鷓鴣茶對高脂血癥痰濁阻遏證患者的降脂效果及腸道菌群的影響

卓書江， 張明， 林道斌

（海南省中醫院心血管內科，海南海口 570203）

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）是由遺傳因素、不良飲食習慣及其他疾病引起的脂質代謝紊亂性疾病[1]。其主要表現為血液總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein，LDL-C）水平升高及高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein，HDL-C）水平下降[2]。而血液中的脂質代謝異常是引發冠心病、中風及心肌梗塞的重要危險因素[3]。最近的一項《中國居民營養與慢性病狀況報告》[4]顯示，我國居民高脂血癥患病率已高達40.4%，表明高脂血癥已經成為我國日益突出的一個重要公共衛生問題。但目前臨床上的降血脂藥物長期服用具有一定的毒副作用[5-6]。因此，積極開發新型降脂藥物及藥物靶點具有很高的臨床價值。

鷓鴣茶又名山苦茶，為大戟科野桐屬植物，在海南省萬寧、瓊中、樂東等市縣廣泛分布，具有減肥、降壓之效，是海南的一種具有民族特色和地域特色的代茶飲料植物和藥用植物[7]。為了探討鷓鴣茶對高脂血癥患者的降脂效果及其對腸道菌群的影響，本課題組開展了相關臨床試驗，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 收集2021年1月至2022年1月在海南省中醫院心血管內科就診并明確診斷為高脂血癥痰濁阻遏證的40例患者作為研究對象。按就診先后順序，采用隨機數字表法將患者隨機分為試驗組和對照組，每組各20例。本研究通過海南省中醫院倫理委員會審核批準，倫理審查批號：HNSZYY-2020-LL-042。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 高脂血癥的診斷標準參照《中國成人高脂血癥防治指南（2016年修訂版）》[8]，在不改變受試者生活飲食習慣的前提下，檢測患者進食后12 h的血脂水平，1周內出現2次以上下列情況之一者，即可診斷為高脂血癥：①TG＞1.70 mmol/L；②TC＞5.18 mmol/L；③LDL-C＞3.37 mmol/L；④HDL-C＜1.04 mmol/L。

1.2.2 中醫辨證標準 痰濁阻遏證的辨證標準參照國家中醫藥管理局制定的《中醫病證診斷療效標準》[9]擬定。主癥：形體肥胖，頭重如裹，嘔惡痰涎；次癥：口淡，食少；舌脈：舌胖，苔滑膩，脈弦滑。以上主癥見1項，次癥見2項或以上者，結合舌脈表現即可確診。

1.3 納入標準 ①符合上述高脂血癥的西醫診斷標準和痰濁阻遏證的中醫辨證標準；②既往未服用降血脂藥物，或納入試驗前2周已停止服用降血脂藥物，血脂水平符合診斷標準；③年齡在18～75歲之間，性別不限；④屬于原發性高脂血癥；⑤了解本研究內容，自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1.4 排除標準 ①對試驗藥物過敏的患者；②半年內曾發生心腦血管意外和重大手術的患者；③正在使用激素或免疫抑制劑治療的患者；④因其他心腦血管疾病需要長期服用降脂藥物的患者；⑤繼發性高血脂癥及遺傳因素導致的高脂血癥患者；⑥合并有肝腎功能異常或其他嚴重疾病的患者；⑦妊娠期或哺乳期婦女；⑧因其他疾病需長期服用中藥或中成藥的患者；⑨在試驗前3個月曾使用抗生素或益生菌的患者。

1.5 剔除及脫落標準 ①治療期間私自服用其他中藥或中成藥的患者；②治療過程中出現不良反應的患者；③依從性較差，未按要求進行運動鍛煉或不能按時用藥和不配合相關檢查的患者；④研究過程中因其他突發情況需使用降脂藥物、抗生素或益生菌的患者。若患者出現以上情況而完成療程過半且采集到合格糞便標本，則計入觀察病例，否則予以剔除。

