獨腳金內酯對干旱脅迫下黑果枸杞種子萌發和幼苗生理變化的影響

劉淑蘭，李 進，馬永慧，巫利梅，李 瑩，朱麗春

(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，干旱區植物逆境生物學實驗室，新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生灌木[1]，在我國僅分布于西北地區，是我國干旱區重要的野生藥食兩用植物資源[2]，屬國家二級保護植物[3]。黑果枸杞常生于鹽堿化荒漠草原，其葉片、果實等可作為飼料供駱駝、羊等牲畜食用[4]，同時又具有水土保持、防風固沙、土壤改良等生態價值，是世界上三大堿性土壤指示植物和先鋒植物之一[5]。在黑果枸杞的人工種植中，人們發現其種子萌發和幼苗生長階段易受干旱的不良影響，對生產造成了一定損失[6]，為此，積極尋求黑果枸杞抗旱途徑和方法對提高其在干旱環境下的種子萌發和幼苗生長具有重要意義。

近年來，人們在外源調節物質促進種子萌發、提高植物抗旱性方面進行了系列研究，如：肖珍珍等[7]研究發現褪黑素浸種能夠有效緩解干旱脅迫對無芒雀麥(Bromusinermis)種子萌發的抑制作用；李穎等[8]研究發現水楊酸和脫落酸浸種有助于低溫下扁蓿豆(Medicagoruthenica)種子的萌發以及幼苗的生長。獨腳金內酯(Strigolactones,SLs)是一類新型植物激素[9]，國內外研究發現SLs除了具有抑制植物分枝、側根生長、促進葉片衰老等作用外[10]，還在抵御生物脅迫和非生物脅迫方面(如鹽旱脅迫及營養元素缺乏等)具有顯著作用[11]。關于SLs提高植物對非生物脅迫的抗性研究主要集中在生理調節方面，如緩解油菜(Brassicanapus)漬水脅迫[12]，緩解大麥(Hordeumvulgare)鎘毒害[13]，通過調控基因表達促進油菜生長、光合作用和緩解鹽脅迫下的氧化應激等[14]。目前獨腳金內酯對黑果枸杞在干旱脅迫下的影響還未見報道，本研究通過聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG-6000)模擬干旱[15]對黑果枸杞種子及幼苗進行脅迫處理，設置不同濃度的SLs，探究SLs對黑果枸杞種子萌發及幼苗生理特性的影響，篩選出干旱地區黑果枸杞種植施用的最佳SLs溶液濃度，旨在為黑果枸杞在新疆干旱荒漠地區的人工種植及其抗旱生理機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑果枸杞種子于2020年采自新疆博湖縣開都河流域(41°58.03' N，86°37.50′ E，海拔1 044 m)。開都河流域地處亞歐內陸荒漠，屬暖溫帶典型荒漠氣候，氣候干燥、降水稀少。本研究在新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室進行。

1.2 試驗設計

將種子放入40℃恒溫水浴鍋中使用蒸餾水浸種48 h，以解除種子休眠。配置75%乙醇，浸種后進行消毒處理10 min，蒸餾水沖洗干凈后用吸水紙吸干種子表面水分待用[16]。

試驗采用雙因素設計。利用PEG-6000配制溶液，設置3個干旱脅迫濃度梯度(0%，10%，15%)，標記為：CK(對照)、D1(輕度干旱)、D2(重度干旱)。在現有SLs緩解植物逆境傷害研究中[12-14]其使用濃度范圍為0.1～10 μmol·L-1，依此設置0，0.1，1，10，100 μmol·L-15個濃度進行預實驗，確定本試驗濃度范圍為0.1～10 μmol·L-1，結合前人實驗中的常用濃度，最后通過18 μmol·L-1的SLs母液配置6個外源獨腳金內酯濃度梯度為：0，0.18，0.4，1，5，10 μmol·L-1。如表1所示，共18個處理，每個處理重復3次。

