青貯玉米蠕形菌的分離鑒定及其致病性分析

祁鶴興，王海春，蘆光新*，李宗仁，田 豐，賀晨邦，徐成體，鄒海濤，雷生妍，李紅芳，唐海鵬

(1.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2.青海省草原總站，青海 西寧 810001；3.青海大學農林科學院，青海 西寧 810016；4.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

青貯玉米(ZeaMaysL.)作為一種營養均衡，適口性好的優質飼料在全球畜牧業發達國家廣泛種植[1-3]。近十幾年來，隨著玉米全膜雙壟栽培技術在青海省的示范推廣，青貯玉米栽培區域已擴大至高海拔和干旱地區。青貯玉米依其產量、品質和價值的優勢發展速度快，潛力大，是青海省農業特色優勢產業[4]。但是多種葉斑病的發生，影響青貯玉米產業的健康發展[5]。

玉米田間病害種類多，病因復雜，僅引起玉米病害的真菌就多達147余種，可造成葉部、莖部、穗部和根部等病害[6]。蠕形菌通常指形狀似蠕蟲，具有多個橫隔膜的一類真菌，包括平臍蠕孢屬(Bipolaris)、凸臍蠕孢屬(Exserohilum)、內臍蠕孢屬(Drechslera)和彎孢屬(Curvularia)等多屬真菌，大多數的蠕形菌都可侵染植物造成病害[7]。多種蠕形菌可侵染玉米，造成葉斑病害，如大斑凸臍蠕孢(E.turcicum)[8-9]、玉蜀黍平臍蠕孢(B.maydis)[10-11]、新月彎孢(C.lunate)[12-13]和麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)[14-15]等。

近十幾年來，我國抗大、小斑病玉米品種的選育推廣工作進展順利，但是這也導致一些原來生產上的次要病害逐年嚴重，新病害逐年出現，造成新的產量損失。如鏈格孢葉斑病日趨嚴重，在云南省[16]、黑龍江省[17]、甘肅省[18]和青海省[5]等地都有報道，對玉米品質和產量造成危害。青貯玉米由于受到蠕形菌的侵染，不僅損害青貯玉米的品質和產量，病原菌所產生的各種毒素[8,10,12,14]還可能對青海省畜牧業造成影響，如影響肉羊肉牛品質，影響奶牛產奶質量等。玉米在青貯過程中，病原真菌可能對有益乳酸菌、酵母和其他霉菌產生影響[19-24]。研究者們從歐洲牛場采集158份青貯玉米飼料，對其中所含毒素進行檢測，發現70%的樣本都有毒素檢出，87%的樣本含有5種以上的毒素[25]。因此明確引起青貯玉米葉斑病的蠕形菌種類及其致病性對于后續開展病害防治，青貯飼料的解毒等至關重要。

本課題組于2018—2021年在青海省東部農業區民和縣、大通縣、樂都區和貴德縣青貯玉米種植區進行病害調查時采集不同類型葉斑病樣本，進行蠕形菌病原菌的分離、形態學和分子生物學鑒定，并進行致病性分析。旨在為后續病害分布、綜合防治及病原菌毒素研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

于2018—2021年在青海省西寧市、海東市和海南藏族自治州7個青貯玉米種植地(表1)采用五點取樣法采集疑似病原菌病葉，共采集樣本61份。8個青貯玉米主栽品種(‘鐵研53’‘晉單60’‘金黃828’‘益農2020’‘中單2’‘豫玉22’‘金穗3’和‘甘玉23’)種子由青海大學畜牧獸醫科學院提供。

表1 蠕形菌病原菌采集地點

1.2 培養基配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)和2%水瓊脂培養基(2%WA)配制參照方中達[26]的方法。

1.3 病原菌的分離、純化與保存

病原菌的分離純化方法結合單孢分離法和組織分離法進行[5,27]。分離到的單孢菌株采用濾紙片保存法[28]，置于-20℃冰箱長期保存。

1.4 病原菌的分類鑒定

1.4.1菌株形態學鑒定 菌落形態觀察：將分離純化得到的單孢菌株接種于PDA平板，于25℃培養箱中培養7 d。用直徑0.5 cm的打孔器取菌餅放置在PDA平板中。每株菌株3個重復，每皿培養基的厚度保持一致。放置于25℃培養箱培養7 d后，觀察菌落形態。

