干旱脅迫下白刺花幼苗根系生長和生理特性的響應

趙文武，趙 鑫，謝文輝，趙麗麗*，陳可可，王普昶

(1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州師范大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

近些年來，干旱災害頻發，成為全世界植物生長發育以及農作物生產的主要限制因素之一。干旱和半干旱區約占我國國土面積的50%[1]，中國作為世界上的農業大國之一，正面臨著水資源短缺的困境。隨著全球氣候的改變，干旱發生的可能性將進一步增加，在我國的西南、西北以及華北地區干旱問題尤其突出,有研究發現這些地區在過去的60年里干旱災害變得越發頻繁[2]。貴州位于我國西南部，其具有典型的喀斯特地貌，主要體現為土壤淺薄、形成速度慢，鈣含量高有機質含量低，保水保土能力差以及抗干擾能力弱等特點，其特殊的碳酸鹽母巖成土背景決定了該區域成為世界上喀斯特發育最典型和復雜、分布面積最大的片區之一[3]。雖然貴州全省有80%以上地區的平均年降水量在1 100～1 300 mm之間，但由于其特殊的地上與地下二元結構水文系統、碳酸巖豐富的節理裂隙以及復雜的人類活動，會導致降水迅速滲入地下。接連多日的晴天往往伴隨著高溫，這樣的天氣使得土壤含水量降低，土壤表層發生臨時性干旱。該區域內的植物普遍遭受干旱脅迫，進而影響到植物的生長與發育[4-5]。同時貴州境內包含丘陵、山地、高原等多種復雜地形，地勢陡峭，降水的時空分布不均，區域性、季節性的干旱常有發生。因此在喀斯特地區，大多數的植物都具有耐旱、耐鹽等巖生適應性，特殊的地理水文環境篩選出適合喀斯特地區生長的植物群落，形成了獨具特色的喀斯特植被。

灌叢是貴州等喀斯特地區最普遍的植被類型。豆科槐屬灌木白刺花(Sophoradavidii)是喀斯特地區的旱生灌叢群落優勢種或廣布種[6]。董祥等[7]的研究表明白刺花在開花和結莢兩個時期其粗蛋白含量、相對飼喂價值(Relative feed value,RFV)較高，說明白刺花具有較高的飼用性。溫敏等[8]對白刺花抗炎以及抗過敏作用的研究說明白刺花還具有一定的醫藥作用。同時白刺花還是喀斯特山區植物群落的演替、物種多樣性的維持不可或缺的一環，其發達的根系以及根系上大量的根瘤菌在防治水土流失以及土壤改良等方面具有重要作用。這些證據都表明白刺花在生態、經濟方面有著重要的價值。較強的適應性和較高的營養價值使白刺花有望成為貴州等喀斯特干旱、貧瘠山區植被恢復和畜牧業發展的理想材料，是可供西部地區大范圍推廣發展全方位、立體式產業的潛力樹種之一[9]。目前，關于白刺花的研究主要集中在破除種子硬實性[10]、化學成分[11]、藥用價值[12]以及飼用價值開發[13-14]等方面。對白刺花抗旱適應機制方面的研究較少，而對抗旱機制的解析是加快白刺花新品種培育，進一步擴大白刺花種植范圍的有力保障。大量研究[15-17]報道幼苗期的植物往往對外界環境變化感受最為敏感，也最容易因為環境的壓力受到損傷。根系的形態建成是決定幼苗存活最關鍵的一點，同時根系作為植物吸水最主要的器官，也能最先感知到干旱來臨。當遭遇逆境時根系會迅速產生一系列的化學信號向其他部位傳遞。因此深入分析白刺花幼苗在干旱脅迫下根系的形態結構和生理生化響應，初步揭示白刺花幼苗根系適應干旱的形態和生理機制，為培育白刺花抗旱新品種，開展喀斯特地區白刺花飼用資源的開發、貧瘠山區土壤的改良以及喀斯特山區植被的恢復提供理論與材料保障。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