表1 外源獨腳金內酯處理及干旱脅迫試驗設計

1.2.1萌發試驗設計 選擇飽滿、大小一致的干凈種子，用不同濃度的SLs浸種12 h，0 μmol·L-1處理組用蒸餾水處理。采用培養皿雙層濾紙法進行萌發，將經過處理的種子置于浸透了PEG溶液的濾紙上，以浸透濾紙并稍有剩余為宜，CK組施加等量蒸餾水。每個培養皿內(按“井”字法)均勻擺放30粒種子。將培養皿置于光照強度4 000 lx、光照時間12 h(10∶00—22∶00)，室溫20～25℃條件下。萌發期間每天晚上用稱重法補足質量，維持每3 d更換1次濾紙，每天觀察記錄種子萌發情況及發芽粒數。種子萌發以黑果枸杞種子露白作為標準，連續培養觀察15 d，直至連續3 d無種子萌發視為試驗結束。發芽結束后，各處理隨機挑選10粒出芽種子使用游標卡尺測其主根長[16]。

1.2.2幼苗生長試驗設計 選擇飽滿、大小一致的種子，播入規格為12.5 cm×7.5 cm×9 cm(上徑×下徑×高)白色塑料花盆中，每個花盆內有烘干土壤0.5 kg。將盆栽均放置在適宜環境條件下萌發、生長，挑選生長良好、長勢基本一致的黑果枸杞幼苗，每盆5株，采取不進行澆水處理直至土壤水分自然消耗后，進行土壤干旱脅迫和SLs噴施處理[6]。根據梯度設計，干旱脅迫開始第0，6，12天晚上20：00向根部灌施PEG 100 mL，CK組施加等量蒸餾水。每天記錄其質量，灌施期間以上一次施加PEG后質量為標準，定期澆水維持質量，脅迫周期共28天。干旱脅迫處理開始后的第1，4，7天進行外源SLs處理，每天晚上20：00向根部灌施20 mL SLs溶液，0 μmol·L-1處理組施加等量蒸餾水。

1.3 測定指標及方法

1.3.1發芽指標測定 發芽率(Germination rate，GR)、發芽勢(Germination potential，GP)、發芽指數(Germination index，GI)、活力指數(Vigor index，VI)、相對根長的計算方法[16]如下所示。

發芽率=n/N，式中，n為總萌發種子數，N為供試種子總數。

發芽勢=m/N，式中m為種子發芽高峰時的發芽個數，N為供試種子數。

發芽指數=Σ(Gt/Dt)，式中Gt為t日的萌發數，Dt為相應的萌發天數。

活力指數=相對根長×GI；相對根長=s/S，式中s為脅迫下根長，S為對照的根長。

1.3.2生理指標測定 基于1.2.2處理，分別采集脅迫第27 d黑果枸杞幼苗頂部完全展開功能葉，使用北京索萊寶科技有限公司試劑盒測定各生理指標。葉綠素使用無水乙醇與丙酮按體積比1∶2混合液提取[17]；脯氨酸(Proline，Pro)含量使用酸性茚三酮法測定[18],丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量通過硫代巴比妥酸法測定[19]，總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)通過還原Fe3+-三吡啶三吖嗪測定[20]。

1.4 數據處理與分析

試驗數據均使用Excel 2016進行計算整理，采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，結果采用均值±標準誤表示。在α為0.05水平上，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)比較干旱脅迫、外源SLs及二者交互作用對各項指標的影響和差異顯著性，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行各處理平均值間各項指標的比較，采用Duncan多重比較進行差異顯著性檢驗；采用Origin 2021繪圖并對各處理平均值間各項指標進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 外源獨腳金內酯對干旱脅迫下黑果枸杞種子萌發的影響

