低磷脅迫對紅豆草光合、葉綠素熒光及內源激素的影響

陳 潔，南麗麗，汪 堃，夏 靜，何海鵬，馬 彪，姚宇恒

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

磷是植物生長必需的營養元素，在植物細胞的伸長和分裂，能量代謝、細胞膜的合成等方面起著重要作用[1]。土壤中磷含量大，但磷酸鹽離子易與金屬離子結合，植物無法直接吸收利用，限制其生長發育[2]。生產中增施磷肥能提高產量，但大量施用磷肥會造成土壤污染、水體富營養化，給生態系統帶來危害[3]。

光合作用是植物物質能量來源的關鍵代謝過程[4]，其效率體現植物的各種生理狀況，在逆境下，植物抗逆性和生長狀況會發生變化，光合效率會隨之變化[5]。低磷脅迫限制植物干物質積累的主要原因是葉片光合速率下降[6]。有研究表明，缺磷能降低植物葉片的凈光合速率、氣孔導度及葉綠素含量，導致光合作用的減弱[7-9]，葉綠素參數的變化體現植物葉片光合作用的CO2同化、原初反應和電子傳遞過程，表現植物對光能的吸收、傳遞、分配和消耗等特點[10-11]。研究發現，在低磷脅迫下，玉米(Zeamays)葉片葉綠素熒光參數(FV/FM)、PSⅡ的光能轉換和利用效率均降低[8,12]；在磷鋁脅迫下，杉木(Cunninghamialanceolata)幼苗會降低PSⅡ反應中心的光化學活性和電子傳遞效率，降低植物對光能的利用率，最終抑制植物生長[5]。

植物內源激素是廣泛存在于植物體內調控自身生理代謝的活性物質，不僅影響植物生長發育，而且在植物逆境脅迫中起調控作用，主要包括脫落酸(Abscisic acid，ABA)，生長素(Auxin，IAA)，赤霉素(Gibberellin，GA3)，細胞分裂素(Cytokinin，CTK)、乙烯(Ethylene，ET)、獨角金內酯等(Strigolactones，SLs)[4,13]。植物在逆境脅迫條件下，一般通過體內激素的變化來適應養分缺乏的環境[14]。研究表明，隨著供磷水平的降低，大麥(Hordeumvulgare)根和葉中CTK含量減小，IAA含量增加，在脅迫初期GA3含量增幅比較大，ABA變化不明顯[15]，陳潔等[16]研究發現不同磷利用效率自交系玉米的內源激素含量在低磷脅迫下表現出規律性變化，如IAA，ABA和GA3含量均增加，而ZT含量下降，因此，內源激素含量變化可作為鑒定玉米自交系磷高效的參考指標。符云鵬等[17]研究表明，在低磷脅迫下，煙草(Nicotianatabacum)根系活力活性降低，CTK含量減少，根和葉中IAA含量增加。陳智裕等[18]研究發現，在低磷條件下，磷低效杉木幼苗葉片內IAA和ZT含量顯著高于磷高效的杉木幼苗，與常磷相比較，不供磷條件下根系內ZT含量顯著降低，IAA和ABA含量則顯著增加，磷高效的杉木幼苗根系ABA含量顯著高于磷低效幼苗根系的任意供磷水平。

紅豆草(Onobrychisviciaefolia)是多年生豆科草本植物，具有耐寒、抗旱、耐貧瘠、適口性好等優點，含有豐富的蛋白質、粗脂肪、氨基酸、單寧、鈣和磷含量[19-20]。目前有關低磷脅迫對紅豆草內源激素含量變化的研究少見報道。因此，本研究以磷敏感和耐低磷紅豆草為試驗材料，對低磷脅迫下紅豆草光合作用、葉綠素熒光參數和內源激素含量變化規律進行探討，揭示紅豆草對低磷脅迫逆境響應的調控機制，為選育耐低磷紅豆草品種、提高紅豆草抗性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以前期篩選出來的耐低磷紅豆草5號和磷敏感紅豆草1號為試驗材料，由農業部全國畜牧獸醫總站牧草種質資源搜集保護項目協作組從俄羅斯瓦維洛夫植物基因庫引進[21]。