1.6 干預方法 根據《中國成人高脂血癥防治指南（2016年修訂版）》的推薦治療方式，2組患者進行有規律的慢跑運動，每次30 min，每周至少4次。4周為1個療程，共治療2個療程。試驗組在此基礎上飲用鷓鴣茶袋泡茶（藥材產于海南省萬寧市東山嶺，袋泡茶由海南省中醫院中藥房提供）治療，每日3次，每次用200 mL開水沖泡，于餐前或餐后30 min當茶飲，每次劑量為12 g。4周為1個療程，共治療2個療程。治療期間，患者保持既往飲食習慣，且禁止服用抗生素、益生菌及其他中藥和中成藥。

1.7 觀察指標及療效判定標準

1.7.1 中醫證候評分及療效判定標準 參照《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[10]，對形體肥胖、頭重如裹、嘔吐痰涎、口淡及食少等中醫證候進行分級量化評分。并根據治療前后中醫證候積分的變化情況評價2組患者的療效。中醫證候療效判定標準：顯效：中醫臨床癥狀和體征明顯改善，中醫證候積分減少≥70%；有效：中醫臨床癥狀和體征有所改善，30%≤中醫證候積分減少＜70%；無效：中醫臨床癥狀和體征無明顯改善甚至出現惡化，中醫證候積分減少＜30%。中醫證候積分減少率=（治療前積分－治療后積分）/治療前積分×100%；總有效率=（顯效例數+有效例數）/總病例數×100%。

1.7.2 體質量指數（body mass index，BMI）測定 所有患者納入研究時及干預結束后，均測量身高及體質量，并根據公式計算BMI：BMI=體質量（kg）/身高（m）2。

1.7.3 血脂指標檢測 2組患者均于治療前后各采集一次空腹8 h靜脈血，血液樣本經離心后，采用全自動生化分析儀檢測血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平，血脂指標檢測由醫院檢驗科完成。

1.7.4 腸道菌群檢測

1.7.4.1 糞便標本采集 2組患者均于治療結束后采集一份新鮮糞便標本，置于專用無菌采便管，編號后在低溫運送條件下迅速保存于-80℃冰箱中備用。為作對比，除了上述2組患者外，課題組還采集了10位在我院體檢中心體檢的健康成人的糞便標本。

1.7.4.2 糞便DNA提取 將收集的樣本采用美國MOBIO公司的MOBIOPowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒進行DNA的提取，所得DNA提取液保存于-80℃的冰箱中。進行基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性、純度和濃度。

1.7.4.3 PCR擴增及產物電泳檢測 首先，標本16SrRNA V3V4區域擴增：以基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶barcode的特異引物及Ta Ka Ra Premix Taq?Version2.0（TaKaRa Biotechnology Co.，Dalian，China）進行PCR擴增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的片段長度和濃度，主帶長度在正常范圍內（16SV3V4～460 bp左右）的樣品可用于進一步的實驗。其次，Pooling及切膠純化：利用Gene ToolsAnalysis Software（Version4.03.05.0，SynGene）對PCR產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各PCR產物進行混合。使用EZNA GelExtraction Kit（Omega，USA）凝膠回收試劑盒回收PCR混合產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。

1.7.4.5 生物信息學分析 物種序列采用GreenGene數據庫注釋，置信度閾值設置為0.5。通過操作分類單元（OTU）的韋恩（Venn）圖分析，對物種及其豐度分析以及主坐標分析進行處理。韋恩圖繪制了每組樣本共有的OTU數量及其特有的OTU，展示各組樣本間OTU的重疊情況。將物種及其豐度分析與數據庫進行對比，將物種分為門、綱、目、科、屬、種，并分析其在每組樣品中所占的比例。樣品組間多樣性差異大小的觀察主要用主坐標分析方法，兩樣品距離越近，則表示兩樣品的物種組成差異越小。