由表2可知，同一干旱脅迫程度下隨著SLs濃度的升高，黑果枸杞種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數總體呈先上升后下降的趨勢，CK組在使用較低濃度即0.18，0.4，1 μmol·L-1SLs浸種處理后，黑果枸杞種子的各項發芽指標均高于未施加SLs組。D1脅迫下，1 μmol·L-1SLs浸種處理后黑果枸杞種子的各項發芽指標均達到峰值，10 μmol·L-1SLs浸種后種子各項發芽指標均低于0 μmol·L-1處理組，表現為抑制作用。D2脅迫下，低濃度SLs浸種后發芽率、發芽指數、活力指數均高于0 μmol·L-1濃度SLs浸種處理組，且以1 μmol·L-1SLs浸種處理效果最好，10 μmol·L-1SLs浸種后種子發芽率、發芽勢低于0 μmol·L-1濃度SLs浸種處理組，有一定抑制作用。未施加SLs時，隨著干旱脅迫程度增加，黑果枸杞種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數總體呈下降趨勢，其中D1脅迫對各項發芽指標影響較小，與CK處理差異不顯著，D2脅迫時發芽率、發芽指數、活力指數顯著下降(P<0.05)。由表3可知，干旱脅迫對黑果枸杞種子萌發影響顯著(P<0.001)，而單獨施加外源SLs以及在二者互作情況下對其萌發影響均不顯著。

表2 外源獨腳金內酯對干旱脅迫下黑果枸杞種子萌發的影響

表3 干旱脅迫、外源獨腳金內酯處理及二者互作對黑果枸杞種子萌發和幼苗生理影響的雙因素方差分析(F值)

綜上說明在干旱脅迫下，低濃度SLs處理對種子萌發具有促進作用，高濃度SLs處理對種子萌發具有一定抑制作用。

2.2 干旱脅迫下施加外源獨腳金內酯黑果枸杞葉片葉綠素含量變化

由表4可知，在同一干旱脅迫下，CK組幼苗在施加SLs后，其葉綠素a，b及葉綠素總含量均下降；D1組葉綠素a含量變化呈先上升后下降趨勢，且增幅分別為47.22%，63.88%，79.07%，-24.06%，-30.25%，葉綠素b含量變化呈先上升后下降趨勢且增幅分別是12.24%，25.77%，45.28%，-11.58%，-11.13%，均在施加濃度為1 μmol·L-1時達到峰值，說明低濃度SLs可提高黑果枸杞葉綠素含量，高濃度SLs則降低葉片葉綠素含量，此外低濃度SLs處理組可提高Chl(a/b)值，說明SLs使黑果枸杞傾向于合成葉綠素a從而提高光合作用；D2組葉綠素a，b含量變化整體呈先上升后下降趨勢，增幅分別為-9.54%，6.37%，32.66%，28.43%，-33.39%和13.57%，18.63%，43.47%，54.25%，-17.44%，與D1組相比，增幅減小，但葉綠素含量均高于D1處理組。

表4 外源獨腳金內酯對干旱脅迫下黑果枸杞葉片葉綠素含量的影響

施加0 μmol·L-1SLs時，D1和D2脅迫的葉綠素a，b含量與CK組相比增幅分別為-53.84%，-44.58%(D1)和34.99%，7.42%(D2)；施加0.4 μmol·L-1SLs處理組內，D1和D2處理的葉綠素a，b含量與CK組相比的增幅均高于施加0 μmol·L-1SLs處理組，分別為13.55%，-15.74%(D1)和115.55%，54.05%(D2)；施加1 μmol·L-1SLs處理組內，D1和D2處理的葉綠素a，b含量與CK組相比的增幅同樣高于施加0 μmol·L-1SLs處理組，分別為-8.42%，-6.75%(D1)和98.42%，78.49%(D2)，說明在干旱脅迫時施加0.4和1 μmol·L-1SLs可緩解干旱脅迫對葉綠素的降解，提高葉綠素含量，增強光合作用。