1.2 試驗設計

試驗于2021年3月24日在甘肅農業大學植物生長室進行，選用消毒后的細沙(121℃，高溫滅菌30 min)1 000 g裝入花盆中(外口徑、內口徑、高和底徑分別為13.2 cm，12 cm，14 cm和9.2 cm)，經HgCl2消毒后的種子均勻撒播于花盆中，并覆沙3～4 cm，出苗后進行間苗，每盆保留生長一致、分布均勻的幼苗15株，每2 d澆灌150 mL Hoagland營養液，待幼苗生長至第60 d進行脅迫處理，用KCl平衡調整K+。采用兩因素試驗設計，因素A為2份紅豆草材料，因素B為磷脅迫處理，即常磷處理(1.00 mmol·L-1KH2PO4，NP)和低磷處理(0.01 mmol·L-1KH2PO4，LP)[22]，分別在處理0 d，6 d，12 d，18 d，24 d后測定株高、葉面積、葉綠素含量、光合作用和葉綠素熒光，并在處理0 d，12 d和24 d后分別采樣，測定葉片和根系內源激素含量。

1.3 測定指標及方法

1.3.1形態指標測定 株高(Plant height，PH)采用卷尺測量；葉面積(Leaf area，LA)采用LI-3000C葉面積儀測定，取從植株頂端依次向下數的第3個葉片，每個處理重復10次。

1.3.2葉綠素含量測定 稱取0.5 g新鮮葉片，放入裝有 2 mL無水乙醇和 2 mL 80% 丙酮離心管中，然后在 4℃培養箱避光保存24 h提取葉綠素，參考鄒琦[22]的實驗方法，測定葉綠素a(Chlorophyll a，Chl a)、葉綠素b(Chlorophyll b，Chl b)、葉綠體色素(Chlorophyll pigment，Cp)含量，每個處理3個重復。

1.3.3光合參數測定 光合參數采用LI-6400便攜式光合儀(LI-COR，USA)測定，儀器為開放式氣路，空氣CO2濃度為400 μmol·mol-1，設定光合有效輻射強度為1200 μmol·m-2·s-1，每株選取中上部3片葉，測定葉片氣孔導度(Stomatal conductance,Gs)、胞間CO2濃度(Intercellular carbon dioxide concentration,Ci)、凈光合速率(Net photosynthetic rate,Pn)和蒸騰速率(Transpiration rate,Tr)等葉片氣體交換參數，瞬時水分利用效率(Water use efficiency，WUE)=Pn/Tr，每個處理3個重復。

1.3.4葉綠素熒光測定 于晴天9∶00—11∶00，采用便攜式葉綠素熒光儀PAM-2100 對葉片進行測定。測定時，選擇測定光合指標的葉片，黑暗環境適應20 min，參考張翠梅等[23]方法測定并計算PSⅡ最大光合效率(PSⅡ maximum photochemical efficiency,Fv/Fm)，PSⅡ潛在光化學效率(PSⅡ potential activity,Fv/Fo)，PSⅡ光化學量子產量Yield，表觀電子傳遞效率ETR，光化學淬滅系數(Photochemical quenching,qP)和非光化學淬滅系數(Non-photochemical quenching coefficient,qN)，每個處理3個重復。

1.3.5內源激素測定 采樣后將樣品用液氮速凍，存放于超低溫冰箱。測定時參考汪堃等[24]的方法，將凍樣研碎，加預冷的80%的色譜甲醇，浸提24 h并離心，吸取上清液，濃縮近干，用50%的甲醇沖洗蒸發瓶瓶壁，最后定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，于四元梯度超快速液相色譜儀Waters Arc-2998 PDA Waters(沃特世公司，美國)進樣，測定根系和葉片的IAA，GA3，ABA和ZT含量，每個處理重復3次。

1.4 數據統計分析

用Excel 2019處理數據。分別計算1號和5號材料的株高、葉面積、Chl a，Chl b，Cp，Gs，Ci，Pn，Tr，WUE，Fv/Fm，Fv/Fo，Yield，ETR，qP，qN和地上、地下部IAA，GA3，ABA和ZT的耐低磷系數，即耐低磷系數=低磷處理下性狀測得值/常磷處理下性狀測得值[21]，相對值可消除材料間固有的差異，能準確反映不同材料耐低磷性。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫對紅豆草形態指標和葉綠素含量的影響

