狗牙根小尺度克隆多樣性及空間遺傳結構研究

茍甜甜，馬艷娜，吉軼楠，臧國長，鄭軼琦

(河南科技大學園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471000)

“克隆植物”是指在自然條件下能自發地利用根、匍匐莖或橫生根莖等器官產生具有潛在的獨立性個體的植物[1]。在高等植物中，克隆植物占到了35%～80%，并且它們在許多生態系統中處于優勢地位[2]。克隆多樣性是指一個克隆植物種群基株的數量水平，能夠反映該克隆種群的有性繁殖程度以及初始建群種的數量。近年來，國內外學者已經對糙葉苔草(Carexscabrifolia)[3]、劍葉金雞菊(Coreopsislanceolata)[4]、海菖蒲(Enhalusacoroides)[5]、穗狀狐尾藻(Myriophyllumspicatum)[6]、羊草(Leymuschinensis)[7]、竹葉眼子菜(Potamogetonmalaianus)[8]等植物進行了克隆多樣性研究，表明不同植物間克隆多樣性存在著較大差異。

空間遺傳結構(Spatial genetic structure,SGS)[9]，是物種繁育機制、繁殖體的散播方式、克隆繁殖模式、環境異質性等因素共同作用的結果，它反映了植物種群適應環境的能力[10]，有助于理解不同干擾因子對植物種群自然更新、遺傳格局以及種間關系的影響作用[11-12]，因此對克隆植物空間遺傳結構的研究具有重要的意義。李鈞敏等[13]發現3個不同斑塊蛇莓(Duchesneaindica)的小尺度克隆結構差異明顯，是因為其受到環境、干擾、突變等因素的強烈影響造成的。左威等[14]發現在較為單一的生境內，活血丹(Glechomalongituba)采取克隆繁殖的模式，其空間遺傳結構較強；而當生境較為復雜時，活血丹采取種子繁殖的模式，其空間遺傳結構較弱。Rico等[15]研究了放牧對石竹(Dianthuscarthusianorum)空間遺傳結構的影響，發現與未放牧草原上的種群相比，輪流放羊的種群顯示出較弱的空間遺傳結構。Ohsako利用7個微衛星位點，研究了克隆植物篩草(Carexkobomugi)的空間遺傳結構，發現在小距離范圍內篩草的空間遺傳結構顯著正相關，克隆繁殖在一定程度上對空間遺傳結構有很大貢獻[16]。因此，開展對克隆植物在不同生境條件下空間遺傳結構的研究，有助于闡明該克隆植物空間遺傳結構的形成機制。

狗牙根(Cynodondactylon)隸屬于禾本科(Gramineae)，自然條件下以營養繁殖為主[17]。由于其抗逆性強，生命力旺盛，適應性廣，匍匐莖發達，侵占能力強，不僅能運用于園林綠化、固土護坡還可以作為牧草[18-19]。我國狗牙根種質資源豐富,主要分布在我國南方地區，另外華北省份、新疆、青海等地也有分布[20]，其種內變異程度很大[21]。目前，對狗牙根的克隆多樣性和空間遺傳結構等方面研究較少。馬艷娜等[22]對采自不同生境的狗牙根進行了克隆構型和生物量的研究，發現狗牙根種群的克隆構型分為“密集型”和“游擊型”。孫宗玖等[17]對新疆地區的狗牙根無性系構件進行了研究比較，由于原始生境的多樣性,導致狗牙根的表型性狀表現出較大的可塑性。趙玉等[23]發現狗牙根的無性系構件的持續更新主要依靠根莖芽來實現。由于環境異質性會導致克隆植物的無性系構件，為了生存和發展，調整其生殖策略導致克隆多樣性的差異，從而形成不同的空間遺傳結構，因此本研究通過SSR分子標記對3個不同生境的狗牙根進行了克隆多樣性和空間遺傳結構的分析，旨在探討各種干擾和生境異質性對其克隆多樣性及空間遺傳結構的影響，闡明狗牙根在不同生境中的生長繁衍機制，了解狗牙根對環境的適應機理。

