貯藏年限對白三葉種子萌發、幼苗生長及生理特性的影響

呂艷敏，花 梅，張曉明，穆瀛通，李曉杰，郝 寧，奧 運，王俊杰

(內蒙古農業大學草原與資源環境學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

種子是農業生產中的基本資料，其質量的好壞直接關系到后期飼草的產量和品質[1]。種子也是植物種質資源長期保存的理想材料，而種質資源能夠長期保存是品種改良的前提[2]。即使在最佳條件下長期貯藏，種子活力也不可避免地會持續下降。種子老化是一個累積不可逆轉的過程。不同貯藏條件下，隨貯藏時間的增加，種子逐漸老化，使得種子發芽率[3]、發芽勢[4]、發芽指數[5]、活力指數[6]降低甚至喪失，幼苗的生長也會受到抑制[7]，對農業生產和種質資源更新均有嚴重影響[8]。大量研究表明，膜完整性喪失、酶降解、呼吸減弱、遺傳物質降解等是種子發生老化的主要生理表現[9-12]，其中，抗氧化酶作為細胞內的自由基清除劑，能夠降低種子老化過程中自由基對種子細胞膜的攻擊，使得細胞膜脂質的過氧化作用降低，從而降低種子老化速率[2]。近年來，已有學者對披堿草(ElymusdahuricusTurcz.)、煙草(NicotianatabacumL.)、菊苣(CichoriumintybusL.)、油松(PinustabuliformisCarr.)等種子老化進行較系統的研究，發現種子老化會破壞其細胞膜的完整性，加深其脂質過氧化損傷程度，抗氧化酶及呼吸關鍵酶的活性下降，進而導致種子活力降低[13-16]。目前，關于貯藏時間對白三葉種子活力及生理生化特性變化規律的研究鮮有報道。白三葉(TrifoliumrepensL.)是一種營養價值高、草質細嫩、產量高的優質豆科牧草[17-18]，且植株低矮、再生能力強，在國內外城市綠化、水土保持、生態環境保護中具有重要地位[19]。本研究中的白三葉新品系是內蒙古農業大學王俊杰教授團隊以野生白三葉為原始材料，通過人工栽培馴化選育而成的，具有較強的抗寒性，可在內蒙古地區大面積推廣種植，解決白三葉在內蒙古地區無法越冬的問題。本試驗以貯藏0～5年的白三葉新品系種子為試驗材料，通過測定種子萌發指標、幼苗生長及生理指標，探討白三葉種子老化規律，以期為白三葉種質資源的安全保存和在實際生產中提高種子質量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白三葉新品系是內蒙古農業大學王俊杰教授團隊以內蒙古大興安嶺山區野生白三葉為原始材料，經多年多代人工栽培、馴化、系統選育而成的耐寒型白三葉。供試材料種子產自內蒙古農業大學試驗田，分別于2021，2020，2019，2018，2017，2016年收獲，置于種子儲藏柜中避光貯藏(恒溫4℃、濕度30%)。分別在貯藏0，1，2，3，4，5年后進行發芽試驗和生理指標的測定。

1.2 種子萌發及幼苗生長指標的測定

使用5%的NaClO溶液對種子消毒10 min，蒸餾水反復進行沖洗，濾紙吸干水分備用。將100粒種子均勻放入鋪有兩層濾紙的培養皿(d=12 cm)中，再將培養皿置于20℃人工智能培養箱中恒溫培養，4次重復。以胚根突破種皮視為發芽種子，每日統計發芽的種子數量，第4 d計算發芽勢(Germination potential，GP)。于第10 d統計發芽率(Germination rate，GR)、發芽指數(Germination index，GI)和活力指數(Vigour index，VI)，測定幼苗的芽長(Bud length，BL)、根長(Root length，RL)以及鮮重(Fresh weight，FW)。

活力指數(VI)=GI×FW[1]

其中，式中，Gt為t日的發芽種子數，Dt為相應的發芽天數。

1.3 種子相對電導率、抗氧化酶及呼吸關鍵酶活性的測定

相對電導率的測定：參照郝楠等[21]的方法，分別從不同貯藏年限中選取種皮完整的種子100粒，稱重后放入燒杯中，加入250 mL去離子水，用電導儀測定初始電導率；用保鮮膜將燒杯封口，室溫下靜置24 h,測量種子浸出液電導率，3次重復取平均值。

