥的慢性化[28]。Th17/Treg的不平衡已被證實參與了RA的發病[29],RvD5強烈抑制Th17細胞分化,促進Treg細胞分化,糾正Th17/Treg細胞的失衡,減少CD4+T細胞增殖,在RA小鼠模型中起到抑制破骨細胞分化的作用[30]。在RA中,RvD1上調成纖維樣滑膜細胞中miRNA-146a-5p,同時下調miRNA-155和miRNA-181來抑制CTGF和炎癥介質的表達,減少血管翳生成和軟骨損傷,緩解RA的進展[31]。體內給予RvD1可減少膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis, CIA)小鼠模型的骨吸收并降低血清中的促炎癥介質水平(TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β、INF-γ和PGE2)[32]。RvD1還能抑制從骨關節炎患者獲得的骨關節炎成纖維樣滑膜細胞(osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes, OA-FLS)的增殖,OA-FLS分泌IL-1β,IL-1β的分泌可以觸發軟骨細胞和滑膜的炎癥,影響軟骨細胞合成基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP),包括MMP1和MMP13,進而破壞關節軟骨[33],這些結果表明,RvD1對炎性滑膜具有靶向治療作用[34]。

4.1.2SPMs增強抗炎作用:體外細胞實驗中RvD1減少破骨細胞分泌TNF-α、IL-1β、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和RANKL,并同時增強破骨細胞對IL-10(一種抗炎細胞因子)的分泌[32]。Jiang W等[35]采用生物信息學方法對從骨關節炎大鼠模型獲得的膝關節軟骨細胞進行體外研究,發現RvD1通過NF-κB、p53、MAPK、PI3K-AKT信號傳導途徑減輕骨關節炎的惡化。將一種封裝RvD1的納米脂質體制劑(Lipo-RvD1)在小鼠膝關節進行注射,已經證明能夠增加滑膜中M2巨噬細胞的比例,促進炎癥的消退,減輕小鼠骨關節炎模型中不斷發展的軟骨損傷[36]。

4.1.3SPMs減少ROS分泌:ROS是氧正常代謝的自然副產物,當其濃度超過一定范圍時,會干擾氧化劑-抗氧化劑的平衡,這種紊亂會導致許多炎癥疾病,如糖尿病性骨質疏松癥[37]。高糖條件誘導了ROS的產生,抑制了破骨細胞的胞吐,增強了破骨細胞的骨吸收,而胰島素和LxA4聯合治療逆轉了這一現象[38]。

4.1.4SPMs改善牙周炎癥環境:成骨和成牙的過程是相似的,牙周指標和骨密度之間有較高的相關性[39]。RvE1已被證明可以治療牙周炎,并在各種動物模型中使牙槽骨再生[40-42]。在牙周炎中,牙槽骨破壞的機制是由局部炎癥導致的,可發展為全身性、慢性、低水平炎癥[43]。牙周炎模型兔子局部注射RvE1后,與中性粒細胞過度激活相關的炎癥反應明顯減輕[44]。最近,使用大鼠牙髓損傷模型發現,RvE1促進牙髓微環境中炎癥的解決和牙本質的修復,同時增強了有或沒有脂多糖刺激的人牙髓干細胞的趨化、增殖和成牙本質能力[45]。牙髓成纖維細胞(dental pulp fibroblasts, DPFs)上存在ChemR23,在相關炎癥早期(牙髓暴露后24 h內)給予RvE1時,RvE1可以抑制DPFs的激活,抑制牙髓炎早期階段相關的牙髓炎癥[46]。此外,RvE1支持其他類型的牙齒相關干細胞(人牙周膜干細胞)在炎癥條件下的再生特性,前期逆轉了促炎的影響,改善了炎癥環境下人牙周膜干細胞的活力和遷移能力,同時在基因和蛋白水平上調成骨細胞特異性因子(OSF-2)、腱調蛋白抗體(軟骨調節素樣1蛋白)和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)[47]。體外細胞實驗驗證了人牙周膜細胞和破骨細胞前體之間的細胞間信號傳導在炎癥誘導的破骨細胞分化中的重要性,并證實了LxA4在這一過程中的抑制作用[48]。

