基于ISSR分子標記的紫云英種質資源遺傳多樣性及結構分析

張 夢，史鵬飛，劉春增，李本銀，丁 麗，張 琳，鄭春風，張成蘭, 何春梅，施海帆，呂玉虎，常單娜，曹衛東*

(1.河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所，河南 鄭州 450002；2.信陽市農業科學院，河南 信陽 464000；3.河南省作物分子育種研究院，河南 鄭州 450002；4.福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建 福州 350013；5.南京農業大學草業學院，江蘇 南京 210095；6.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081)

紫云英(AstragalussinicusL.)是我國南方稻田重要的冬季綠肥，在培肥地力、降低化肥依賴、提升稻米產量和品質中發揮重要作用[1-2]。我國是紫云英的起源地，種質資源豐富，據推測紫云英起源中心在我國秦嶺以南的中部山間河谷地帶，并向東、向南擴展[3]。上世紀90年代以前，紫云英是我國農業生產主要有機肥源之一，種植分布廣泛，形成了眾多地方品種[4-5]。90年代以后，由于種植結構調整以及化學肥料的普及使用，紫云英種植應用范圍急劇縮小，紫云英研究和選育工作停滯[2]。近年來，隨著國家發展戰略和社會大眾對生態環境的重視，紫云英的產業化推廣與應用獲得了恢復性發展。但由于種質利用和研究中斷多年，原有品種退化、損失、混雜嚴重，現有紫云英地方品種和種質資源遺傳關系不明確，制約了對紫云英新品種的科學選育和管理認證[6]。

分子標記在作物遺傳育種領域得到廣泛應用，對于揭示供試材料遺傳特征具有重要意義。陳堅等[7]利用簡單重復序列(Simple sequence repeat，SSR)標記分析了9個紫云英品種遺傳多樣性，發現供試品種可聚為2個類群，且表現出一定的區域分布特征。與其他分子標記相比，簡單序列重復區間擴增多態性分子(Inter-simple sequence repeat，ISSR)標記具有穩定、多態性高、簡便及易操作等優點，被視為理想的遺傳標記方法，已在多種動植物的親緣關系[8]、種質鑒定[9]、遺傳完整性[10]等研究方面得到應用。孫清信等針對紫云英優化了ISSR-PCR反應體系[11]，張慧等[12]利用ISSR標記研究了 22個紫云英品種遺傳多態性，發現供試品種平均多態率為59.2%，品種間的相似性系數界于0.63～0.95，22個紫云英品種可分為 4類。然而，由于長期缺乏有效管理和保護，加之研究中斷造成部分品種和種質資源來源不明，育種資源遺傳特征研究的不足制約了以紫云英為代表綠肥種業的進一步發展。

綠肥是基于綠肥作物通過固定光合產物和環境養分并在一定時期翻壓還田形成的有機肥源，它的生產需要配合不同的生產制度和種植模式，在空間和時間“夾縫”中實現資源高效利用。因此，綠肥的產業化發展需要不斷強化種質資源創新與利用、培育優質綠肥新品種，以適應生產方式、種植制度和應用模式的多樣化需求，從根本上擺脫“依靠財政投入才能推廣應用的傳統有機肥料”之尷尬局面。因此，本文以綠肥作物紫云英為研究對象，利用國家綠肥種質資源庫及各地不同時期的紫云英種質資源，通過分子標記分析供試資源的遺傳多樣性，明確不同紫云英種質資源的遺傳關系及其遺傳結構，評價育種材料在省份間交流和利用情況，以期為紫云英現有種質資源的充分利用、新品種選育以及現有品種的有效鑒別提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試紫云英種質資源共77份(表1)，其中53份資源由中國農業科學農業資源與農業區劃研究所(編號1～14，17和42～77)和福建省農業科學院土壤肥料研究所(編號15～16)提供；22份資源(編號18～39)為研究團隊近5年在豫南地區收集獲得；2份資源(編號40～41)為豫南地區主推紫云英品種。研究中根據來源地的不同將供試資源進行分類編號。

表1 77份紫云英種質資源

1.2 DNA提取

采用苗盤培養的方式，于苗期4片真葉完全展開時，對供試的77份資源進行采樣。鑒于異花授粉植物群體內遺傳多樣性豐富，個體間可能存在較大差異，參考陳堅等[13]研究結果及供試資源數量，本研究采用多單株分別提取混合測定的取樣策略：每份資源分別選擇生長正常的紫云英幼苗25個單株，采集頂部真葉粉碎混勻后采用磁珠試劑盒(北京博友順生物技術有限公司)分別提取紫云英葉片DNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，并用Nanodrop分光光度計測定DNA濃度和質量。將檢測合格的DNA樣品稀釋至40 μg·L-1，最后把同一資源的25份DNA稀釋液等體積混合，置于—20℃下保存備用。

