美洲狼尾草組織培養再生體系的建立

范欲航，許 悅，祝詩詞，王凈潔，賈紀原，黃琳凱

(四川農業大學草業科技學院，四川 成都 610000)

美洲狼尾草(Pennisetumglaucum)，一年生禾本科植物，又名珍珠粟、御谷，是一種優質的牧草資源，其原產地位于非洲中部熱帶地區，具有生長速度快、莖葉產量高、營養成分豐富、適應性廣、家畜適口性好、抗旱能力強、抗逆性高等特點，非常適合在高溫、干旱、鹽堿的地區種植[1]。美洲狼尾草的價值主要體現在作為糧食作物、飼草作物生產和能源牧草利用等方面，世界范圍內均有相關記載其在糧飼領域中的作用，例如撒哈拉沙漠以南和印度次大陸以北的干旱貧困地區以美洲狼尾草的籽實作為主要口糧，種植面積達到3 100萬公頃[2-3]；北美洲與澳洲部分干旱地區將美洲狼尾草制成青貯飼料喂養家畜[4];在我國北起黑龍江、南至海南的一定區域內也引進了美洲狼尾草進行牧草生產[5];在張建麗等人的研究中發現狼尾草屬的作物具有高效生產乙醇的能力，可開發作為能源作物[6]。

我國美洲狼尾草的育種研究仍處于起步階段，相較于傳統的育種方式，結合轉基因的現代育種更能促進該牧草作物在我國的發展。現代分子育種在主要糧食作物與牧草作物上的應用已經相對成熟，例如抗除草劑小麥、抗蟲害玉米和抗葉斑病苜蓿等優良轉基因品種的創制[7-9]，而大部分的轉基因工作基于組培再生體系的構建，所以構建美洲狼尾草組培再生體系對于該牧草的育種工作具有很大意義。

以往的研究通常使用植物的器官、組織、胚胎或細胞進行離體培養，在給予一定的培養條件后可以促使外植體再生為愈傷組織和叢生芽，最終形成完整的植株，這依賴于植物的全能性[10]，而在培養過程中需要考慮污染、誘導和分化三個因素[11-12]，其中污染問題是需要最優先解決的，因為微生物在培養基中產生的霉變、毛囊狀、渾濁的污染痕跡會影響組培材料的良好保存與進一步生長[11]，所以通常采用例如NaClO、乙醇等殺菌劑清理外植體，減少污染狀況。愈傷組織的誘導與分化是外植體完成再生的兩個重要過程，由外植體被誘導形成愈傷組織再由愈傷組織分化形成叢生芽，外源激素在培養基中的組合與濃度搭配是促進誘導與分化的關鍵[12]，生長素類型的植物激素對愈傷組織細胞的分裂具有明顯促進作用，同時在細胞分裂素/生長素比例較高時會促進叢生芽的生長[12]。本試驗通過不同消毒方式與多種激素組合對美洲狼尾草的幾種外植體進行處理，探究由外植體發育為再生植株的有效方式，構建美洲狼尾草的組培再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為美洲狼尾草‘斗牛’的種胚、幼葉、幼穗和莖節，外植體材料均采自四川農業大學崇州試驗基地；種胚的收獲時間為2021年7月中旬，4℃低溫干燥貯存，幼葉、幼穗和莖節的采集時間為2021年7月至8月。

1.2 試驗方法

1.2.1外植體的選擇與消毒處理 本試驗以美洲狼尾草的種子、幼葉、幼穗、莖節為外植體。挑選成熟且顆粒飽滿的美洲狼尾草種子，用清水沖洗30 min備用；將出苗3-4天的美洲狼尾草子葉切割為長寬約2 mm的小段備用；將灌漿期的美洲狼尾草幼穗切下并分割為長度約5 mm的小節備用；將美洲狼尾草節上分生區的組織切割為長寬高約2 mm的顆粒備用；對所有外植體均使用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗5次，再分別用升汞(0.1%HgCl2)與3%，5%，7%NaClO浸泡一段時間，時間設置為5 min，10 min，15 min，繼續用無菌水沖洗5次。消毒完成后即可接種于誘導培養基中誘導愈傷組織。