1.7.4.6 菌群16SrDNA測序 16SrDNA V3V4區域采用前引物為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，后引物為5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，按照NEBNext?UltraTMDNALibrary Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）標準流程進行建庫操作，采用Illumina Hiseq2500平臺對構建的擴增子文庫進行PE250測序。再使用QIIME軟件、R軟件及Mothur軟件等對測序結果進行alpha多樣性、beta多樣性、菌群分類學組成等一系列的綜合性分析及處理。

1.8 統計方法 應用SPSS25.0統計軟件進行數據的統計處理。計量資料（均符合正態分布）以均數±標準差（±s）表示，經方差齊性F檢驗，方差齊者采用t檢驗（其中，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗），方差不齊者改用t’檢驗；計數資料（四格表資料）用率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。均采用雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者脫落情況及基線資料比較 研究過程中，2組患者均能完成全部療程的觀察，均無脫落剔除病例。對照組20例患者中，男10例，女10例；年齡18～75歲，平均年齡為（56.35±9.99）歲。試驗組20例患者中，男11例，女9例；年齡18～75歲，平均年齡為（55.55±12.62）歲。2組患者的性別、年齡等基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 2組患者中醫證候療效比較 表1結果顯示：干預8周后，試驗組的總有效率為95.0%（19/20），對照組為15.0%（3/20），組間比較（Fisher精確概率法），試驗組的中醫證候療效明顯優于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 2組高脂血癥痰濁阻遏證患者中醫證候療效比較Table 1 Comparison of the TCM syndrome efficacy between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome [例（%）]

2.3 2組患者治療前后中醫證候積分比較 表2結果顯示：治療前，2組患者的形體肥胖、頭重如裹、嘔吐痰涎、口淡及食少等證候積分比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療后，試驗組的形體肥胖、頭重如裹、嘔吐痰涎、口淡及食少等證候積分均較治療前改善（P＜0.05或P＜0.01），而對照組僅形體肥胖及口淡等證候積分較治療前改善（P＜0.05）；組間比較，試驗組對各項中醫證候積分的改善作用均明顯優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表2 2組高脂血癥痰濁阻遏證患者治療前后中醫證候積分比較Table 2 Comparison of the TCM syndrome scores the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment between （±s，分）

表2 2組高脂血癥痰濁阻遏證患者治療前后中醫證候積分比較Table 2 Comparison of the TCM syndrome scores the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment between （±s，分）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與治療前比較；③P＜0.05，與對照組治療后比較

組別對照組試驗組時間治療前治療后治療前治療后例數/例20 20 20 20形體肥胖2.60±1.95 1.90±1.65①2.50±1.43 0.80±1.19②③頭重如裹2.00±1.58 1.80±1.43 2.80±1.36 0.60±0.94②③嘔吐痰涎1.80±1.82 1.60±1.39 1.40±1.14 0.60±0.94①③口淡1.35±1.13 1.15±1.04①1.80±1.22 0.45±0.60②③食少1.20±0.95 1.05±0.75 1.55±0.88 0.45±0.60②③

2.4 2組患者治療前后BMI比較 表3結果顯示：治療前，2組患者的BMI比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后，試驗組患者的BMI較治療前明顯降低（P＜0.05），對照組患者的BMI較治療前有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；組間比較，試驗組對BMI的降低作用明顯優于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 2組高脂血癥痰濁阻遏證患者治療前后體質量指數（BMI）比較Table 3 Comparison of the body mass index（BMI）between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment （±s）

表3 2組高脂血癥痰濁阻遏證患者治療前后體質量指數（BMI）比較Table 3 Comparison of the body mass index（BMI）between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment （±s）

注：①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與對照組治療后比較

組別對照組試驗組時間治療前治療后治療前治療后例數/例20 20 20 20 BMI/（kg·m-2）23.39±1.95 22.82±1.58 24.03±2.55 21.77±1.59①②