根據表3雙因素方差分析可知，干旱脅迫、施加外源SLs以及二者交互作用對葉綠素含量的影響顯著(P<0.001)。

綜上所述，施加低濃度SLs對干旱脅迫下黑果枸杞葉片葉綠素的合成有促進作用，1 μmol·L-1為最適濃度。

2.3 干旱脅迫下施加外源獨腳金內酯黑果枸杞幼苗游離脯氨酸含量變化

由圖1可知，CK組隨著外源SLs濃度增加，Pro含量組內變化不顯著，0.4 μmol·L-1濃度SLs處理時Pro含量最高；D1組隨著外源SLs濃度的增加，Pro含量整體呈現先增后減的趨勢，0.18，1 μmol·L-1濃度SLs處理與0 μmol·L-1濃度處理有顯著差異(P<0.05)，當施加5，10 μmol·L-1高濃度SLs時，Pro含量較0 μmol·L-1SLs濃度處理降低51.06%，15.35%，說明低濃度SLs處理可提高黑果枸杞幼苗抗旱能力，高濃度SLs處理反而會減弱黑果枸杞幼苗抗旱能力；D2組隨著外源SLs濃度的增加，Pro含量整體呈先增后減趨勢，其它各濃度處理與0 μmol·L-1SLs處理組相比增加了2.1，1.7，3.5，2.1，1.4倍，且差異顯著(P<0.05)，同樣說明SLs處理可提高黑果枸杞幼苗抗旱能力，且低濃度SLs效果更好。

圖1 外源獨腳金內酯對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗游離脯氨酸含量的影響

對于施加相同濃度外源SLs處理組，隨著干旱脅迫程度增加，黑果枸杞幼苗Pro含量呈遞增趨勢，且脅迫程度越強Pro含量增幅越大，說明黑果枸杞自身能通過提高Pro含量來抵御干旱脅迫的傷害。不施加SLs時，D1和D2處理組Pro含量與CK組相比增加了1.6，2.4倍；施加0.18，0.4，1 μmol·L-1SLs，D1和D2脅迫處理組Pro含量增加了6.6/9.7倍，1.7/8.3倍和3.2/14.6倍，而施加高濃度即5 μmol·L-1，10 μmol·L-1SLs，D1和D2脅迫處理組Pro含量增加了0.28/1.2倍和9.9/7.2倍，相比之下在干旱脅迫時施加低濃度SLs，其Pro含量上升幅度更大。同樣結合表3可知，干旱脅迫與外源SLs二者互作對黑果枸杞提高Pro含量以抵御干旱脅迫效果顯著(P<0.01)。

以上結果說明施加1 μmol·L-1外源SLs，可提高干旱脅迫下黑果枸杞幼苗Pro含量以更好地抵御干旱。

2.4 干旱脅迫下施加外源獨腳金內酯黑果枸杞幼苗丙二醛含量變化

如圖2所示，CK處理組，施加0.18，5 μmol·L-1SLs，黑果枸杞幼苗MDA含量顯著降低(P<0.05)；D1處理組，0.18，0.4 μmol·L-1SLs濃度處理后MDA含量略有下降；D2處理組，5 μmol·L-1SLs處理后的MDA含量有一定下降。在施加同一濃度SLs的處理組內，隨著干旱脅迫加強，D1和D2與CK相比，MDA含量均降低且與CK差異顯著(P<0.05)，但D1與D2之間差異不顯著。由表3可知，干旱脅迫、外源SLs以及二者交互作用對MDA含量有極顯著影響(P<0.001)。

圖2 外源獨腳金內酯對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗丙二醛含量的影響

綜上所述，干旱脅迫下施加外源SLs在一定程度上可緩解黑果枸杞幼苗中膜脂過氧化反應，降低MDA含量，減輕干旱脅迫對黑果枸杞的傷害。

2.5 干旱脅迫下施加外源獨腳金內酯黑果枸杞幼苗總抗氧化能力變化

由圖3可知，CK組隨著施加外源SLs濃度增加，黑果枸杞幼苗T-AOC總體呈下降趨勢；D1處理組隨著施加外源SLs濃度增加，幼苗的T-AOC變化趨勢呈現出先下降后上升趨勢；D2處理組隨著外源SLs濃度增加，幼苗T-AOC變化不明顯。對于相同濃度外源SLs處理組，隨著干旱脅迫程度增強，D1和D2與CK相比，黑果枸杞幼苗T-AOC上升，顯著差異(P<0.05)。由表3可知，干旱脅迫對T-AOC有極顯著影響(P<0.001)，但外源SLs及二者交互作用對T-AOC無顯著影響。