由表1可知，低磷脅迫下，耐低磷5號和磷敏感1號紅豆草材料的PH和LA的耐低磷系數呈下降趨勢，其變化范圍分別為0.889～0.998和0.909～0.994，0.679～1.025和0.729～0.954；5號和1號的Chl a，Chl b和Cp耐低磷系數變化范圍分別是0.669～1.095和0.618～1.008，0.767～0.988和0.671～1.269，0.700～1.058和0.635～1.053，隨著脅迫天數的延長，耐低磷系數降低，表明在低磷脅迫下，2份供試材料的葉綠素含量均降低。

表1 低磷脅迫對紅豆草形態指標和葉綠素含量耐低磷系數的影響

2.2 低磷脅迫對紅豆草光合生理指標的影響

由表2可知，5號和1號材料Tr，Gs，Pn的耐低磷系數隨著脅迫時間的延長而降低，變化范圍為0.540～1.008和0.578～0.986，0.561～1.053和0.601～0.952，0.613～0.948和0.641～1.019，表明兩份材料通過閉合葉片部分氣孔，抑制CO2的獲取，減少水分蒸發和降低Gs來適應逆境脅迫。WUE是植物對脅迫環境的自我保護機制[25]，隨著低磷脅迫時間的延長，2份供試材料的Ci和WUE耐低磷系數增大，在脅迫24 d時，耐低磷5號材料的WUE較磷敏感1號材料大，表明脅迫時間越長，5號紅豆草適應能力更強。

表2 低磷脅迫對紅豆草光合生理指標耐低磷系數的影響

2.3 低磷脅迫對紅豆草葉綠素熒光參數的影響

由表3可知，5號和1號紅豆草的Yield，qP，ETR，Fv/Fo，Fv/Fm的耐低磷系數均隨著脅迫天數的延長而降低，其變化范圍分別為0.548～1.039和0.513～1.038，0.692～0.965和0.784～0.988，0.518～1.027和0.470～0.972，0.577～1.205和0.519～1.100，0.801～1.067和0.759～1.043，表明兩份材料PSⅡ反應中心的開放程度變小，光合電子傳遞速率變慢，光化學效率降低，植物體內發生了光合作用的光抑制現象[25]；qN的耐低磷系數的變化范圍是0.970～1.417，除低磷脅迫0 d外，2份供試材料qN耐低磷系數均大于1，表明以熱形式耗散掉的能量隨著脅迫的加劇而增多，且磷敏感1號材料qN大于耐低磷5號材料，表明1號材料較5號材料耗散的能量多。

表3 低磷脅迫對紅豆草葉綠素熒光參數耐低磷系數的影響

2.4 低磷脅迫對紅豆草內源激素含量及其比值的影響

由表4可知，耐低磷5號紅豆草和磷敏感1號紅豆草地上部ZT耐低磷系數的變化范圍分別是0.704～1.032和0.536～0.974，地下部變化范圍分別是0.989～1.712和0.939～1.536，GA3地上部耐低磷系數的變化范圍分別為0.467～0.923和0.564～1.033，地下部變化范圍分別是1.033～1.596和1.047～1.392，ZT和GA3地上部耐低磷系數隨著磷脅迫時間的延長而降低，而地下部相反；IAA地上部的變化范圍分別是0.620～1.014和0.544～1.061，地下部變化范圍分別是0.712～1.252和0.644～1.309，IAA耐低磷系數隨著磷脅迫的加劇減小，地下部表現為先增加后降低趨勢，表明低磷脅迫抑制兩份材料IAA的合成；ABA地上部的耐低磷系數分別是1.025～1.291和1.061～1.206，地下部變化范圍分別為1.046～1.346和1.075～1.251，低磷脅迫下，地上和地下部ABA表現為升高趨勢，ABA具有抑制植物生長的作用，在低磷脅迫下，2份供試材料的生長均受到抑制，脅迫24 d時，5號材料地上和地下部ZT，IAA和ABA耐低磷系數均大于1號材料。

表4 低磷脅迫對紅豆草內源激素及其比例耐低磷系數的影響

2份供試材料的IAA/ABA的耐低磷系數隨著磷脅迫天數的增加而下降，且5號材料耐低磷系數大，在低磷脅迫下，耐低磷5號材料和磷敏感1號紅豆草地上部ZT/ABA的耐低磷系數下降，地下部系數上升，表明在低磷脅迫下，兩份材料葉部ABA含量積累速度更快，而地下部ZT含量占優勢；(IAA+GA3+ZT)/ABA耐低磷系數的變化范圍是0.450～1.009和0.906～1.087，地上部的變化為降低趨勢，地下部表現為增加，且5號比1號耐低磷系數大。