1 材料與方法

1.1 取樣方法

在河南省唐河縣境內采集了131份狗牙根材料。樣地概況參見馬艷娜等[22]的報道，具體生境詳見表1。所選樣地的狗牙根種群都呈帶狀分布，在每個樣地的中間位置設置1個160 cm×80 cm的矩形樣方(圖1)，每個樣方都被劃分為20 cm×20 cm的正方形網格，在橫縱線的交點處，選取長勢良好，無病蟲害植株的葉片，編號并記錄每個樣本的空間坐標，將采集的葉片放入裝有變色硅膠的塑封袋中保存備用。

表1 3個狗牙根樣方的生境概況

1.2 總DNA的提取與檢測

采用高效植物DNA提取試劑盒(DP350-02，北京天根生化科技有限公司)提取DNA。所提取DNA的質量用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，DNA的純度和濃度利用紫外分光光度儀(T6新世紀，北京普析通用儀器有限責任公司)進行檢測，并將DNA溶液稀釋至50 ng·μL-1，放置-20℃保存備用。從本實驗室前期已經篩選的狗牙根SSR引物中，選擇多態性豐富、重復性較好、條帶清晰的9對引物(表2)進行分析，引物序列、擴增反應體系以及擴增程序參考Wang等[24]的報道。

表2 本研究所采用的SSR引物

1.3 數據分析

根據產物在電泳圖譜中的位置，有帶記為“1”，無帶記為“0”，得到0/l矩陣。使用R軟件‘Polysat’程序包‘assignClones’功能對數據進行分析，設置閾值，閾值范圍內的個體被分配到同一克隆組[25]。遺傳多樣性等參數如Nei’s遺傳多樣性指數(h)、Shannon’s信息指數(I)、遺傳分化系數(Gst)以及基因流(Nm)使用POPGENE 1.32 軟件[26]獲得。

克隆多樣性水平通過基株總數(G)、平均克隆大小(NC)、基因型比率(PD)、基因型分布的均勻度Fager指數(E)、Simpson多樣性指數(D)這5個參數[27]進行估算。克隆分布范圍通過計算基株數(G)、分株數(ni)、同一克隆內分株間的最大距離(lmax)、最小距離(lmin)、總距離(L)以及平均距離(M)進行分析，其中同一克隆內分株間的總距離為各分株的直線距離之和，平均距離M=L/ni[28]。利用GenAlEx 6.5[29]計算3個樣方中每個分株的遺傳距離矩陣，計算空間自相關系數r，并對遺傳距離和地理距離進行Mantel檢驗[30]。利用SPAGeDi 1.2軟件[31]計算Sp值以進一步量化群體空間結構的水平。參考Erichsen等[32]的報道計算3個樣方的混交度(Mi)。

2 結果與分析

2.1 SSR擴增結果與遺傳多樣性

利用9對SSR引物對采自3個樣方的131份狗牙根材料進行擴增,結果見表3。各遺傳參數表明供試狗牙根材料的遺傳多樣性較為豐富。遺傳分化系數Gst為48.47%，表明48.47%的遺傳變異來自樣方間，51.53%來自樣方內部，樣方內的遺傳分化大于樣方之間。由Gst估算的狗牙根的基因流較小，僅為0.53。

表3 SSR擴增結果及遺傳多樣性

2.2 克隆多樣性與克隆大小

3個樣方的克隆空間分布情況如圖1所示。結果顯示3個樣方都是由多克隆組成，共鑒別出46個基株，其中樣方a共檢測到17個基株，樣方b檢測到22個，樣方c檢測到7個。狗牙根各樣方的克隆多樣性結果見表4，從各項指標反應，供試的3個樣方中，克隆多樣性水平由高到低依次為：樣方b>樣方a>樣方c。