圖3 外源獨腳金內酯對干旱脅迫下黑果枸杞幼苗總抗氧化能力的影響

以上結果說明在干旱脅迫下黑果枸杞可提高其總抗氧化能力以抵御干旱，在施加適宜濃度外源SLs后，對T-AOC也有一定的提高。

2.6 主成分分析

為了進一步研究SLs處理引起的差異，對18個處理下的發芽指標和生理指標數據進行主成分分析，結果如圖4所示。根據主成分分析特征值大于1的原則，在原來11個指標的基礎上提出2個主成分，累積貢獻率達85.7%，包含了所測指標大部分信息，可以基本反映各處理對黑果枸杞影響的整體情況。

圖4 外源獨腳金內酯與干旱脅迫處理下黑果枸杞種子萌發、生理指標主成分分析

圖中每個點代表不同的處理，各個點的標簽值為所使用的外源SLs濃度。由圖中樣本點分布可知，干旱脅迫程度很明顯地將各個處理區分開，在不同的干旱條件下施加外源SLs有不同的效果。CK處理組中施加0.18，1 μmol·L-1SLs在PC2軸得分為正且最高，10 μmol·L-1SLs處理在PC1和PC2軸得分均為負且最低；D1脅迫時施加1 μmol·L-1SLs在PC2軸得分為正且最高，10 μmol·L-1SLs處理在PC2軸得分為負且最低；D2脅迫下施加外源SLs在PC1軸上得分均為正，以1，5 μmol·L-1效果最好，在PC2軸上以1 μmol·L-1得分較高，而10 μmol·L-1SLs處理在PC1和PC2軸得分均為最低。綜上所述，在干旱脅迫下施加1 μmol·L-1外源SLs能夠更好地協助黑果枸杞抵御干旱脅迫，而10 μmol·L-1SLs對黑果枸杞的生長有抑制作用。

3 討論

種子萌發是植物生長周期的開始，也是植物在其生活史的關鍵時期，在這一階段易受環境中水分影響，干旱脅迫對種子的萌發有明顯的抑制作用，許多研究表明可通過發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數等形態學指標來表征該植物抗旱性以及施加外源物質后植物對自身抗旱能力的調節作用[21]。黑果枸杞作為耐旱植物，在一定程度的干旱脅迫下能夠保持其萌發能力，本研究中輕度干旱下種子萌發各項指標并無明顯變化，但在重度干旱下顯著下降，這與李佳等[22]研究結果一致。SLs作為根寄生植物種子萌發的信號物質，能夠促進這類植物的種子萌發[23]，但對非寄生植物種子萌發的影響未知，在本研究中，低濃度的SLs對黑果枸杞種子萌發有促進作用，通過0.4，1 μmol·L-1SLs浸種的處理組，其發芽率、發芽指數、活力指數高于同干旱不同SLs處理組，即SLs可在一定程度上打破黑果枸杞種子的休眠、增強種子活力，這與龐星月等[24]研究結果相近，其研究發現外源生長調節物質SLs可顯著提高干旱脅迫下油菜種子萌發。

SLs作為一種新型植物激素，對植物的影響與脫落酸、生長素、赤霉素等存在交叉集合通路[25]，植物在受干旱脅迫時，生長素、脫落酸等植物激素含量上調[26]，李琬婷等[19]提出脫落酸可通過多種途徑如提高植物體內滲透物質含量、增強植物細胞內抗氧化酶活性，以及調節相關抗旱基因表達等來調節植物抗逆性。而王喬健[27]在其研究中發現在逆境脅迫下脫落酸可能參與SLs調控植物對逆境的響應。本研究中無干旱脅迫下施加SLs，黑果枸杞生理指標并無明顯變化，說明在未受逆境脅迫時，SLs并不會參與黑果枸杞生理生化反應的調控，猜測可能是在無逆境脅迫時，缺少信號分子使其參與抗逆調控通路。