2.5 性狀的相關性分析

由表5可知，各指標間均存在相關性，但其顯著性不同。Chl a,Chl b與光合作用和株高呈顯著或極顯著相關，除Ci,WUE和qN外，ABA與Pn,Gs,Tr呈負相關，IAA與光合指標和葉綠素熒光呈顯著正相關，ZT、GA3與光合和葉綠素熒光呈正相關，光合作用與葉綠素熒光呈顯著或極顯著相關。

表5 低磷脅迫下各指標的相關性分析

3 討論

3.1 低磷脅迫對紅豆草形態指標、光合作用和葉綠素熒光的影響

磷是植物生長發育不可缺少的營養元素，可參與植物發生一系列生理生化過程[26]，本研究中，低磷脅迫下5號和1號紅豆草的株高和葉面積均明顯受到抑制，表明缺磷會抑制植物的正常生長，這與董秋平等[27]、任立飛等[29]對大豆和玉米的研究結果一致。

葉綠素是參與植物光合作用的色素分子，起到攝取外界光源的作用，參與光合作用中光能的吸收、傳遞和轉化[29]。本研究中，在低磷脅迫下，5號和1號紅豆草Chl a,Chl b,Cp含量的耐低磷系數均呈降低趨勢，其脅迫時間越長，降幅越大，且磷敏感材料1號的葉綠素含量降幅較大，表明較低的磷供應量導致紅豆草葉片葉綠素合成降低，光合作用無法充分進行，體內物質累積減少[12]。低磷脅迫會破壞植物葉肉細胞，關閉部分氣孔，抑制與光合反應相關的酶活性，降低植物光合速率[12]。葉綠素含量與植物光合速率在一定范圍內成正相關，其含量的高低可直接體現植物葉片的光合能力[30]。本研究發現，低磷脅迫下，2份供試紅豆草的Pn，Tr，Gs的耐低磷系數均下降，且隨著脅迫程度的加劇，降幅顯著增大，因為缺磷環境降低紅豆草幼苗體內的磷素積累，導致葉片中光合色素和光合過程中相關酶的分配減少，從而降低植物光合速率，脅迫24 d時，耐低磷5號材料的Pn，Tr，Gs耐低磷系數均小于磷敏感1號材料；WUE反映了植物對水分的利用情況，其值大小能直接體現植物對環境的適應[25]，在本試驗中，低磷脅迫下，2份紅豆草均通過提高WUE來適應低磷脅迫。

本研究中，在低磷脅迫下，耐低磷5號紅豆草和磷敏感1號紅豆草的Yield，qP，ETR，Fv/Fo和Fv/Fm的耐低磷系數均下降，qP能反映PSⅡ反應中心的開放程度[27]，低磷脅迫時間越長，PSⅡ反應中心開放的比例越小，傳遞的電子數量越少，同時在單位時間內，光合電子傳遞速率越慢[31]，Fv/Fo和Fv/Fm耐低磷系數隨著脅迫天數的增加而減小，且5號材料較1號降幅小，說明1號光能吸收轉化機構的完整性遭受更嚴重的破壞，影響光化學效率[5]。在本研究中，qN耐低磷系數隨著脅迫天數的增加而增加，耐低磷5號材料qN較磷敏感1號小，因為qN是植物抵御過量光能傷害，保護光合機構而形成的機制，反映了PSⅡ天線色素吸收而沒有被用于光化學反應，表明1號紅豆草以熱的形式耗散掉的能量更多[27,32]。