分生孢子形態觀察：使用接種針挑取分生孢子制成臨時玻片，在40×光學顯微鏡下觀察分生孢子形態。菌株形態學鑒定參照戴芳瀾[29]。

1.4.2菌株基因組DNA的提取 采用CATB法提取基因組DNA[5,27]，最后用25 μL TE/RNase溶解沉淀，-20℃保存備用。

1.4.3菌株系統發育分析 rDNA-ITS擴增引物為ITS1和ITS4[27]，GADPH基因擴增引物為gpd-1和gpd-2[29-31]。

25 μL PCR反應體系：12.5 μL 2×PCR Mix(北京擎科新業生物技術公司)；各1.0 μL上下游引物(25 pmol·L-1)；模板DNA(30 μg·L-1)1.0 μL；雙蒸水補足至25 μL。PCR反應程序：95℃，5 min；95℃，1 min，55℃，1 min，72℃，2 min，30個循環；72℃，10 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，PCR擴增產物純化后由北京擎科新業生物技術公司進行雙向測序。

參照祁鶴興等[5]和馬桂花等[26]的方法構建系統發育樹。142株菌株GENBANK登錄號為OP412828-OP412970，OP476513-OP476654。

1.5 病原菌致病性測定

病原菌分生孢子制備參照祁鶴興等[5]的方法。在直徑為12 cm塑料花盆中加入營養土種植青貯玉米。采用離體劃傷接種法和噴霧接種法測定病原菌致病性。

離體劃傷接種法：剪取4～6葉期青貯玉米心葉中下部，用于接種8種青貯玉米，‘鐵研53’‘晉單60’‘金黃828’‘益農2020’‘中單2’‘豫玉22’‘金穗3’和‘甘玉23’。每株菌重復接種3片葉片。每片葉片均勻劃傷2處，在劃傷處接種10 μL孢子懸浮液，以接種無菌水為對照。25℃黑暗保濕培養24 h，之后25℃光照培養6 d，觀察青貯玉米葉片的發病情況。

噴霧接種法：使用生長期為2周的青貯玉米品種‘鐵研53’用于菌株孢子懸浮液噴霧接種。每盆接種10 mL濃度為(1×105)個·mL-1的孢子懸浮液。接種后的植株放置在25℃黑暗環境下保濕培養1 d，之后25℃持續光照條件下培養6 d。每株菌株重復接種3盆植株，接種試驗重復3次。葉片產生病斑后，在病健交界處剪取小塊葉片置于水瓊脂表面培養36 h，之后在顯微鏡下觀察是否有病原菌分生孢子產生，以此來判斷病斑是否是由對應病原菌侵染所造成。

2 結果與分析

2.1 青貯玉米蠕形菌病原菌的組成及形態學特征

對從青海省東部農業區7個采樣地采集到的青貯玉米病葉進行病原菌的分離和純化，共分離得到142株病原菌。2018和2019年，從民和縣采集的病葉上各分離得到6株；2020年從樂都區分離得到3株；2020和2021年從大通縣分別分離得到51株和26株；2021年從貴德縣分離得到50株。通過菌株形態學特征和分子生物學鑒定發現，142株菌株分別屬于3屬，平臍蠕孢屬真菌125株，凸臍蠕孢屬真菌9株，彎孢屬真菌8株。其中麥根腐平臍蠕孢和玉米生平臍蠕孢(B.zeicola)分離個數最多，分別為77株和48株，分離頻率分別為54.2%和33.8%；其次，分離得到9株大斑病菌，分離頻率為6.3%，新月彎孢、疣狀彎孢(C.verruculosa)和穗狀彎孢(C.spicifera)的分離個數分別為3株、2株和3株，分離頻率分別為2.1%，1.4%和2.1%(表2)。

表2 蠕形菌病原菌分離個數及分離頻率

青貯玉米蠕形菌病原菌的形態特征差別明顯(圖1)。麥根腐平臍蠕孢：菌落偶有缺裂，大多數為圓形，氣生菌絲灰綠色至黑褐色，呈絨氈狀。分生孢子暗褐色，橢圓形或長橢圓形，中間寬，兩端漸狹鈍圓，大多直或略彎，3～12個隔膜，臍點不明顯，大小49.1～91.3×15.1～24.8 μm(平均：61.6×19.6 μm)。

圖1 病原菌菌落形態和分生孢子形態

玉米生平臍蠕孢：氣生菌絲發達，淺綠色至黑綠色。具有中央寬、兩端漸窄、形狀為長橢圓形的分生孢子；分生孢子少數略有彎曲，4～10個隔膜，大小為53.9～92.8 μm×11.22～23.35 μm(平均：78.0×14.2 μm)。

大斑病菌：菌落淺綠色至褐色，氣生菌絲絨氈狀，較繁茂。分生孢子梭形，淺褐色至深褐色，有的略向一方彎曲，頂細胞長橢圓形，基細胞尖錐形，臍點明顯，2～10個隔膜，大小為60.8～124.3 μm×14.1～23.5 μm(平均：88.1×17.6 μm)。