1.2.2愈傷組織的誘導 將不同外植體接種于愈傷組織誘導培養基上，愈傷組織誘導培養基配方為MS+2,4-D(1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，3.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1，5.0 mg·L-1)+6-KT(0.1 mg·L-1，0.5 mg·L-1，1 mg·L-1，2 mg·L-1，4 mg·L-1)+6-BA(0.1 mg·L-1，0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH=5.8，121℃滅菌20 min，每份培養基接種外植體15粒，設置三種植物激素的濃度梯度并做5個重復，找出誘導率最高的激素配比。在誘導培養基中每培養14 d進行一次繼代，繼代兩次后將愈傷組織轉移至分化培養基中。

1.2.3愈傷組織的分化 將愈傷組織轉移至分化培養基之前需要切除原本的外植體部位，只轉移愈傷塊，分化培養基配方為MS+6-BA(1.0 mg·L-1，2.0 mg·L-1，3.0 mg·L-1，4.0 mg·L-1，5.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1，1.0 mg·L-1，1.5 mg·L-1，2.0 mg·L-1，2.5 mg·L-1)+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8，每份培養基接種愈傷塊10粒，設置兩種植物激素的濃度梯度并做5個重復，找出再生率最高的激素配比。在誘導培養基中每14 d進行一次繼代，直至再生苗生長高度達到5 cm以后轉入生根培養基中生根。

1.2.4生根與再生植株的移栽 生根培養基配方為1/2MS+3%蔗糖+1%瓊脂，生根培養基中培養20天后移栽至混合土(營養土∶蛭石=2∶1)中完成再生。

1.2.5評價指標 外植體污染率=污染的外植體數量/外植體接種數量×100%；

愈傷組織誘導率=愈傷組織數量/(外植體接種數量污染的外植體數量)×100%；

愈傷組織分化率=愈傷組織再生數量/愈傷組織接種數量×100%。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方式對外植體污染的影響

結果表明，消毒過后的污染率都有所下降，其中種子在不同消毒方式處理后的污染率具有顯著差異。如表1所示，隨著消毒液濃度和消毒時間的增加，大多數外植體的污染率會隨之降低，相較于種子和幼葉，幼穗和莖節外植體經過高濃度與長時間的消毒液浸泡仍然有較高的污染率，其中種子在5%和7%的次氯酸鈉中消毒5～15 min，其污染率降低為1.33%，在升汞中消毒15 min能夠將污染率降低至0；幼葉、幼穗和莖節外植體最佳的消毒方式為升汞消毒10～15 min，其中幼葉在升汞中消毒10 min能夠將污染率降低至0。

表1 幾種外植體在不同消毒方式下的污染率

2.2 不同消毒方式對種子發芽率的影響

在培養過程中我們發現種子的發芽率會影響其誘導率，于是在進一步的工作中測量了不同消毒方式對發芽率的影響。結果表明，高濃度的消毒試劑會明顯降低種子的發芽率，其中升汞處理10～15 min與NaClO處理10～15 min后種子的發芽率具有顯著差異。如表1所示，5%，7%次氯酸鈉與升汞消毒都可有效降低外植體在培養基中的污染率，雖然升汞消毒15 min能夠將污染率降低至0，但是會影響種子的發芽率，如表2所示，升汞消毒15 min后發芽率降低至26.67%。而5%次氯酸鈉消毒種子5 min后在保持較低污染率的同時又具有較高的發芽率，其發芽率為86.67%。

表2 不同消毒方式對種子發芽率的影響

2.3 不同誘導培養基激素配比對愈傷組織誘導的影響

污染問題使我們放棄了幼穗誘導愈傷組織的工作，在此階段對種子、幼葉與莖節進行培養。結果表明，不同植物激素對愈傷組織的誘導率具有顯著差異，如表3所示，在誘導培養基中添加3 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-KT種子外植體的誘導率最高，達到93.33%，同時發現添加0.1 mg·L-16-BA后愈傷組織的最高誘導率沒有明顯變化，誘導率仍然為93.33%，但是愈傷組織的顏色由整體的黃褐色轉變為黃白色，美洲狼尾草不同顏色的愈傷組織如圖1所示。幼葉與莖節的誘導率為0(在多種激素組合中均為0，未放于圖中)，如圖2所示，誘導培養基中培養了30 d后的幼葉、莖節均無愈傷組織的形成。得出結論以種子為外植體可高效誘導愈傷組織的形成。