1.3 引物篩選及PCR擴增

參考孫清信等[11]和張慧等[12]的方法，以‘浙紫71-107’‘寧綠1號’‘閩紫3號’‘XYXH17-4’為模板，依據最優ISSR-PCR體系中的擴增條件，通過初步篩選及溫度梯度復篩，從56條ISSR引物(北京六合華大基因科技有限公司)中篩選條帶多態性高、重復性好、條帶清晰的引物14條，對供試紫云英種質資源進行ISSR分析。其中，PCR擴增體系總體積為25 μL，DNA模板40 ng，10×Bufer 2.5 μL，primer 0.3 μmol·L-1，dNTP mixture 0.25 μmol·L-1，MgCl21.5 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶1.25U(TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司)；PCR擴增程序為94℃預變性5 min，然后進行35個循環：94℃變性45 s，56～52℃復性45 s，72℃延伸1.5 min；循環結束后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR結束后，將PCR產物在2.0%的瓊脂糖凝膠檢測擴增產物(電壓120 V，電泳50 min，電泳緩沖液濃度TAE)，Marker為2 000 bp。電泳后凝膠成像儀(K8300北京科創銳新生物科技有限公司)進行成像拍照并保存DNA檢測結果。

1.4 數據分析

PCR擴增產物電泳在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。使用Gel-pro analyzer軟件估算出每個引物多態性條帶，形成ISSR的表型數據矩陣，進行有關分析。

1.4.1個體間遺傳特征分析 使用NTSYS軟件計算相似系數(DICE系數)，對77份紫云英地方種質資源進行UPGMA聚類分析。參考宋海斌等[14]和王琰琰等[15]方法，構建不同種質資源的指紋圖譜：將14條引物依次編碼為A～N，條帶由小到大進行數字編號。根據擴增情況，每個紫云英種質資源形成了由字母和阿拉伯數字組成的帶型信息碼，如A1A5B2，表示該材料在引物A的第1和第5位點擴增出條帶，在引物B第2位點擴增出條帶。使用Excel中COUNTIF函數，逐次迭代比對信息碼的條帶信息，獲得各引物可單獨鑒別供試紫云英資源的數量和種類信息，并據此優化組合并縮減引物數量，獲得核心引物(用最少的引物組合區分供試材料)。利用SPSS 22中神經網絡模塊的多層感知器進行特征選擇，依據特征重要性逐次迭代核心引物位點信息，篩選能夠區分供試資源的最小特征位點集合，最終構建出基于供試紫云英種質資源的指紋圖譜編碼。

1.4.2群體間遺傳特征分析 采用GenAlEx 6.503加載宏[16]對不同省份(地區)的種質資源ISSR分子標記進行主坐標分析(PCoA)，POPGENE 1.32軟件[17]對不同來源地供試材料進行群體遺傳相似性分析。由于本研究不同省份(地區)種質資源數量差異較大，因此基于主坐標分析和群體遺傳相似性特征，將江蘇-上海-安徽資源合并為蘇滬皖資源庫(SHW)、湖南-江西-廣西-四川資源合并為湘贛桂川資源庫(XGGC)，對河南資源庫(HE，24份資源)、福建資源庫(FJ，13份資源)、浙江資源庫(ZJ，11份資源)以及蘇滬皖資源庫(SHW，8份資源)、湘贛桂川資源庫(XGGC，20份資源)進行分子遺傳變異方差分析(AMOVA)。日本兵庫種(AB-01)由于無法推測傳播途徑，未納入本分析。

1.4.3省份材料遺傳結構分析 不同于野外自然材料，供試綠肥種質資源在不同地區的數量確定，包括野生材料和人工雜交選擇的育種材料。同時，由于材料來源較為復雜，野生材料不能明確是否為人工選育材料散落后的自然變異，部分育種材料亦不能考證親本來源(與90年代后相關研究中斷有關)。因此，鑒于供試材料涵蓋了全國主要的紫云英生產省份以及主要栽培種，參考分子生態學方法利用Structure軟件[18-19]，對群體進行K=1～10的貝葉斯聚類，計算群體和個體Q矩陣，利用Structure Harvester[19]計算lnP(K)和ΔK，利用CLUMPP軟件[20]對重復抽樣數據進行分析，Distruct軟件[21]對群體結構分析并進行數據可視化，以評價不同省份對紫云英種質資源的利用程度，推測我國主要紫云英栽培省份種質資源特征。標準地圖由自然資源部地圖技術審查中心標準地圖服務網(http://bzdt.ch.mnr.gov.cn/)獲得。