4.2 SPMs抑制骨吸收

破骨細胞是在巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor, M-CSF)和RANKL的作用下從造血干細胞的單核細胞-巨噬細胞系中產生的,由單核前體發展而來,融合后形成多核成熟破骨細胞,從而能夠進行骨吸收[49]。除了抑制炎癥反應,RvE1還獨立和直接地抑制破骨細胞融合來減弱骨吸收,有研究[50]發現RvE1針對破骨細胞成熟的后期階段作用更明顯,特異性靶向下調破骨細胞關鍵融合蛋白樹突狀細胞-特異性跨膜蛋白(DC-STAMP),并降低轉錄因子NFATc1的DNA結合活性,限制破骨細胞融合,使破骨細胞的形成減少。有研究結果[16]表明RvE1通過干擾破骨細胞的分化來抑制破骨細胞的生長和骨吸收,在RvE1存在的情況下,破骨細胞的生長和吸收陷窩的形成明顯減少。在體外炎癥條件下,RvE1抑制了培養的小鼠破骨細胞的分化[51],并降低了破骨細胞中RANKL/OPG的比例,抑制牙周炎引起的骨吸收和組織破壞[50]。總之這里的結果表明,RvE1在體外阻斷了破骨細胞的分化和骨吸收,表明其骨保護作用與已知的促炎癥消退作用不同。RvE1阻斷破骨細胞分化、生成的作用可能是通過其同源受體BLT1和ChemR23介導的,這些受體由破骨細胞表達[50,52]。白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)是一種促炎癥的AA衍生物,已知可在體外和體內增強骨吸收,與促進破骨細胞融合有關[53]。白三烯B4受體亞型1(leukotriene B4 receptor subtype 1, BLT1)是LTB4和RvE1的受體[50,52],由于LTB4與RvE1競爭BLT1的結合,且LTB4拮抗劑U75302能阻止RvE1對破骨細胞生長的調節,表明BLT1介導了RvE1對破骨細胞的影響,可能是RvE1在破骨細胞培養中的主要作用部位[16]。作為支持,抑制BLT1的表達可以阻止RvE1促進特異性破骨細胞融合蛋白的調節,隨后在體外增加破骨細胞的生成,在該研究中,RvD1也能抑制體外破骨細胞的分化和激活[50]。同樣有體外研究證明,發現RvD1對破骨細胞的抑制與抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、組織蛋白酶K和DC-STAMP的表達有關,能顯著抑制破骨細胞分化和激活[32]。

4.3 SPMs促進骨形成

有體外研究[23]發現RvE1直接作用于成骨細胞以降低炎癥條件下升高的RANKL水平,即RvE1調節RANKL/OPG的比例,有利于骨的保存。PGE2誘導成骨細胞中RANKL的表達,而PGE2又受IL-17強烈誘導[54-55]。研究[56]顯示RvE1抑制IL-17誘導的環氧化酶2(COX-2)和膜結合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1)mRNA的表達,隨后抑制MC3T3-E1細胞中PGE2的產生,從而抑制成骨細胞中RANKL表達。研究發現LxA4增加了血清中OPG的濃度,降低了RANK/OPG比率[57]。

RvD1顯著減少大鼠顱骨缺損模型中促炎癥細胞因子IL-1和TNF-α,使M2巨噬細胞產生更多的生長因子,如BMPs和VEGF,以促進成骨和血管生成,在控制炎癥微環境、促進骨愈合和血管生成方面發揮了作用[58]。RvD1的合成類似物在大鼠急性動脈損傷后減弱了慢性炎癥導致的新內膜增生[59]。Vasconcelos等[60]用嵌入RvD1的多孔三維殼聚糖支架填充大鼠股骨缺損的愈合情況。結果表明,與對照缺損相比,RvD1可以促進骨愈合,如促進骨形成、增加骨小梁厚度和I型膠原,這些結果可能與RvD1調節植入材料炎癥反應的能力有關。