圖1 誘導培養基培養30 d后愈傷組織呈現的4種不同顏色

圖2 誘導培養基培養30 d后愈傷組織的誘導情況

表3 不同濃度6-BA，6-KT與2,4-D組合對種子愈傷組織誘導率的影響

2.4 不同分化培養基激素配比對愈傷組織分化的影響

愈傷組織于誘導培養基中培養42 d(2次繼代)后，于無菌工作臺中剪去原生的胚芽與胚根，然后接種至分化培養基中，如表4所示，在分化培養基中加入1 mg·L-1NAA，3 mg·L-16-BA愈傷組織的分化率最高，其分化率為81%。分化率的評判標準為產生再生苗的愈傷組織數量，如圖3 d所示，再生苗由愈傷組織切去原生胚芽附近的胚性愈傷組織產生，胚性愈傷組織的顏色由黃白色轉變為綠色，同時形成不定芽，如圖4 d所示，不定芽的生長形態為厚實顏色偏綠的葉片，與原生胚芽細長單薄的葉片不同。如圖3e所示，胚性愈傷組織經過分化培養基培育21 d后形成了密集的再生芽叢。

表4 不同濃度NAA與6-BA組合對愈傷組織分化的影響

圖3 美洲狼尾草愈傷組織分化再生過程

2.5 再生苗的生根與移栽

如圖3f所示，將分化21 d后的芽叢接種到1/2MS生根培養基中再培養20 d即可移土栽培，如圖3 h所示，分化形成的叢生芽發育形成了一簇茂盛的美洲狼尾草株系，完成了由愈傷組織再生為完整植株的過程。

3 討論

3.1 外植體的選擇與消毒處理

據報道，外植體的生理狀態、再生功能不同將影響愈傷組織的形成[13]，而在許多雙子葉植物的外植體再生研究中，為了驗證植物的全能性，通常以植物的器官誘導愈傷組織，例如煙草(Nicotianatabacum)的組織培養選用葉片為外植體[14]，建立番茄(Lycopersiconesculentum)的再生體系選用莖段為外植體[15]。在外植體的選擇上單子葉植物與雙子葉植物有一定差別，禾本科在構建組培再生體系時常常選用種子、幼穗作為外植體，例如鴨茅(Dactylisglomerata)以幼穗為外植體，柳枝稷(Panicumvirgatum)以種子、幼穗為外植體均成功誘導出胚性愈傷組織并形成再生苗[16-19]，這或許與單子葉植物器官的分化程度有關，較高的分化程度會增加器官脫分化的難度，所以需要選用具有一定胚性的外植體來構建其再生體系，本試驗選用具有一定胚性的外植體種胚、幼穗與胚性較弱的幼葉和莖段作為外植體，初步驗證了美洲狼尾草在構建組培體系時需要依靠外植體本身的胚性。

在消毒過程中發現種子的消毒效果比較好，NaClO與升汞處理后都可有效的降低污染率，但是結合兩種消毒方式對種子發芽率的影響，最終選擇5%NaClO消毒5 min的消毒方式，而在其他外植體中升汞的消毒效果要明顯高于NaClO，但是并未探索到對于其他外植體誘導愈傷組織的有效方法，所以對于升汞對其他外植體的誘導過程是否有影響還需要進一步的研究與驗證。

3.2 不同激素配比對種子愈傷組織誘導的影響

2,4-D是一種生長素類似物，常常作為組織培養中愈傷組織誘導的外源激素，在誘導外植體脫分化的過程中環境內的生長素與細胞分裂素比例升高會促進外植體的脫分化并形成愈傷組織[20]，以2,4-D為單一變量在僅有這一種外源激素的誘導培養基中篩選出誘導率相對較高的激素配比即3 mg·L-1，其誘導率為 44%。通過篩選出單一變量的最佳效果，并在此基礎上添加其他植物激素進行優化可以增加篩選效率并降低工作難度。KT是一種天然植物內源激素，外源添加可以發揮細胞分裂素的性能，可以調節培養基內生長素與細胞分裂素的比值進而影響外植體的脫分化，在許多組織培養體系中常使用2,4-D與KT搭配來誘導愈傷組織的形成[20-23]。因此以3 mg·L-12,4-D的MS培養基為基礎逐量添加KT來篩選更高誘導率的植物激素配比，試驗結果也證實了這種篩選方法，1 mg·L-1KT+3 mg·L-12,4-D的MS培養基其對種胚發育形成愈傷組織的誘導率達到93%，是僅添加2,4-D誘導率的兩倍。6-BA是一種人工合成的類細胞分裂素，在組織培養中可以起到提高愈傷質量與增加誘導率的作用，所以進一步的以1 mg·L-1KT+3 mg·L-12,4-D的MS培養基為基礎逐量添加6-BA，我們觀察到在加入0.1 mg·L-16-BA中愈傷組織的整體顏色由黃褐色轉變為黃白色，這減緩了愈傷組織的褐化速度，加入6-BA后并沒有明顯增加誘導率但是提高了胚性愈傷組織分化前的愈傷質量，更利于再生苗的分化。