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增結果及多態性

提取基因組總DNA的OD260/OD280在1.573～1.789之間，DNA濃度均大于40 μg·L-1，定量稀釋混合后滿足ISSR標記分析。篩選出14條擴增條帶清晰、條帶數較多、多態性良好的ISSR引物(圖1)。在77個樣品中共擴增出了150條清晰條帶，137條為多態位點，平均多態性比率89.34%(表2)。各引物擴增的條帶在4～16條之間，平均每條引物擴增的條帶數為10.7條。觀測等位基因數1.50～2.00，有效等位基因數1.13～1.70，基因多樣性指數0.10～0.40，信息指數0.18～0.59，均以P809引物最高(表2)。引物分析顯示，ISSR標記在77份供試紫云英種質資源中具有豐富的多態性，具備反映供試資源遺傳特征的作用。

表2 ISSR引物信息及擴增結果

2.2 不同紫云英種質資源的個體遺傳關系

77份紫云英種質資源的遺傳相似性系數(Genetic similarity，GS)介于 0.567 7～0.868 6之間(圖2)。其中，安徽‘當涂種’(AH-01)與‘弋江籽’(AH-02)之間遺傳相似性系數最大(GS=0.868 6)，說明兩個資源親緣關系最近；湖南‘澧縣種’(HU-10)與河南‘DSQS17-4’(HE-14)之間相似系數最小(GS=0.567 7)，說明兩個資源親緣關系最遠。根據遺傳相似性系數矩陣，對77份供試材料進行聚類分析，得到樹狀聚類圖(圖2)。在遺傳相似系數為0.720 0時，77份資源可分為6個聚類：聚類Ⅰ包括日本‘兵庫種’、廣西‘萍寧3號’、四川‘川西種’以及全部供試江西資源和6份湖南資源；聚類Ⅱ包括全部供試安徽資源和17個河南資源；聚類Ⅲ包括12個福建資源、6個湖南資源、5個河南資源以及全部供試江蘇、上海、浙江的資源；聚類Ⅳ為福建‘閩紫3號’；聚類Ⅴ為河南‘DSQS17-4’；聚類Ⅵ為河南‘DSHS17-6’，供試資源在聚類中的分布呈現出明顯的區域聚集特征。

圖2 基于ISSR的77份紫云英種質資源的聚類圖

2.3 地區間種質資源的群體遺傳分化

各地區紫云英種質群體間的遺傳距離(Genetic distance，GD)存在差異(表3)，地區間資源的平均遺傳距離呈現出：國外>廣西>四川>安徽>上海>江蘇>河南>江西>福建>湖南。國外資源與湖南、江西、福建資源的遺傳距離相對較小(GD<0.30)，與安徽、四川資源的遺傳距離相對較大(GD > 0.37)。各省份資源中，存在福建-浙江、福建-湖南、福建-河南、湖南-江西等4個遺傳較為相似(GD< 0.05)的群體。主坐標分析進一步呈現出不同地區資源的相似性(圖3)。總體上，福建紫云英資源位于軸坐標中心位置，河南、安徽、江蘇、上海紫云英資源位于橫軸負值區域，江西、湖南、四川以及國外資源位于橫軸正值縱軸負值區域，浙江資源則位于橫軸縱軸正值區域(圖3，不同地區個別資源存在一定的離散)，說明不同地區紫云英資源具有一定分化，而福建紫云英資源可能與其他省份存在遺傳交流。由于不同省份(地區)種質資源數量差異較大，廣西、四川、上海、安徽資源較少，因此基于主坐標分析和群體遺傳相似性特征，將江蘇-上海-安徽資源歸為蘇滬皖資源庫(SHW)、湖南-江西-廣西-四川資源歸為湘贛桂川資源庫(XGGC)。對河南資源庫(HE，24份資源)、福建資源庫(FJ，13份資源)、浙江資源庫(ZJ，11份資源)以及上述兩個資源庫(SHW，8份資源；XGGC，20份資源)進行分子遺傳變異方差分析(AMOVA)，進一步驗證區域資源的遺傳分化情況。結果顯示，群體分化系數為0.136 3，達到極顯著水平(P< 0.001)，其中種群間變異占比13.9%，種群內變異占比86.1%(表4)，說明5個供試群體存在顯著的遺傳分化。