白刺花種子來源于貴州大學動物科學學院草業科學實驗室，挑選大小一致且飽滿的白刺花種子用砂紙進行磨皮，破除種子硬實，2%NaClO溶液浸泡30 min消毒后用無菌去離子水清洗3次以上，60℃溫水浸泡12 h，再播種到裝有5 L營養土的花盆內(長∶寬∶高=43 cm∶19 cm∶14 cm)生長，每個花盆均勻播種50粒種子。待種子萌發后，讓幼苗正常生長40 d，然后挑選生長狀況基本一致的幼苗，每盆30株共20盆，開始進行干旱脅迫。處理前一天充分灌水一次，放置過夜。待土壤水分含量穩定后隨機抽取10盆測定田間持水量。試驗根據《中華人民共和國水利行業標準旱情等級標準：SL 424-2008》對土壤相對濕度旱情等級分類。同時結合代仁麗[18]、梁任剛[19]等學者對貴州省氣候條件、年際干旱強度及干旱頻率分析，發現貴州省以輕旱為主，極少出現重大干旱的實際情況，設置了4個土壤水分梯度(表1)。

表1 土壤水分梯度設置

土壤充分灌溉后，每天用土壤水分測定儀測定土壤的含水量，當對照、輕度干旱、中度干旱、重度干旱4個處理分別達到其相應的相對含水量時，正式進入脅迫試驗。干旱處理時，每天對盆栽進行稱重，補充水分時按重量損失的方法，以保持穩定的土壤含水量。脅迫到14天后取樣，測定白刺花根系形態指標和生理生化指標。

1.2 指標測定及方法

1.2.1根系形態指標 每個梯度取10株，用去離子水輕輕沖洗根系，洗凈根系表面的基質，然后將其分散、均勻地放入透明丙烯酸托盤中，并使用EPSON Perfection V800(MADE IN INDONESIA.PAT.P.)進行根系掃描。掃描的圖像用Win-RHIZO 2017a進行分析，得到白刺花幼苗的根長、根表面積、根體積以及根尖數等數據。

1.2.2生理生化指標測定 分別采用愈創木酚法[20]測定過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，氮藍四唑(NBT)比色法[21]測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性，紫外比色法[22]測定抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbateperoxidase，APX)活性和鉬酸銨比色法[22]測定過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性。分別采用蒽酮比色法測定可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量、酸性茚三酮法測定脯氨酸(Proline，Pro)含量和考馬斯亮藍染色法測定可溶性蛋白(Soluble proteins，SP)[21]含量。采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量[20]，質膜相對透性測定參照蔡慶生[21]的方法。過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)含量采用KI顯色法測定，采用北京索萊寶科技有限公司試劑盒測定。采用2-脫氧-D-核糖顯色法[23]測定羥自由基(Hydroxyl free radical，OH-)清除率；采用對氨基苯磺酸法測定[24]超氧陰離子(Superoxide anion，O2-)清除率，采用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒測定。采用固相夾心法測定生長素(3-Indoleacetic acid，IAA)含量，采用雙抗夾心法測定脫落酸(Abscisic acid，ABA)，赤霉素(Gibberellin A3，GA3)，細胞分裂素(Cytokinin，CTK)，植物乙烯(Ethylene，ETH)，油菜素內酯(Brassinolide，BR)，茉莉酸(Jasmonic acid，JA)和水楊酸(Salicylic acid，SA)含量，測量方法均根據酶聯免疫試劑盒法[25](采用北京索萊寶科技有限公司)試劑盒測定，測定時每個樣品測定設置3次重復。

1.3 數據分析與處理

利用Excel 2019軟件進行數據處理，采用Origin 2019軟件作圖，采用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析、相關性分析和主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下白刺花根系形態特征

由表2可知，在重度干旱下白刺花根系總長和根系表面積與對照組相比，分別顯著增加了55.04%和44.40%(P<0.05)。隨著干旱脅迫的加重，白刺花平均根系直徑呈先升后降的趨勢，輕度脅迫時到達頂峰；根體積呈逐漸增大的趨勢；白刺花根尖數呈現先降后升的趨勢。

表2 干旱脅迫下白刺花根系生長特性

2.2 干旱脅迫下白刺花根系滲透調節能力

由圖1可知，隨著干旱脅迫程度的加強，根系內脯氨酸、可溶性糖含量呈上升趨勢，而根系內可溶性蛋白含量則呈下降趨勢，與對照組相比脯氨酸含量分別顯著上升20.56%，43.57%，260.59%(P<0.05)，可溶性糖的含量分別顯著上升14.94%，33.17%，59.24%(P<0.05)，可溶性蛋白含量分別顯著下降12.34%，20.32%，28.09%(P<0.05)。