表4 狗牙根3個樣方的克隆多樣性

圖1 狗牙根3個樣方的個體基因型及克隆空間分布

46個基株通過克隆繁殖共形成了84個分株(表5)。分株間的總距離為2340.59 cm，分株間的最大距離為178.89 cm，最小距離為20.00 cm，平均距離為37.10 cm。樣方a的最大克隆有8個分株，分株總數為25，克隆大小為3.13，同一克隆內分株間的最大和最小距離分別為141.42 cm和20 cm，總距離的范圍40.00～161.42 cm，平均距離的范圍為18.54～80.71 cm。樣方b的最大克隆有5個分株，分株總數為22，克隆大小為2.44，同一克隆內分株間的最大和最小距離分別為161.25 cm和20.00 cm，總距離的范圍20.00～217.82 cm，平均距離的范圍為20.00～108.91 cm。樣方c的最大克隆、分株總數、克隆大小均為38，同一克隆內分株間的最大和最小距離分別為178.89 cm和20 cm，總距離為760 cm，平均距離為20 cm。

表5 狗牙根3個樣方內的克隆分株數和分株間的距離

2.4 空間遺傳結構分析

狗牙根3個樣方的空間自相關分析結果如圖2所示。樣方a在空間距離小于20 cm時存在顯著的正空間遺傳結構，在20 cm處空間自相關系數最大(r=0.24)，X-軸截距為47.17 cm。樣方b在空間距離小于50 cm時存在顯著的空間遺傳結構，在40 cm處出現最大空間自相關系數(r=0.22)，X-軸截距為66.27 cm，在空間距離大于50 cm時不存在顯著的空間遺傳結構。樣方c在所研究的距離等級下不存在顯著的空間遺傳結構,X-軸截距為15.26 cm。Mantel檢測表明樣方b(r=0.15，P=0.01)的遺傳距離和空間距離之間存在顯著正相關性，而樣方a(r=0.01，P=0.36)和c(r=-0.04，P=0.21)的遺傳距離和空間距離之間均不相關。

圖2 3個樣方狗牙根的空間自相關分析

利用SPAGeDi軟件進一步量化各樣方的SGS水平，Sp值表明樣方b的空間遺傳結構最強(Sp=0.13)，樣方c的空間遺傳結構次之(Sp=0.12)，而樣方a的空間遺傳結構最弱(Sp=0.06)。

2.5 混交度分析

3個狗牙根樣方混交度在0.37～0.81之間，表明3個樣方中的克隆分布差異較大。樣方a的混交度為0.67，呈現中度混交結構狀態，樣方b的混交度為0.81呈現出強度混交結構，說明樣方a，b狗牙根的分株間競爭激烈，內異質性很強，為游擊性策略。樣方c的混交度為0.37，基株混雜程度較低，邊緣明顯，為密集型策略。

3 討論

3.1 克隆多樣性分析

本研究結果表明，供試狗牙根的克隆多樣性水平高于蛇莓[13](PD=0.20，D=0.64)，也高于Ellstrand等[27]總結的克隆植物的平均值(PD=0.17，D=0.62)，說明供試狗牙根克隆多樣性水平較高。供試的3個樣方中，樣方b的克隆多樣性水平最高(PD=0.50，D=0.95)，樣方a略低(PD=0.41，D=0.92)，樣方c遠低于前2個樣方(PD=0.16，D=0.25)。生境異質性、基因流、體細胞突變、繁育方式、取樣策略等會影響植物的克隆多樣性水平[13,27]。樣方a的狗牙根生長在鄉間小路上，有行人和車輛的踐踏，樣方b位于林緣草地，遮蔭較嚴重，這2個樣方的狗牙根生長環境受到較多的干擾，狗牙根分配更多的資源給有性繁殖，以逃避不良的生存環境，因此樣方內的基株數目較多，克隆多樣性和基因型比例較高。樣方c陽光充足，且無人為干擾，生存環境相對穩定，因此該樣方的狗牙根克隆繁殖比例較高，基株數目少，克隆多樣性較低。Brzosko等[33-34]的研究也表明在干擾生境中，有性繁殖占據優勢，有利于克隆多樣性的提高；而在相對穩定的生境中，植物將更多的繁殖資源分配給無性繁殖，其克隆多樣性水平越低。此外，在3個狗牙根樣方中均存在單個分株組成的克隆，這可能是由于體細胞突變造成的，從而使該植物能夠更好的適應環境[35],李鈞敏等[13]對蛇莓克隆結構的研究中也存在單株組成克隆的現象。