植物生長和積累干物質主要來源為光合作用，植物在遭受非生物脅迫時可通過改善光合作用來降低光化學損傷[28]；葉綠素是光合作用的基礎，葉綠素含量能在一定程度上反映植物利用光能、生產有機物以及適應、利用環境因子的能力[29-30]。干旱脅迫下隨著施加SLs濃度的增加，葉綠素含量整體呈先上升后下降趨勢，在1 μmol·L-1至5 μmol·L-1時達到峰值，而Wang等[31]提出在干旱脅迫下3 μmol·L-1GR24處理可能有助于防止葡萄葉片葉綠素的降解，對光合作用有積極的影響，說明在本試驗中，適宜濃度SLs同樣能防止黑果枸杞葉片葉綠素降解。郭有燕等[32]在研究中提出，干旱脅迫下黑果枸杞Chl(a/b)值增加說明此時PSⅡ聚光復合體捕光復合物減少，可減少葉片對光能的捕獲，使光合機構免遭光氧化的破壞，是黑果枸杞在受到干旱脅迫時的自我保護策略，本研究中輕度干旱時施加低濃度SLs，Chl(a/b)增加說明SLs可增強黑果枸杞光合作用系統在干旱時的自我保護作用，以增強黑果枸杞抵御干旱的能力。

植物體在受到逆境脅迫時會誘導滲透調節基因表達，產生滲透調節物質如脯氨酸，在滲透調節中起重要作用，干旱脅迫下植物會積累大量脯氨酸，這是植物在受干旱脅迫時作出的生理響應[33]。本研究中干旱脅迫越大Pro含量越高，施加SLs后可提高干旱下Pro含量，且在重度干旱時施加1 μmol·L-1達到峰值，說明SLs可促進干旱下黑果枸杞體內Pro的合成，從而增強黑果枸杞吸收水分的能力以抵御干旱。干旱脅迫是氧化脅迫中的一種，植物產生過量活性氧導致活性氧產生與清除的平衡失調，對植物產生傷害[34]，如膜脂的過氧化反應，MDA是植物細胞膜脂過氧化的最終產物，其含量反映植物受傷害的程度[35]。本研究中在輕度干旱脅迫下施加低濃度SLs，MDA含量有所下降，說明SLs可在一定程度上降低黑果枸杞細胞膜脂過氧化程度，抑制MDA的合成，這與魏如月等[36]研究結果一致。與此同時，植物體內也存在抗氧化系統清除氧自由基，抗氧化系統可分為抗氧化酶系統與抗氧化劑系統[37]，T-AOC可以用于衡量植物抗氧化系統能力的變化。本研究中干旱脅迫下T-AOC增強，在施加SLs后T-AOC上升幅度增大，說明SLs可提高黑果枸杞抗氧化能力抵御干旱，這與萬林等[38]研究中發現外源施加SLs可通過增強超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶活性以及增加抗壞血酸和谷胱甘肽等抗氧化物含量來降低植物體內活性氧水平一致，但在本研究中SLs具體影響哪些抗氧化酶或抗氧化物還未知，需進行進一步試驗。

低濃度植物激素對植物生長有促進效應，高濃度植物激素存在一定的抑制作用[39]，SLs也存在類似效應，本研究中低濃度SLs處理后干旱脅迫下種子的萌發、葉片的葉綠素含量、脯氨酸含量上升，高濃度SLs處理組下降，說明低濃度SLs可提高黑果枸杞抗旱能力從而促進植物生長，高濃度SLs對黑果枸杞的生長有一定抑制作用。

4 結論

1 μmol·L-1外源獨腳金內酯浸種后使干旱脅迫下黑果枸杞種子的發芽率、發芽指數、活力指數達到峰值，低濃度即0.18，0.4，1 μmol·L-1外源獨腳金內酯對種子的萌發均有一定促進效果，高濃度即10 μmol·L-1外源獨腳金內酯處理降低干旱脅迫下種子的發芽率、發芽勢，具有一定抑制效果；0.18，0.4，1 μmol·L-1外源獨腳金內酯灌施幼苗后能通過提高葉綠素含量、游離脯氨酸含量以及提高抗氧化能力來緩解干旱脅迫對黑果枸杞幼苗的傷害，提高其抗旱性，且以1 μmol·L-1處理效果最佳。