圖1 干旱脅迫下白刺花根系滲透調節能力的變化

2.3 干旱脅迫下白刺花根系內源激素含量

由圖2可知，隨著干旱脅迫程度的加強，白刺花根系內源激素IAA和SA呈現上升的趨勢，均在中度干旱時達到最大值，IAA分別較對照顯著上升23.10%，58.62%和55.17%(P<0.05)，SA分別較對照上升6.34%，37.08%，36.85%；GA3，CTK，BR含量整體呈現上升趨勢，均在重度干旱時達到最大值，與對照組相比，分別顯著上升49.89%，39.55%和63.59%(P<0.05)；而ABA，ETH，JA含量呈現下降趨勢，均在重度干旱時達到最小值，與對照組相比，分別顯著下降25.56%，33.73%和40.03%(P<0.05)。

圖2 干旱脅迫下白刺花根系內源激素含量的變化

2.4 干旱脅迫下白刺花活性氧代謝及保護酶活性

由圖3可知，隨著脅迫程度的加強，白刺花根系中MDA和H2O2含量以及APX活性都呈現上升的趨勢，與對照組相比，在輕度、中度、重度脅迫下MDA含量分別顯著上升了24.55%，49.90%，73.06%(P<0.05)，APX活性分別顯著上升了61.89%，148.67%，244.27%(P<0.05)，H2O2含量分別顯著上升了29.88%，102.13%，167.99%(P<0.05)。而羥自由基清除率、超氧陰離子清除率、SOD和POD含量以及CAT活性隨著脅迫程度的加強出現下降的趨勢，其中羥自由基清除率與對照組相比分別顯著下降了6.74%，8.28%，13.45%(P<0.05)；超氧陰離子清除率分別顯著下降了4.09%，7.89%，12.24%(P<0.05)；SOD活性分別顯著下降了8.31%，12.24%，20.56%(P<0.05)；POD活性分別顯著下降了9.74%，18.43%，24.46%(P<0.05)；CAT活性分別顯著下降了10.92%，28.91%，42.48%(P<0.05)。

圖3 干旱脅迫下白刺花根系活性氧代謝和保護酶活性的變化

2.5 干旱脅迫下白刺花根系各項指標的相關性分析

對白刺花24個抗旱性狀指標進行相關性分析，由圖4可知，白刺花根系生長發育的各項性狀中，所有性狀都與根系總根長、總表面積、體積顯著相關(P<0.05)，其中SOD，POD、可溶性蛋白、CAT,APX，ETH，JA以及羥自由基清除率和超氧陰離子清除率都與根系總根長、總表面積、體積極顯著相關(P<0.01)。可溶性糖與根系總根長、根表面積都呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與根體積呈顯著正相關關系(P<0.05)。脯氨酸與根系總根長、總表面積呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與根系直徑、體積呈顯著正相關關系(P<0.05)。而可溶性蛋白與可溶性糖和脯氨酸的趨勢恰恰相反，可溶性蛋白與總根長、根表面積都呈極顯著負相關關系(P<0.01)。CTK與根系總表面積、體積呈極顯著相關關系(P<0.01)，與根系總長呈顯著相關關系(P<0.05)。所有性狀中SOD與根系總表面積相關系數最大，為0.885。

圖4 干旱脅迫下白刺花根系指標相關性分析

2.6 白刺花材料各項性狀的主成分分析

由圖4可知，雖然所測定的24個抗旱指標間存在一定的相關性，但是相關程度并不一致。因此采用主成分降維的方法對干旱脅迫下白刺花根系的24個指標進行主成分分析。將累計方差貢獻率大于80%，并且特征值≥1作為判別的條件，成功提取2項主成分因子(表3)。主成分1(PC1)的特征值為19.521，貢獻率為81.338%；主成分2(PC2)的特征值為2.062，貢獻率為8.593%；2個主成分累計貢獻率達89.931%，具有較好的代表性，與白刺花苗期的抗旱能力具有直接聯系，可作為白刺花幼苗抗旱性評價的綜合指標。