表3 不同地區紫云英種質資源群體的遺傳距離

表4 紫云英種質資源群體的分子遺傳變異方差分析

圖3 不同地區紫云英種質資源的主坐標分析

2.4 不同地區種質資源的群體遺傳結構

不同地區紫云英種質資源的群體遺傳結構存在差異(圖4)。當假設供試種質資源存在2個亞群體(K=2)時，10個地區中，河南、安徽、江蘇、上海遺傳結構相似，四川、廣西、湖南、江西、浙江資源的遺傳結構相似，福建則為亞群體混合型；當假設存在3個亞群體(K=3)時，河南、安徽遺傳結構相似，江蘇、上海相似，四川、廣西、湖南、江西相似，浙江則自為一體，福建仍呈現亞群體混合型。基于數據對數概率變化率(ΔK)推測最佳亞群體數，當K=2時，ΔK=36.59，而K≥3時，ΔK<2.8，說明10個省份(群體)的供試種質資源最佳亞群體數應為2個。關聯地理位置及推測的起源中心，供試紫云英呈現明顯的傳播特征，即以河南-安徽-江蘇-上海-福建為一線(北方資源庫)，以四川-廣西-湖南-江西-福建為一線(西部和南方資源庫)，紫云英群體遺傳結構逐漸變化。需要說明的是，群體遺傳結構分析與個體聚類結果存在差別(圖2和圖4)，主要原因是兩者分析方法和研究對象不同所致。

圖4 不同省份紫云英資源的遺傳結構

2.5 引物鑒別分析及指紋圖譜構建

利用循環迭代的方法分析了14個引物對77份紫云英種質資源的鑒別能力，發現不同ISSR引物擴增條帶信息鑒別供試資源的能力存在差異，表現為P809=P825>P886>P821>P810>P836>P868>P843>P811>P844>P846>P859>P857=P889，其中P809和P825均可單獨鑒別67份資源，而P857和P889無法單獨鑒別供試資源(如圖5)。基于引物的鑒別能力，通過神經網絡模型進行特征提取，篩選出P809和P886為核心引物，同時為盡可能降低指紋位數，通過迭代法篩選特征位點，構建出以P809第3，8，9，10，12，15擴增位點以及P886第1，3，5，9，10，11擴增位點為特征的指紋圖譜(表5)。

圖5 ISSR引物鑒別特征圖譜

3 討論

3.1 紫云英種質資源的遺傳多樣性與指紋圖譜構建

本研究對11個地區收集的77份紫云英地方種質資源開展ISSR分子標記分析，14條引物共擴增出150個條帶，137條為多態性條帶，各引物的基因多樣性和信息指數為0.10～0.40和0.18～0.59。陳堅等[7]對9個紫云英品種遺傳多樣性分析發現，供試資源遺傳多樣性指數為0.13～0.38，多態信息指數為 0.22～0.56，與本研究結果相似。此外，本研究供試種質資源之間遺傳相似性系數為0.567 7～0.868 6，相似性最高的安徽‘當涂種’(AH-01)與‘弋江籽’(AH-02)之間亦檢測出23個差異位點，占總多態性位點的16.8%，說明77份紫云英地方資源不存在異名同種現象，具備遺傳特異性。目前，不同紫云英的分子標記鑒別方法并未形成，如何高效便捷鑒定不同紫云英資源，成為綠肥行業發展面臨的重要問題。本研究中發現不同ISSR引物對77份紫云英資源的分子標記特征存在差異，雖然14個引物的多態性條帶比率為50%～100%，但引物對不同資源的區分能力卻存在差別，表現為P809=P825>P886>P821>P810>P836>P868>P843>P811>P844>P846>P859>P857=P889，其中P809和P825單獨可區分67份資源，而P857和P889無法單獨鑒別供試資源。因此，基于資源的遺傳特異性以及ISSR不同引物對資源的區分鑒別能力，構建了以P809和P886條帶為核心的紫云英ISSR標記指紋圖譜。宋海斌等[11]和王琰琰等[15]利用SSR標記分別對102份甜瓜(CucumismeloL.)品種和220份雪茄煙(NicotianatabacumL.)種質資源進行了指紋圖譜分析，提取核心引物18對和14對用作指紋分析，與本研究方法相似，但引物數量較多，原因可能是其供試資源數量高于本研究、使用的分子標記亦不同。指紋圖譜應用具有一定局限性，如P809和P886分別可擴增16和14個條帶，理論上最高可鑒別230=1 073 741 824份資源，77份資源鑒別僅需要7個有效條帶(27=128>77)，而實際情況卻是14個供試引物均無法單獨鑒別77份資源，說明引物的每個條帶并非皆為區分種質資源的有效條帶。因此，若紫云英種質資源數量增大，核心引物或者特征位點數量也將增多。目前，我國紫云英種質資源主要保存在中國農業科學院、福建省農業科學院、江西省農業科學院和湖南省農業科學院，有效種質資源的具體數量并未明確，對紫云英指紋圖譜的開發和應用仍有待深入研究。