3.2 低磷脅迫對紅豆草內源激素含量的影響

內源激素作為植物體內微量活性物質，含量較低，參與調節植物體內多種生理過程[33]，不同內源激素之間協同或拮抗是調控植物適應逆境脅迫時的重要生理過程[34]。吳愛萍等[35]研究表明，在低磷條件下植物激素直接參與植物生長、發育的調控；惠乾龍等[36]研究表明，低磷脅迫下，植物體內GA3與ABA的合成、積累會顯著增加，因植物在遭受低磷脅迫時，會誘導轉錄因子來刺激GA3合成；ABA會影響磷酸信號傳導通路，從而影響植物本身的磷吸收[37]，在擬南芥[38]、玉米[39]等作物中，低磷處理使植物的CTK含量顯著下降。本研究發現，隨著低磷脅迫時間延長，耐低磷5號紅豆草和磷敏感1號紅豆草地上部IAA的耐低磷系數隨著磷脅迫的加劇減小，地下部表現為先增加后降低，且磷敏感1號紅豆草降幅顯著，這可能是因為IAA響應基因表達量在低磷情況下普遍下調[37]，而磷敏感紅豆草更易感知外界變化，故1號材料變化更顯著。GA3能夠促進細胞生長以及葉和根的發育，可通過影響根細胞的伸長來促進植物根系生長[40]，本研究中，隨磷脅迫的加劇，各供試材料地下部GA3耐低磷系數隨著磷脅迫時間的延長而增高，可能是GA3作為植物生長的負調控信號，減緩植物生長，以此減緩逆境傷害[24]。地上和地下部ABA耐低磷系數均隨著脅迫程度的加劇而增高，且耐低磷5號材料的增幅大，這是因為ABA調控氣孔開閉和光合產物運輸，誘導抗逆系統的啟動和表達，低磷處理促進ABA的合成與積累[41]，兩份供試紅豆草地上和地下部的ZT含量均呈現增加趨勢，ZT作為CTK的一種，可能在適應低磷脅迫的過程中對植物發揮正調控作用，因此低磷脅迫下植物根系ZT的含量會顯著上升。

各激素間含量的平衡在細胞體積增大、分裂增殖和營養物質充實等過程中發揮著重要的作用[42]。IAA/ABA，ZT/ABA，(ZT+IAA+GA3)/ABA比值能體現植物的生長發育狀況[43]。王得運等[44]研究表明梔子(GardeniajasminoidesEllis)在遭受脅迫后IAA/ABA，ZT/ABA比值隨著脅迫時間增加而逐漸下降，并且降幅較大。在本研究中，耐低磷5號紅豆草和磷敏感1號紅豆草地上部IAA/ABA，GA3/ABA，(ZT+IAA+GA3)/ABA比值均隨低磷脅迫時間增長呈降低趨勢，遭受低磷脅迫后，ABA在器官衰老、葉片脫落的地上部大量合成，導致植物處于緩慢發育或休止狀態[43]；而地下部(ZT+IAA+GA3)/ABA的比值隨著低磷脅迫時間增加而上升，在脅迫24 d時，5號材料地上和地下部ZT含量和IAA/ABA，GA3/ABA，(ZT+IAA+GA3)/ABA比值均大于1號材料，表明在磷脅迫下，5號紅豆草積累ZT含量的能力較1號強。

3.3 低磷脅迫下各指標間的相關性

研究表明，ABA含量與氣孔開度存在負相關關系[45]，這與表3的相關性結果一致。賀凌霄等[46]研究發現ABA含量升高，Gs下降，植物凈光合速率下降，導致植物碳同化速率降低，而ZT能夠拮抗ABA誘導的氣孔收縮，進而維持氣孔開度，提高作物光合碳同化速率，因此，葉片氣孔的開放程度取決于ABA與ZT的綜合作用[46]。在本研究中，地上部ZT/ABA比值下降，說明低磷脅迫抑制葉片氣孔開張，植物碳同化速率下降，導致植物光合作用降低，且1號材料的比值低于5號，表明5號材料的光合作用較強。表3中，Pn與Fv/Fo呈極顯著正相關，可能是因為在低磷脅迫下，Fv/Fo耐低磷系數下降，光能吸收轉化機構的完整性遭受破壞，光能轉化效率下降，卡爾文循環中碳固定所需的化學能不足，葉綠體基質無法合成充足有機物，導致Pn下降[47]。

4 結論

低磷脅迫限制紅豆草的正常生長。低磷脅迫下，耐低磷5號紅豆草和磷敏感1號紅豆草的株高和葉面積的生長明顯受到抑制，Chl a,Chl b,Cp及Pn,葉綠素熒光參數、地上部GA3含量、地上IAA/ABA比值、地下部ZT/ABA,(IAA+GA3+ZT)/ABA比值均下降，而Ci,WUE,qN,地下部GA3含量、地上和地下部ZT,ABA含量、地上部ZT/ABA和地上(IAA+GA3+ZT)/ABA比值均呈上升，地上和地下部IAA含量和地下部IAA/ABA呈先增加后下降趨勢，在低磷脅迫下，兩份供試材料均通過降低水分蒸發和改變氣孔導度、能量耗散來保護光合機構和調節植物體內激素含量來適應逆境。