由表3可知，第1主成分中，貢獻率較大的是SOD，POD、可溶性糖、可溶性蛋白、APX，H2O2，SA，I，GA3，主要反映了干旱脅迫后白刺花根系主要保護酶活性及滲透調節的含量；干旱條件下，細胞內抗氧化酶活性以及膜保護物質的含量越高，幼苗受到的傷害程度就越小。第2主成分中貢獻率較大的是平均根系直徑、根尖數以及總根長，三者主要反映了干旱脅迫下白刺花根系生長發育狀況；當遭受干旱時，植物常常通過自身的根系發育來擴大水分的吸收和利用效率，干旱脅迫下較長的根系可以使植物接觸到更深層的水分，從而吸收更多的水分。

表3 干旱脅迫下白刺花根系主成分特征向量

3 討論與結論

3.1 干旱脅迫對白刺花根系形態特征的影響

當遭遇逆境時根系會迅速產生化學信號向其他部位傳遞。丁紅等[26]在研究花生對干旱的響應時指出，隨著土壤水分含量的降低，根系的生物量、根冠比、根長等形態指標會發生變化，以此來適應干旱脅迫。土壤中水分分布及含量會對植物根系生長和形態發育產生很大影響。本試驗中，白刺花在遭受干旱脅迫時，根系總長、表面積和體積呈增加的趨勢，這與張翠梅等[27]對不同抗旱性苜蓿遭遇干旱時的根系形態研究結果相似。根系平均直徑呈先增后減的趨勢，根尖數呈先減后增的趨勢，根系形態的變化表明遭遇干旱時的白刺花幼苗通過增加根長，確保根系往土壤更深層下扎，根體積與表面積的增加也印證了這點，并且體積和表面積增大也使根系與周圍環境的接觸機會增大了，以保證根系吸收更多的水分與養分，從而增強自身抗旱能力。

3.2 干旱脅迫對白刺花根系滲透調節能力的影響

植物根系的形態特征發生變化也必然會引起內在生理生化指標的變化，二者的變化相輔相成，共同作用抵抗逆境[28]。前人大量的研究中[29-31]指出遭遇逆境時植物通過提高細胞液的濃度，可以維持細胞膨壓，防止原生質過度脫水。本研究中干旱脅迫下白刺花幼苗根系的可溶性糖和脯氨酸含量上升，說明遭受干旱脅迫時白刺花根系可以大量積累脯氨酸和可溶性糖，保持細胞結構和生物大分子的空間結構，延遲根系衰老和死亡，并促進嚴重缺水環境下的根系生長，為正常生命活動創造條件。而可溶性蛋白不僅是營養物質，也是滲透調節物質之一，既對生物膜和碳物質起保護作用，也對細胞保水能力有重要作用[32]。在干旱脅迫下，白刺花幼苗根系的可溶性蛋白含量呈下降趨勢，且與對照組差異顯著。這與馬亞珺等[33]、高曉寧等[34]對紫花苜蓿、杜鵑遭遇干旱脅迫的生理響應的研究結果相似。本試驗表明干旱脅迫下白刺花根系中蛋白酶的活性升高，使可溶性蛋白的水解加快，降解后的蛋白形成了脯氨酸等其他具有調節功能的氨基酸。

3.3 干旱脅迫對白刺花內源激素含量的影響

植物內源激素在調控植物根系細胞分裂和分化方面扮演著重要角色，人類最早發現的植物激素就是IAA[35-36]。IAA和CTK均有強化器官活性的作用，而GA3可以提高植物體內生長素的含量，從而調節細胞的伸長。它們可以共同促進細胞的分裂和擴大，但不引起細胞壁的酸化[37]。宋松泉等[38]、蘇會麗等[39]對生長素和赤霉素的分子機理研究表明，生長素合成和代謝可以誘導植物種子的休眠和萌發，調控維管束形成層的分裂，調控植物根的生長、葉片發育。本試驗中，白刺花幼苗根系中IAA，GA3，CTK含量呈上升趨勢，3種激素都屬于生長促進類激素，其含量的上升與白刺花根系總長度、體積的變化相對應，表明白刺花遭遇干旱時通過調節生長促進類激素含量，促進根系分生組織細胞的增殖，并且促進側根和不定根的萌發，進一步改變白刺花根系生長的進程。三者共同作用使得白刺花根系伸長，表面積擴大，與周圍環境的接觸機會增大了，從而保證了根系吸收更多的水分與養分來抵御干旱。