在整個試驗過程中我們發現單一的外源激素2,4-D其實并不能達到很好的誘導效果，而在逐步添加激動素KT后愈傷組織的誘導率明顯增加，這體現了不同類型的外源激素搭配在愈傷組織的形成過程中發揮著重要作用。針對于狼尾草屬作物的組培研究，或許可以參考以上方法嘗試添加多種激素類型的組合，例如添加激動素、細胞分裂素等配合生長素共同促進愈傷組織的形成，能夠有效的找出不同品種狼尾草屬作物的組培方式。

3.3 不同激素配比對胚性愈傷組織分化的影響

在誘導愈傷組織分化的過程中需要促進植物細胞的再分化，因為細胞分裂素可以促進愈傷組織向再生植株的方向發展[22]，所以需要使得培養基內細胞分裂素的比值高于生長素，6-BA與6-KT均為細胞分裂素類型的植物激素，但是相較而言6-BA具有誘導不定根與不定芽的能力[24-25]，所以采用6-BA作為外源激素來增加分化環境內細胞分裂素的含量。在僅加入3 mg·L-16-BA的MS培養基愈傷組織的分化率明顯增加，分化率達到55%，是空白組分化率的10倍。NAA是一種人工合成的類生長素類物質，在許多組培分化試驗中常常作為促進分化的植物激素來添加，在本試驗中以3 mg·L-16-BA的MS培養基為基礎逐量添加NAA，篩選出分化率較高的激素配比，最終試驗結果顯示3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA的MS培養基對胚性愈傷組織分化形成再生苗的分化率影響最大，分化率達到81.4%。

因為分化試驗使用的胚性愈傷組織是以美洲狼尾草的種胚誘導形成的，而種胚本身會發育原生的胚芽與胚根，所以在分化階段為了區分原胚芽與再生的不定芽需要在接種前切去原生胚芽與胚根，成功分化的胚性愈傷組織會形成密集的不定芽芽叢，這些芽叢呈現為顏色深綠葉片厚實的形態，每個芽叢發育后可形成15-25株美洲狼尾草個體，此外我們發現在不添加外源激素的MS培養基中胚性愈傷組織原生胚芽的部位會繼續延伸，這樣形成的再生植株不會產生不定芽的芽叢，可視為由原生胚芽發育而來的植株，不計入分化再生數量。本試驗中選用1/2MS培養基作為生根培養基,并未添加額外的添加物來促進生根,一方面是因為1/2MS本身具有促進植物生根的能力,另一方面是美洲狼尾草的生根能力比較強[26-28]。

綜上通過選用的種子外植體，我們誘導出了美洲狼尾草的胚性愈傷組織，并促使此愈傷組織分化成為可自然生長的植株，在此過程中產生的愈傷組織材料和叢生芽對于美洲狼尾草的遺傳轉化研究與育種擴繁建立了基本體系。

4 結論

美洲狼尾草‘斗牛’能夠以種胚為外植體進行組織培養再生并形成再生植株，使用5%NaClO消毒 5 min可降低污染率同時保證發芽率不受消毒液影響，污染率為 1.33%，發芽率為86.67%，以MS+3 mg·L-12,4-D+1 mg·L-16-KT+0.1 mg·L-16-BA作為愈傷組織誘導培養基可高效誘導愈傷組織的形成，誘導率為93.3%，以MS+3 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA可促進美洲狼尾草胚性愈傷組織的分化，分化率為81.4%。