2.5 2組患者治療前后血脂指標比較 表4結果顯示：治療前，2組患者的TC、TG、HDL-C及LDL-C等血脂指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療后，2組患者的TC、TG、LDL-C水平均較治療前降低（P＜0.01），試驗組患者的HDL-C水平較治療前升高（P＜0.01），對照組的HDL-C水平較治療前有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；組間比較，試驗組對TC和LDL-C水平的降低作用及對HDL-C水平的升高作用均明顯優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 2組高脂血癥痰濁阻遏證患者治療前后血脂指標比較Table 4 Comparison of the blood lipid indexes between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment [±s，（mmol·L-1）]

表4 2組高脂血癥痰濁阻遏證患者治療前后血脂指標比較Table 4 Comparison of the blood lipid indexes between the two groups of patients with hyperlipidaemia of blockage of turbid phlegm syndrome before and after treatment [±s，（mmol·L-1）]

注：①P＜0.01，與治療前比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與對照組治療后比較

組別對照組試驗組時間治療前治療后治療前治療后例數/例20 20 20 20 TC 5.91±0.45 5.44±0.66①6.12±0.41 5.04±0.32①②TG 2.16±0.23 1.71±0.22①2.07±0.26 1.64±0.23①HDL-C 1.07±0.28 1.14±0.26 0.91±0.28 1.41±0.30①②LDL-C 3.94±0.32 3.15±0.49①3.87±0.32 2.60±0.46①③

2.6 16SrDNA測序結果 為了比較鷓鴣茶對腸道菌群的影響，本研究共采集了50個糞便樣本，包括10個健康人樣本，20個試驗組的樣本，20個對照組的樣本。提取樣本的16SrDNA序列，并對其進行測序，鑒定物種類別和相對含量。

2.6.1 腸道微生物α多樣性分析 采用Evenness、Richness、Shannon index三個參數描述菌群的alpha多樣性，結果顯示：相較于其他兩組，試驗組的多樣性最高（P＜0.05），而對照組的多樣性又高于健康人群（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組腸道菌群alpha多樣性比較Figure 1 Comparison of alpha diversity of intestinal flora in the trial group，control group and healthy volunteers

2.6.2 腸道微生物β多樣性分析 圖2是beta多樣性排序的結果，我們選擇最常見的beta多樣性排序方法主成分分析法（PCA），并且配套對應的群落差異檢測內容。從圖中可以看出，3組之間菌群組成差別較大，而每組內部都比較一致。

圖2 試驗組、對照組及健康人群腸道菌群beta多樣性PCA分析結果Figure 2 Results of PCA analysis of beta diversity of intestinal flora in the trial group，control group and healthy volunteers

2.6.3 門屬水平腸道菌群序列分類分析 圖3結果顯示：對照組的厚壁菌門（Firmicutes）占主導地位，它的相對含量遠高于健康人群和試驗組（P＜0.05）。相較于對照組，試驗組的厚壁菌門含量明顯降低（P＜0.05），而擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形 菌 門（Proteobacteria）的 含 量 明 顯 升 高（P＜0.05），試驗組與健康人群的各類菌群含量更為相似。對比試驗組和對照組的門水平和屬水平的微生物組成，說明鷓鴣茶對腸道微生物菌群的組成有顯著影響。圖4結果顯示：各個樣本的屬水平含量在健康人群、試驗組、對照組之間差異較大，而在各組內部菌群含量比較一致。

圖3 各組腸道菌群門水平各類物種的相對含量Figure 3 Relative content of various species of intestinal flora at the phylum level

圖4 各組各個樣本屬水平的微生物含量的熱圖Figure 4 Heat map of microbial content at the genus level for each sample from various groups

2.6.4 代謝功能和代謝產物的差異 采用Tax4Fun軟件計算各個樣本代謝功能的相對豐度，選取豐度最高的前20個功能和代謝通路進行展示（見圖5和圖6）。從圖5可以看出，K02014在試驗組中的含量低于健康人群和對照組。K02025、K02026、K2027三個糖轉運相關蛋白在試驗組顯著升高（P＜0.05）。從圖6可以看出，k02010、ABCtransporters在試驗組中的含量高于健康人群和對照組（P＜0.05）。

