羊的胚胎移植技術要點

吳 瑛，吳 萍*

（1.畢節市畜牧獸醫科學研究所，貴州畢節 551700；2.貴州新烏蒙生態牧業發展有限公司，貴州赫章 553200）

胚胎移植運用在加速家畜的繁育進程的同時可以保證生產性能，其商業化應用已有30 年之久。羊的胚胎移植是指將供體羊進行超數排卵配種后回收早期胚胎，移植到同一品種生理狀況相近的另一只受體體內繼續妊娠產生后代羔羊的技術。該技術以“借腹懷胎”的方式，達到增加良種后代的目的，以胚胎冷凍保存的方式，對優良畜禽遺傳資源進行保護，為更好地進行遺傳資源保護和開發利用提供了技術支撐。提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的個體稱為受體[1]。胚胎移植最早應用于牛的繁育工作，羊的胚胎移植起步晚、發展慢。我國羊的胚胎移植應用始于20世紀后期，于1980 年在綿羊上首次應用成功[2]。進入21 世紀，中國農業大學[3]、內蒙古家畜改良站[4]等單位相繼報道，胚胎移植的妊娠率達56%，產羔率達46%，開啟了我國胚胎移植商業化應用的時代。近年來，關于胚胎移植在羊的生產應用中的研究增多，集中在超排處理、移植妊娠率、胚胎冷凍保存等方面，為該技術的推廣及產業化夯實了基礎。本文從供受體羊的選擇與管理、移植季節選擇、藥物和器械準備、手術方法選擇、沖胚及移植過程、胚胎冷凍保存、影響因素及應用前景等方面進行了詳細綜述，以期為開展胚胎移植實踐提供參考。

1 供受體母羊的選擇

1.1 供體母羊的選擇原則

供體羊的選擇，是開展胚胎移植應用的首要環節，影響胚胎移植的效果。在實際生產中，供體母羊受遺傳價值、健康狀況、既住繁殖史、年齡和胎次、體質體況等因素的影響，一般2～4周歲的經產母羊較為合適[5]。供體母羊要提前選擇，群體數量要大以保證有足夠的數量供選擇，確保觀察的發情周期準確，調整膘情到七成以上，不宜過肥或過瘦。若供體母羊在哺乳期內，最好是在羔羊斷奶30d 后再選擇，斷奶之后加強補飼，盡量恢復到配種體況。

1.2 受體母羊的選擇原則

對受體母羊的選擇，不需要考慮遺傳性能、種用價值等遺傳因素，但要注重健康狀況、繁殖性能等生理因素，只要符合能適應當地氣候環境、繁殖性能好、母性強、無傳染性疾病和膘情在七成以上條件即可。生產中，尤其注意要節省試驗和生產成本，盡量不選擇優質種羊。

1.3 供受體羊術前管理

供受體羊在接受胚胎移植手術前，需做好供體羊的飼養管理工作。一是要保持飼養環境穩定，避免出現較大的應激；二是要提供合理的日糧及青干草，保持一定的膘情，過度肥胖會影響發情；三是要提供清潔、衛生的飲水，保證健康，確保試驗期間羊只不生病；此外，還要做好羊群的數據登記，建立胚胎移植數據庫，做到科學、精準管理供受體羊，最好做到供受體羊群單獨飼養管理，不混群。

1.4 胚胎移植季節的選擇

研究表明，品種、光照、溫度等均能影響羊的發情周期，大部分綿羊品種為季節性發情，少數為常年發情[6]。在每年的秋季，母羊的卵巢機能開始活躍，卵泡發育成熟，表現出發情特征；在春夏冬等季節，母羊的卵巢機能基本處于靜默狀態，卵泡不發育，不表現發情和排卵[7]。因此，選擇適宜胚胎移植的季節，要根據氣候變化、羊的發情狀況等綜合考慮，最好是選擇羊的繁殖季節開展，這樣效率最高。但有時候，為了配合幼畜超排技術，加快繁育進程，則要強制在每年5 月份前后開展胚胎移植。