新月彎孢：氣生菌絲放射狀擴展，呈墨綠色，絲絨狀。分生孢子新月狀，暗褐色，具3個隔膜，兩端細胞稍小，顏色較淺，中間2個細胞膨大，第3個細胞膨大最明顯。大小為17.4～24.8 μm×7.4～12.9 μm(平均：19.8×9.4 μm)。

疣狀彎孢：菌落墨綠色，邊緣偏白，絲絨狀，老熟后呈黑色。分生孢子淺褐色，多彎曲，具3個隔膜，中間2個細胞比兩端細胞更大、顏色更深，大小為19.6～26.5 μm×7.4～10.6 μm(平均：22.5×11.3 μm)。

穗狀彎孢：菌落淺綠褐色，絨墊狀，老熟后呈黑色。分生孢子橢圓形或長圓形，頂細胞和基細胞圓形，淺棕褐色，多具3個橫隔，大小19.8～28.2 μm×8.1～11.6 μm(平均：23.9×9.7 μm)。

2.2 麥根腐平臍蠕孢葉斑病和圓斑病田間癥狀

麥根腐平臍蠕孢引起麥根腐平臍蠕孢葉斑病，該病典型病斑呈灰白色至黃色，圓形或橢圓形，壞死斑先從微小開始發展，擴展到大的壞死斑，并帶有黃色褪綠的暈圈(圖2)，該葉斑病在大通縣普遍發生，發病率為10%～30%，嚴重度為3—5級。玉米生平臍蠕孢引起玉米圓斑病，典型病斑呈狹長狀，中間淺灰色至褐色，周緣暗色，具有黃色暈圈(圖2)。玉米圓斑病典型癥狀只在貴德縣觀察到，發病率為15%，嚴重度為3—5級。民和縣和大通縣雖分別分離得到5株和1株玉米生平臍蠕孢，但是在田間沒有觀察到典型癥狀。

圖2 青貯玉米麥根腐平臍蠕孢葉斑病和圓斑病田間癥狀

2.3 病原菌系統發育分析

分別以43株病原菌代表菌株和14株參考菌株的rDNA-ITS序列和GADPH基因序列構建系統發育樹(圖3和圖4)。分析發現構建的2個系統發育樹具有相似的拓補結構，57株菌株被分為6個發育分枝。菌株CJZ-5，DTR-84，LD-206，MH1846-B，ST-1，LD-36和MH1859-B等20株菌株與麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)在同一發育分支上，親緣關系最近。菌株GDX-8，MH-4-1，GDX-21，GDX-63和MH1848-A等10株菌株與玉米生平臍蠕孢(B.zeicola)在同一發育分支上，親緣關系最近。菌株GDX-65，GDX-24和CJZ-8等5株菌株與大斑病菌(E.turcicum)在同一發育分支上，親緣關系最近。菌株DT-114和DT-114-1與疣狀彎孢(C.verruculosa)聚為一個分支，親緣關系最近。菌株MH-41，MH1832-A和MH-4-1-1與穗狀彎孢(C.spicifera)聚為一個發育分支，親緣關系最近。菌株CJZ-11，LD-204-1和DT-68與新月彎孢(C.lunata)聚為一個分支，親緣關系最近。

圖3 基于43株代表病原菌rDNA-ITS序列構建的系統發育樹

圖4 基于43株代表病原菌GADPH基因序列構建的系統發育樹

2.4 病原菌致病性分析

為分析6種病原菌對8個青海省青貯玉米主栽品種的致病性，首先采用劃傷接種法進行接種。結果表明77株麥根腐平臍蠕孢和48株玉米生平臍蠕孢對8個品種都有致病性(圖5)。大斑病菌、穗狀彎孢、新月彎孢和疣狀彎孢對8個品種的致病性存在差異(圖5，表3)。大斑病菌中，菌株CJZ-8對‘豫玉22’和‘金穗5’不致病，對‘鐵研53’‘晉單60’‘金黃828’‘益農2020’‘中單2’和‘甘玉23’致病，其余8株菌株能侵染的品種在2-5個之間，菌株GDX-66和GDX-81只能侵染‘金黃828’和‘益農2020’。穗狀彎孢MH1832-A能侵染8個青貯玉米品種，其余2株菌株MH-41和MH-4-1-1能侵染4個品種。新月彎孢LD-204-1能侵染8個青貯玉米品種，其余2株菌株DT-68和CJZ-11能侵染6個品種。2株疣狀彎孢具有相同的致病性，都能侵染‘鐵研53’‘金黃828’‘金穗5’和‘甘玉23’，不能侵染其余4個品種。