3.2 空間遺傳結構分析

本研究對狗牙根3個不同生境的空間自相關分析，表明a樣方和b樣方分別在20 cm和50 cm處存在顯著性正相關。狗牙根為典型的克隆植物，無性繁殖可以使相同基因型的個體聚集，導致短距離內呈現正的空間自相關，從而對植物種群的空間遺傳結構產生顯著的影響[36-38]。此外，本研究中狗牙根的空間遺傳結構形成距離低于活血丹，左威等[14]認為活血丹較大的空間遺傳結構形成距離可能與其較高的種子萌發率有關，狗牙根種子的萌發率約為48%[39]，遠低于活血丹(79.3%)，可能導致其空間遺傳結構的形成距離較小。3個樣方狗牙根的Sp值存在差異，b(Sp=0.13)、c(Sp=0.12)樣方的狗牙根存在較高水平的空間遺傳結構，而樣方a(Sp=0.06)的空間遺傳結構較弱。小尺度空間遺傳結構存在與否以及空間遺傳結構的強度大小與物種分布的生境、基因流以及外界干擾狀況密切相關[40-41]。樣方c光照、養分等資源充足，不存在任何干擾，克隆繁殖占據優勢，克隆分株呈聚集分布，從而導致小尺度空間遺傳結構較強[42-43]，樣方b較高的空間遺傳結構可能是因為種子傳播受限導致的，在四葉重樓(Parisquadrifolia)空間遺傳結構的研究中也發現種子傳播受限導致了其較強的空間遺傳結構[44]，而樣方a由于人類和動物的頻繁活動，導致種子的有效傳播距離增加，從而削弱了其空間遺傳結構的強度。

3.3 混交度分析

混交度反映了基因型之間的聚集程度，如果各基因型個體在樣方里各自聚集，不同基因型之間沒有交集，邊緣明顯，混交度低，則為密集型生長策略；如果各基因型個體相互混雜，混交度高，則為游擊型生長策略[45]。Erichsen等[32]利用9對微衛星標記對小葉椴(Tiliacordata)克隆結構進行了研究，其混交度為0.48～0.58，居群內不同的基因型處于混合狀態，并采取游擊型的生長策略。本研究中a，b樣方處于中強度混交結構(Mi>0.5)，說明樣方內基因型混雜程度較高，這是因為2個樣方的生境均受到了不同程度的干擾，如遮蔭、車輛碾壓以及人類踐踏，狗牙根通過克隆整合，呈現出游擊型生長策略，樣方內的狗牙根表現出強烈的覓食反應[1]，該生長策略便于對分散分布資源的獲取和利用，從而占據更多的生存空間，獲取更多的資源。樣方c的混交度較低，同一基因型聚集較多，這是因為樣方c光照充足，并靠近農田，環境條件較好，狗牙根呈現出密集型的生長策略[1]，該生長策略對獲取集中分布的資源占優勢。

4 結論

本研究應用9對SSR引物分析了3個不同生境小尺度格局狗牙根的克隆多樣性和空間遺傳結構，發現供試3個樣方的狗牙根材料克隆多樣性較高，空間遺傳結構與繁育方式、人為干擾以及生境異質性密切相關，同時，狗牙根可采取不同的克隆構型來應對異質性生境。因此，本研究對了解狗牙根進化潛力、生態適應性機制以及生態穩定性的維持能力等方面具有十分重要的意義。