1.5 供體羊輸精的選擇

供體羊的輸精工作是使精卵結合形成胚胎開展后續移植工作的前提。一般而言，供體羊撤栓12h 后將試情公羊放入羊群進行試情，根據反應判斷發情情況，然后將發情母羊標記、隔離。配種可以采用兩種方式：自然交配（人工輔助交配）和人工授精。前者較為簡單，將公母羊合群后，觀察爬跨行為，登記即可，但要注意配后間隔8h 最好再復配1 次，直到母羊不接受爬跨為止。人工授精可以采用傳統人工授精或腹腔鏡人工授精技術。腹腔鏡人工授精技術是指借助腹腔鏡授精可以將精液直接送入母羊子宮角內，該方法可以克服傳統輸精方法由于母羊子宮頸管道構造特殊，精子不易通過所導致的情期受胎率低的問題，大大提高了受胎率，但最好也間隔12h 再輸精一次。

1.6 藥品及手術器械的準備

在胚胎移植工作中使用的藥物，必須保證產品可靠，有效成分含量準確，經試驗表明性能穩定，并且按照藥物運輸和保存要求的條件妥善運輸和保存[8]。主要藥物和器械分類整理如下：收卵器械包括沖卵管、腸鉗套乳注射器、膠管、帶硅膠管的16 號針頭、集卵杯、燒杯；檢卵設備包括體視顯微鏡、六孔杯、回收管、二氧化碳氣體、培養箱、帶硅膠管的7 號針頭、平底蒸發皿、顯微操作儀及附件；移植手術時還需要各種手術器械包括毛剪、外科剪、刀片、外科刀、創巾鉗、活動刀柄、手術鑷、縫合線、止血鉗、持針器、縫合針、創巾若干、手術保定架、紫外燈、高壓消毒鍋；所需藥品及試劑包括促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，FSH）和 孕馬血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、普魯卡因、腎上腺素及止血藥品、2%靜松靈、紗布、藥棉、抗生素及其他消毒液、生理鹽水等[9]。

2 超數排卵與同期發情

2.1 超數排卵原理

超數排卵是指在母羊發情周期的任一時間，對母羊注射外源激素，如FSH 和PMSG 等，使處理羊的血液中促性腺激素濃度升高，從而降低早期發育卵泡的閉鎖率，使成熟卵泡的數量增加，從而排出比自然發情情況下更多的卵細胞[10]，超數排卵是獲得大量胚胎的基礎。

2.2 超數排卵方法

目前，最常采用的超排處理方法是一是“陰道孕酮栓+PMSG+FSH”法，如郭振剛等[11]在貴乾半細毛羊上的研究表明，采取“埋置海綿孕酮栓+PMSG”法進行同期發情及遞減法注射FSH進行超數排卵處理及自然交配后，手術法在子宮角回收供體胚胎，結果10 只供體共計獲得胚胎106 枚，可利用胚胎73 枚，平均沖胚達10.60 枚/只，平均可用胚胎7.30 枚/只，胚胎合格率達68.87%，試驗結果達到國內同類研究的平均水平。其次是兩次前列腺素（Prostaglandin，PG）+FSH 法，在發情周期的任意一天，對供體羊注射第一次PG（定為第0 天），觀察記錄第2～3天的發情情況，對能夠明顯觀察到發情情況的供體母羊從第11 天開始注射FSH，每日2 次，注射劑量逐級遞減，3d 后再注射一次PG。

2.3 受體羊的同期發情

同期發情是使受體羊處于與供體羊同一生理基礎的先決條件，發情生理情況越接近，胚胎移植后的受胎率就越高[12]。如王玉琴等[13]研究，采用2～12h 的擴展囊胚進行移植，妊娠率可達94.74%。這是因為胚胎只能移植到與之發育要求相適應的受體生殖環境中，才能繼續發育。因此若要采用鮮胚進行移植，在供體超排的同時，必須對受體進行同期發情處理，使之生殖生理狀態與供體同步化。而在選擇凍胚移植時，只需考慮移植的季節性，且在秋季移植可增加妊娠率[14]。