圖5 青貯玉米來源6種病原菌劃傷接種8個青貯玉米品種

表3 青貯玉米4種病原菌接種結果統計

6種病原菌代表菌株噴霧接種‘鐵研53’，發現下部老葉易感病，接種7 d后多數老葉腐爛發霉。且穗狀彎孢、新月彎孢和疣狀彎孢接種后葉尖也易出現腐爛發霉現象。玉米生平臍蠕孢和大斑病菌形成長條型典型病斑，病斑極易呈片狀；麥根腐平臍蠕孢形成的病斑較小，但病斑也易連成片狀。穗狀彎孢形成小梭形病斑，新月彎孢形成圓形或橢圓形小病斑，疣狀彎孢形成橢圓形或不規則小病斑(圖6)。接種發病葉片經保濕培養 36 h后，用10×光學顯微鏡能觀察到分生孢子梗和分生孢子，從發病病斑分離得到的菌株與野生型菌株菌落形態一致(圖7)。

圖6 青貯玉米6種病原菌噴霧接種鐵研53

圖7 青貯玉米6種病原菌致病性驗證

3 討論

青海省作為我國五大牧區之一，畜牧業是最具特色的傳統產業之一。然而，青海省由于天然草場環境惡化導致牧草缺乏，家畜面臨著“夏肥冬瘦”的問題[32]；冬季為藏系綿羊產羔期，但是冬季牧草缺乏導致羔羊死亡現象時有發生[33]。因此，飼料及其品質已成為影響青海省畜牧業持續發展的重要因素之一。青海省近十幾年來大力發展青貯玉米產業，對于緩解天然草場退化和畜牧業可持續發展都起到了積極作用。

平臍蠕孢屬、彎孢屬和凸臍蠕孢屬多種真菌能侵染玉米，造成產量和品質損失。本研究發現麥根腐平臍蠕孢、玉米生平臍蠕孢、大斑病菌、新月彎孢、穗狀彎孢和疣狀彎孢可以侵染青貯玉米，造成葉斑病。麥根腐平臍蠕孢[14-15]、玉米生平臍蠕孢[34-35]、大斑病菌[8-9]、新月彎孢[12-13]引起的葉斑病在國內外都嚴重影響玉米產量和品質。2016年郭玉杰等報道穗狀彎孢可以引起玉米葉斑病，病斑呈梭形[36]。我們在民和采集的樣本上分離得到3株穗狀彎孢，在田間沒有觀察到典型癥狀，可能與其他病原菌復合侵染有關。但是噴霧接種的病斑呈現短條狀的梭形，與郭玉杰等[36]的報道一致。疣狀彎孢引起的玉米葉斑病在國內外尚未見報道。

麥根腐平臍蠕孢葉斑病在大通縣3個采樣地都有觀察到，2019—2020年在湟中縣和湟源縣沒有觀察到該病害，但是2021年在這2個縣進行病害調查時發現該病害已有發生。因此推測麥根腐平臍蠕孢葉斑病在青海地區有擴大的趨勢，這可能與近幾年的氣溫異常有關。玉米生平臍蠕孢在貴德縣、民和縣和大通縣采樣地分離得到，但是該病原菌引起的圓斑病典型癥狀只在2021年貴德縣觀察得到。玉米生平臍蠕孢存在生理小種分化現象，可以分為1—3號小種。我們根據該病害田間癥狀及室內噴霧接種癥狀特點分析，分離得到的玉米生平臍蠕孢為1號小種，該小種寄主專化性強，多產生卵圓形病斑，發病嚴重時病斑易連成一片[34,37-39]。玉米圓斑病是一種世界性流行病害，美國、瑞士、尼日利亞、德國和日本等國家均有發生，在我國陜西、云南、吉林、浙江、河北、遼寧、黑龍江、北京和內蒙古等省市自治區也屬于常發病害[37]。

6種病原菌，共計142株菌株劃傷接種8個青貯玉米品種后發現，77株麥根腐平臍蠕孢和48株玉米生平臍蠕孢都可侵染8個玉米品種，由此推測這8個青貯玉米品種對麥根腐平臍蠕孢和玉米生平臍蠕孢沒有抗性。大斑病菌、穗狀彎孢、新月彎孢和疣狀彎孢分離得到的個數較少，但是在青海省其他青貯玉米種植區侵染情況如何尚未可知。后續我們將對這6種病原菌引起病害的綜合防治方法及在青海全省內的分布情況進行研究。

4 結論

從青海省東部農業區青貯玉米葉斑病葉分離得到麥根腐平臍蠕孢、玉米生平臍蠕孢、大斑病菌、新月彎孢、疣狀彎孢和穗狀彎孢6種病原菌。麥根腐平臍蠕孢和玉米生平臍蠕孢分離個數最多，且8個青貯玉米品種對這2種病原菌沒有抗性。本文首次報道疣狀彎孢可以侵染玉米，造成葉斑病。