3.2 不同地區紫云英種質資源的遺傳關系、利用情況及演化推斷

本研究中，77份供試資源可分為6個聚類，聚類組成分布呈現出明顯的區域聚集特征，同一地區種質資源傾向于聚集一個聚類(圖2和圖3)，說明紫云英在傳播過程中表現出明顯的分化和地理分割性，這種特征與劉碩等[22]對中亞及我國普通杏(PrunusarmeniacaL.)和西伯利亞杏(PrunussibiricaL.)野生居群，張旭等[23]對內蒙古、寧夏、甘肅16個不同居群紅砂(ReaumuriasoogoricaM.)的研究結果類似，卻與鄧亞博等[24]對河南省內狗牙根(CynodondactylonP.)以及錢茱希等[25]對洞庭湖地區南荻(TriarrhenalutarioripariaL.)種質資源研究結論(地理距離與種群的遺傳變異分布無顯著相關性)不同，推測研究的空間尺度可能影響上述結論的產生。另一方面，自然地理條件、氣候因子、人為因素都是影響物種遺傳分化的重要因素[26-27]。前人專著《中國綠肥》記錄了秦嶺、大別山各山區濕潤地帶有野生種分布的現象[4]；《中國紫云英》則根據我國紫云英農家品種大多數冬性都較強、有一定的耐寒性及適應于較高的海拔等特性推測，它的起源地可能在秦嶺以南的中國中部山間河谷地帶，然后向南向東擴展[3]。本研究基于ISSR分子標記進行種群遺傳結構分析發現，不同地區紫云英種質資源的遺傳結構呈現明顯的地域特征，即以河南-安徽-江蘇-上海-福建為一線，供試群體遺傳結構類似，可稱為北方資源；以四川-廣西-湖南-江西-福建為一線，資源的遺傳結構類似，可稱為西南方資源。若參照前人所推測的起源中心，即秦嶺以南的中國中部山間河谷地帶為紫云英的起源中心(圖5)，則上述群體遺傳結構特征印證了前人關于紫云英起源與擴展的推斷。對于福建為何呈現出亞群體混合型特征，可能的原因有兩個：一是地理位置和地形原因造成福建成為紫云英傳播鏈末端；二是福建紫云英相關研究(尤其是雜交育種)開展較早、較為系統收集了我國其他省份的種質資源，開展了廣泛的雜交育種工作及其相關研究[3,7-9]。然而，本研究的結論建立在14條ISSR引物對77份(國內76份)不同地區紫云英的150個擴增位點信息的基礎上，供試資源具有一定代表性，但缺少野生資源及相關育種材料親本的重要信息，人為因素(如耕作制度變化、骨干親本選擇)或自然氣候(如歷史氣溫、降水變化等)如何影響紫云英傳播和分化并未明確，不同紫云英種質資源形成的分子生態學原理以及各省對于紫云英種質資源在育種中的應用仍有待深入研究。針對綠肥產業發展，未來應加強起源地科考、人工誘變研究，不斷收集和創制種質資源，配合加代擴繁、快速育種等技術，大量培育適應不同生產需要的綠肥新品種，形成推動綠肥產業發展的“源動力”，更好服務種植業的綠色低碳發展。

4 結論

77份供試紫云英種質資源遺傳相似性系數為0.567 7～0.868 6，既具有豐富的遺傳多樣性，又表現出明顯的分化和地理分割特征。根據引物條帶多態性及其鑒別能力，構建了以P809第3，8，9，10，12，15擴增位點和P886第1，3，5，9，10，11擴增位點為特征的指紋圖譜。以資源所在地區為居群進行群體遺傳變異和結構分析發現，群體分化系數為0.139 3，達到極顯著水平(P< 0.001)，其中河南-安徽-江蘇-上海資源可劃為北方資源群，四川-廣西-湖南-江西資源為西南方資源群，遺傳結構特征在福建發生融合。