3 供體羊手術沖胚檢胚以及受體羊的手術移植

3.1 手術

術前準備。超排前供受體母羊禁食至少24h，術前2h 禁水。

保定。使用胚胎移植手術架躺臥式保定，將四肢固定在手術架上，防止母羊手術過程中劇烈活動。

備皮處理。羊只保定麻醉后，用肥皂水浸濕乳房周邊直徑約10cm 的肚腹，用刮毛刀或刀片刮凈羊毛，注意不要劃傷皮膚，再使用毛巾擦拭干凈皮膚，最后用酒精噴灑消毒，覆蓋手術創巾，以創巾鉗固定四角，推進手術室靜待手術。

手術。手術時，在乳靜脈與腹中線之間，用手術刀切開皮膚及筋膜，倒過手術刀，以鈍頭分離腹直肌或前拉腹直肌，顯露腹股溝管處，在腹股溝管處剪開或手術刀鈍頭直接破開以顯露腹腔。切口不宜過大，否則影響縫合和愈合，也不能過小，過小不方便取出子宮而對子宮造成刺激或損失，適宜大小為1.5～2cm 寬。腹腔暴露后，伸進食指和中指在骨盆腔、膀胱周圍觸摸子宮，然后輕輕勾住子宮體，將卵巢、子宮拉出，查看黃體位置并記錄。

3.2 沖胚

沖胚方法可分為輸卵管法、沖卵管法和子宮法，生產中多采用輸卵管法和子宮法。

輸卵管沖胚法：操作時，將沖卵管一端從輸卵管傘部喇叭口插入6～8 號頭皮針，插入2～3cm 深處，打活結或用鈍圓夾子固定，另一端接集卵器，用注射器吸取37℃沖卵液5～10mL，在子宮角靠近輸卵管部位，將針頭朝輸卵管方向扎入。一人操作時，一只手的手指在針頭后方捏緊子宮角，另一只手推注射器，沖卵液由宮管結合部流入輸卵管，經輸卵管流至集卵器。此種方法的優點是卵的回收率高、沖卵液用量少、檢卵省時，缺點是容易造成輸卵管傘部粘連[15]。

子宮角沖胚法：在供體羊發情授精后6～7d采卵，將子宮暴露，用套有膠管的腸鉗夾在子宮角分叉處，用注射液吸入沖卵液20～30mL，將沖卵針頭（套管針）從子宮角尖端插入。插入時確認針頭在子宮角宮腔內，連接注射器，緩緩注入沖卵液。當子宮角膨脹時，立即將回收卵針頭從腸鉗基部的上方迅速插入，引導沖卵液收集于集卵杯內。相同方法對另一側子宮進行沖卵。進針時避免損傷血管。該法的優點是子宮角沖卵法對輸卵管損傷較小，主要用于超排母羊發情后的5.5～6d，從子宮可以收集到桑椹胚至擴展囊胚，此時的胚胎可用于移植、冷凍或其他研究等，但該方法的胚胎回收率較低。

3.3 胚胎評定

鑒別可用胚胎和不可用胚胎是進行下一步胚胎移植的關鍵，只有發育良好的胚胎才能用于移植，否則會嚴重影響移植受胎率。在收集沖胚液后，最好在20min 內將其放置在顯微鏡下觀察，同時使用檢胚細管將獲取的胚胎移入新鮮培養液中，以保持胚胎活性。通常，以胚胎形狀，分裂球大小，卵裂球變形以及均勻度與透明帶間隙等項目對胚胎質量進行分級鑒定。一般來說，可用胚胎的卵裂球輪廓清晰、球體圓滑又飽滿，而不可用胚胎表面不光滑、有毛邊且不圓。2 細胞的胚胎，卵裂球輪廓清楚、球體飽滿、透明度適中鑒定為1 級；1/3 卵裂球死亡的鑒定為2 級；1/2卵裂球死亡鑒定3 級；其余定為4 級[16]。只有1、2、3 級胚胎可用于移植。