圖6 各組差異通路圖（2）Figure 6 Differential pathway diagram（2）for various groups

3 討論

高脂血癥是心血管疾病的重要危險因素，如何降低血脂是心血管科醫師及患者所關切的問題。中醫認為，脾主運化水谷，布散精微。血脂亦由水谷所化生，并依賴脾的轉輸功能布散周身。嗜食肥甘厚味易于損傷脾胃，使脾失健運，不能將多余脂質運化，從而導致痰濁內生[11]。正如《景岳全書》[12]所言：“脾虛胃弱，元氣不足，水谷不化氣血反變痰涎”。也有報道[13]指出，痰濁與血脂異常密切相關，血脂異常可視為痰證的現代生物學內涵之一。由此可見，痰濁與高血脂是中西醫對同一病機的不同表達。基于此，本研究對鷓鴣茶治療高脂血癥痰濁阻遏證患者的干預效果進行了觀察，研究結果發現，在療效方面，相較于單純運動降脂的對照組，鷓鴣茶加運動降脂的試驗組的中醫證候療效顯著好轉（P＜0.01）。在中醫證候積分方面，試驗組不僅治療后的形體肥胖、頭重如裹、嘔吐痰涎、口淡及食少等證候較治療前好轉（P＜0.05或P＜0.01），而且好轉幅度均明顯大于對照組（P＜0.05）。在BMI方面，試驗組治療后的BMI較治療前及對照組均下降（P＜0.05）。在血脂指標方面，2組治療后的TC、TG、LDL-C水平均較治療前降低（P＜0.01），試驗組的HDL-C水平較治療前升高（P＜0.01），對照組的HDL-C水平較治療前有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；組間比較，試驗組對TC和LDL-C水平的降低作用及對HDL-C水平的升高作用均明顯優于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。基于上述結果，可以證實鷓鴣茶可有效改善高脂血癥患者的中醫證候及血脂水平。

目前普遍認為，人體的生命活動是細菌與細胞共同作用下的結果，其中約80%的細菌存在于腸道，參與了腸道營養物質的吸收、分布、代謝和排泄，微生物與宿主之間互相依存、互相制約，處于一個動態平衡的狀態。當腸道菌群發生改變，可引起腸道吸收屏障的變化，引起腸道免疫系統的應答異常，從而參與多種疾病的發生及轉歸[14]。所以，為了探索鷓鴣茶的降脂機制，我們檢測對比了健康人群、對照組和試驗組的腸道菌群情況。結果發現，對照組腸道菌群中厚壁菌門含量明顯高于試驗組及健康人群（P＜0.05）。而研究[15]發現，厚壁菌會產生膽汁鹽羥化酶（bile salt hydroxylase，BSH），BSH會將膽汁酸轉化為二級游離膽汁酸。而二級游離膽汁酸可通過G蛋白偶聯受體調節肝臟和脂質的代謝，從而引起血脂異常。本研究結果顯示：相較于對照組，試驗組經鷓鴣茶干預后厚壁菌門含量明顯下降（P＜0.05）。此外我們還發現，經鷓鴣茶干預后，試驗組患者的擬桿菌門和變形菌門含量較對照組明顯增加（P＜0.05），而有報道[16]指出，這兩種菌群都是促進血脂代謝的有益菌。

最后，我們運用Tax4Fun軟件計算各個樣本代謝功能的相對豐度，結果發現，試驗組糖轉運相關蛋白顯著升高。而有研究[17-18]證實，糖轉運相關蛋白表達水平低下是胰島素抵抗發生的分子機制之一，而胰島素抵抗又會導致血脂代謝障礙。

綜上所述，鷓鴣茶可有效改善高脂血癥痰濁阻遏證患者的中醫證候、體質量指數和血脂指標，其可能是通過調節患者的腸道菌群途徑實現的。