MaR1在老年小鼠中給藥后能夠對抗骨損傷后的慢性炎癥從而改善骨折的愈合[61],在這項研究中,MaR1治療降低了炎癥生物標志物的循環水平,并減少了老年小鼠骨痂內M1巨噬細胞的數量,促使巨噬細胞由促炎(M1)表型向抗炎(M2)表型轉變,Clark等[62]證明,低效愈合可能不是因為缺乏抗炎巨噬細胞,而是因為促炎表型的M1巨噬細胞過剩造成的。在老年小鼠骨折模型中,MaR1治療可促進骨再生,在另一項研究[63]中,在大鼠拔除的磨牙窩局部應用MaR1可加速傷口愈合和牙槽骨再生。LGR6是一種G蛋白偶聯受體,此前研究證明了LGR6是小鼠成骨祖細胞的標志物,并在骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)體外成骨分化過程中動態表達,具有成骨功能[64]。Lgr6在人類BMSCs和成骨細胞的體外成骨分化過程中也動態表達[65],對中國絕經后女性的定向基因測序后發現LGR6與骨質疏松有關[66]。在一項橫斷面研究中,發現與正常人相比,絕經后女性MaR1血清水平明顯降低并與OP的嚴重程度相關[67]。在體外成骨過程中,MaR1通過其同源受體LGR6發揮作用,刺激cAMP信號傳導,顯著促進了成骨祖細胞增殖,這是觸發抗骨質疏松藥物的骨同化活性的關鍵機制因素[68]。

5 小結與展望

老齡人口規模的擴大導致越來越多與慢性炎癥相關的骨骼疾病出現,如OP、RA和牙周炎。促進慢性炎癥的主動消退是一個新的方向,在傳統抗炎藥物存在不同程度的毒副作用并且療效甚微的情況下,需要確定新的干預措施。SPMs作為無毒無害的脂類化合物,近年來不斷有新的發現,在衰老、腫瘤、心血管以及代謝疾病方面有較大突破,在促進炎癥主動消退方面取得了顯著的成效。已經在各種臨床前炎癥模型中觀察到SPMs、包括其模擬物和受體激動劑在體內外對骨骼健康的有益影響。雖然目前對SPMs及其受體信號通路的認識不足,SPMs的快速失活以及它們復雜昂貴的化學合成方式限制了SPMs的應用潛力[69],但是穩定的小分子SPMs模擬物和受體激動劑已成為潛在的合適藥物,可能是一種有希望的、新穎的補充治療方法。這些化合物能夠通過明確的機制控制慢性炎癥,包括限制中性粒細胞浸潤、誘導中性粒細胞凋亡、調節促炎癥介質的表達、將巨噬細胞重新編譯為抗炎表型、誘導疼痛緩解、刺激受損組織的修復,所有這些都是炎癥消退過程的組成部分。在這些新化合物中,最有應用前景的是LxA4受體激動劑(ALX/FPR2),屬于甲酰基肽受體家族,能合成在體內穩定性較強的模擬物,在許多基于炎癥的臨床前研究包括關節炎、敗血癥、神經炎癥和慢性阻塞性肺疾病的小鼠模型中顯示出明顯的促消炎作用[3]。

盡管有越來越多人認識到慢性炎癥在骨病發病機制中的重要作用,并且觀察到慢性炎癥對骨的長期破壞,但其產生機制仍不清楚。現在的主流觀點認為雌激素水平下降、免疫系統功能紊亂和腸道菌群失調可能是導致慢性炎癥的主要原因。進一步明確它們之間的因果關系、研究慢性炎癥的產生機制是未來應該考慮的方向。