3.4 移植

胚胎移植可采用手術法和腹腔鏡法。

手術法，在掏出子宮和卵巢后，查看黃體發育狀況，在黃體側，用鈍形針頭在子宮角穿孔，將移植管沿子宮角方向插入宮腔，注射胚胎，隨即輕輕復位子宮，縫合皮膚。胚胎移植時，原則上將來自輸卵管的胚胎移入輸卵管，來自子宮角的胚胎移入子宮角的前1/3 處。

腹腔鏡法，借助腹腔鏡找到子宮，再將胚胎移植針從另一側插入腹腔，將胚胎注射到相應位置。該方法操作簡便，但是需要一定的經驗。

3.5 縫合

創口縫合按照外科手術操作的原則進行。縫合過程中不得觸碰其他無關物品。操作時要細心、迅速，不讓子宮體長時間暴露。切忌多次、用力拉扯子宮。胚胎移植后，仔細檢查移植器中是否有胚胎遺漏，確認無遺漏后方可縫合。手術創口縫合采用兩層縫合法，縫合內肌層和皮膚，縫合肌肉層后撒適量青、鏈霉素粉，以防止創口感染，縫合皮膚后用碘酒消毒處理。

3.6 術后受體的飼養管理

胚胎移植后的受體，注意觀察并精心護理，定期查看是否返情。若發現受體發情，要做進一步的觀察和檢查。在移植后45d 左右，可采用獸用B 超進行早期妊娠診斷。對已妊娠的受體分群管理，預防流產，同時補充營養全面的飼草料，既要保證胎兒的正常發育，又要避免發育過度而引起難產。此外，還要根據當地疾病發生情況，及時接種相應疫苗，讓胎兒提前獲得免疫能力。

4 影響胚胎移植效果的因素

4.1 受體品種

受體羊選擇，在胚胎移植中具有至關重要的作用。研究表明，不同品種用作受體羊移植單胚時，妊娠率和胚胎成羔率均無差異，但是移植雙胚胎時，胚胎妊娠率和胚胎成羔率有顯著差異[17]。

4.2 移植胚胎數量

趙霞等[18]報道，移植2 枚和3 枚胚胎時山羊的妊娠率顯著高于移植1 枚的。黃承俊等[19]研究也表明，移植2、3 枚胚胎的妊娠率明顯高于移植1 枚胚胎時的妊娠率。實際生產中，應根據羊的品種、體型大小及獲得的有效胚胎數量等來確定最佳移植數量。

4.3 采胚方法

研究表明，輸卵管法平均采集可用胚數高于子宮角法，但是子宮角法采集的胚胎具有更高的妊娠率和產羔率，是理想的采胚方法[20]。腹腔鏡技術可縮短單次移植時間，減少手術損傷，利于動物健康，在加速胚胎移植的產業化應用中則更為廣泛。

5 胚胎移植技術的應用前景

作為最實用的高效繁育技術，胚胎移植可以結合優秀公羊和優秀母羊的品種優勢，同時作為人工授精技術的延伸，將在家畜品種培育和改良中得到廣泛應用。一方面，通過人工授精充分發揮良種公羊的配種能力，另一方面，胚胎移植還可以獲得優良母羊的生產性能，這對羊的高效繁育具有重要意義。隨著整個胚胎移植技術體系的不斷進步，其產業化應用也將近一步得到發展。

6 小結

羊的胚胎移植需要同期發情、超數排卵等技術支撐，同時還需要胚胎收集、鑒定和移植等技術的配合，各項技術均需規范操作，因此，該項技術需要專業人才在整個過程中跟進和監督。此外，移植的季節性選擇、羊群的飼養管理、無菌操作環境以及藥物的合理化使用等在胚胎移植過程中也起到了重要作用。

本文從供受體羊的選擇與管理、移植季節選擇、藥物和器械準備、手術方法選擇、沖胚及移植過程、胚胎冷凍保存、影響因素及應用前景等方面的進行了詳細綜述，以期為開展胚胎移植取得良好效果提供參考。