BR可以提高植物體內的酶促物質的活性，增加非酶促物質的含量[40]。胡文海等[41]在研究BR對黃瓜葉片調節作用時指出BR能通過增強葉綠體和線粒體能量代謝平衡，誘導光合基因表達，增加光合效率。夏方山等[42]在研究SA對植物種子和幼苗抗逆性時指出，SA參與植物內許多生理過程如誘導逆境相關蛋白的表達、激活植物過敏反應，提高作物抗病性以及抗逆境脅迫能力，還可以促進種子萌發及幼苗生長。本試驗中，從整體來白刺花根系中的BR和SA含量都呈現上升趨勢。這與劉強[43]、惠竹梅[44]、吳雪霞[45]等分別對蒼耳、葡萄、茄子的研究結果相似，本試驗表明白刺花通過增加BR,SA含量來調節滲透物質的含量，保持細胞的持水能力，維持能量代謝平衡和誘導逆境相關蛋白的表達，有效緩解干旱脅迫對白刺花生長的抑制作用，幫助白刺花更好的應對干旱。

本試驗中，ABA和ETH以及JA含量呈下降趨勢。當植物根系感知土壤水分不足時，根源ABA作為一種胞間信使傳遞到葉片，又通過胞間信號傳導被保衛細胞識別，促使氣孔關閉并減弱與植物生長有關的代謝活性。缺水嚴重條件下，植物體內的細胞膨壓降低或細胞膜破裂，ABA水平會增加至100倍[46]。干旱脅迫下白刺花根系ABA含量之所以沒有升高，可能是白刺花具有較強的抗旱性，在短期的脅迫下，白刺花根系的細胞膨壓或細胞膜未受到嚴重破壞，生長依舊處于正常水平，干旱脅迫下白刺花根系形態特征可以佐證該結果。JA作為一種重要的環境信號分子，通過誘導許多防御基因或蛋白的表達以及防御化學物質的合成有效地介導植物對逆境脅迫的防御反應。Ollas等[47]發現當遭遇干旱脅迫時，柑橘根系中的ABA含量在JA瞬時積累之后開始快速增加，JA可能參與ABA的生物合成，并誘導植物后期的脅迫響應[47]。在白刺花幼苗根系中JA含量下降，與ABA含量的變化同步，進一步佐證了JA參與ABA的生物合成并誘導白刺花對干旱脅迫的響應。

3.4 干旱脅迫對白刺花根系活性氧代謝的影響

通過主成分降維的方法對干旱脅迫下白刺花根系的24個指標進行主成分分析成功提取2項主成分因子。第1主成分主要是保護酶活性及滲透調節物質的含量，反映了白刺花根系響應干旱脅迫的生理機制，干旱條件下，細胞內抗氧化酶活性以及膜保護物質的含量越高，幼苗受到的傷害程度就越小。第2主成分中貢獻率較大是根系直徑、根尖數以及總根長，三者主要反映了干旱脅迫下白刺花根系生長發育狀況，當遭受干旱時，白刺花通過自身的根系發育來擴大水分的吸收和利用效率，干旱脅迫下較長的根系可以使植物接觸到更深層的水分，從而吸收更多的水分。

綜上所述，當遭遇干旱時白刺花幼苗根系形態會發生改變，通過增加根長和體積，確保自身的根系往土壤更深層下扎，以保證吸收更多的水分與養分。隨著干旱程度加深，白刺花細胞穩態受到一定影響，MDA含量上升；通過分析滲透調節物質含量、內源激素含量以及保護酶活性發現，其滲透物質和生長促進類激素含量增加，保護酶活性上升，其生理生化指標在積極響應，以幫助白刺花更好的抵御干旱。在重度脅迫下白刺花也未發生根系嚴重脫水和幼苗死亡的現象，表明白刺花幼苗有較強的干旱忍受能力。試驗闡明了白刺花根系抗旱的適應機制，可為白刺花抗旱新品種培育及其在西部喀斯特地區開發利用提供一定的參考依據。