抗氧化酶活性的測定：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍四唑法[22]測定,過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創木酚法[22]測定,過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法[22]測定，3次重復取平均值。

呼吸關鍵酶活性的測定：細胞色素C氧化酶(Cytochrome coxidase，COX)和異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，ICDH)活性采用分光光度法[22]測定；酸性磷酸酶(Acid phosphatase，APA)活性采用比色法[23]測定；蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)活性采用紫外吸光光度法[24]測定，3次重復取平均值。

1.4 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2019進行數據整理，SPSS 27.0對數據進行方差分析，OriginPro 2021軟件制圖。

利用模糊數學隸屬函數法[25]對不同貯藏年限下的白三葉種子質量進行綜合評價，首先分別計算出各指標的隸屬函數值，然后按照隸屬函數值的平均值進行排名。

如果某個指標與種子質量正相關，計算公式如下：

如果某個指標與之負相關，則用反隸屬函數進行計算，計算公式如下：

式中：U(Xi)為隸屬函數值，Xi為某個指標的測定值，Xmax和Xmin為所有處理中某個指標的最大值和最小值。

2 結果與分析

2.1 貯藏年限對白三葉種子萌發的影響

貯藏1年的種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數顯著高于貯藏3～5年的種子(P<0.05)(圖1)。其中，白三葉種子發芽率和發芽勢隨貯藏時間的增加呈先上升后下降的趨勢，0～2年貯藏期內，白三葉種子發芽率和發芽勢無顯著差異，貯藏3年的種子發芽率和發芽勢開始顯著下降，到貯藏5年時，白三葉種子發芽率和發芽勢均顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖1A,圖1B)。隨貯藏年限增加，白三葉種子發芽指數和活力指數變化趨勢一致，其中，貯藏1年的的種子發芽指數和活力指數顯著高于其他貯藏年限(P<0.05)；貯藏2～3年的種子發芽指數和活力指數顯著高于貯藏4～5年的種子(P<0.05)，貯藏4年的種子發芽指數和活力指數顯著高于貯藏5年的(P<0.05)，貯藏5年的種子發芽指數和活力指數顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖1B,圖1C)。

圖1 不同貯藏年限白三葉種子萌發指標的變化

2.2 貯藏年限對白三葉幼苗生長的影響

隨貯藏年限的增加，白三葉幼苗芽長、根長及鮮重呈先上升后下降的趨勢，且各指標均在貯藏1年表現最佳(表1)。其中1～5年貯藏期內，白三葉幼苗芽長和根長逐漸下降，表現為各貯藏年限間差異顯著(P<0.05)。白三葉幼苗鮮重在貯藏1年時達到最大值為0.56 g，顯著高于其他各貯藏年限(P<0.05)；貯藏2年的白三葉幼苗鮮重顯著高于貯藏4，5年的(P<0.05)；貯藏4年的白三葉幼苗鮮重顯著高于貯藏5年的(P<0.05)；貯藏5年的白三葉幼苗鮮重顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)。

表1 貯藏年限對白三葉幼苗生長的影響

2.3 貯藏年限對白三葉種子相對電導率及抗氧化酶活性的影響

白三葉種子相對電導率隨貯藏年限的增加呈上升趨勢，其中，貯藏0年的種子相對電導率最低，為6.69%，顯著低于貯藏2～5年的種子(P<0.05)，貯藏2～3年的種子相對電導率顯著低于貯藏4～5年的(P<0.05)，貯藏4年的種子相對電導率顯著低于貯藏5年的(P<0.05)(圖2A)。白三葉種子POD活性在0～4年貯藏期內無顯著差異，平均值為7.02 U·g-1；貯藏5年的種子POD活性顯著低于貯藏0，1年的(P<0.05)，僅為5.40 U·g-1(圖2B)。隨貯藏時間的增加，白三葉種子SOD和CAT活性逐漸下降，其中，0～2年貯藏期內，SOD和CAT活性無顯著差異；貯藏4年后，其活性開始顯著下降，到貯藏5年時，SOD和CAT活性顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖2C,圖2D)。

圖2 不同貯藏年限白三葉種子相對電導率及抗氧化酶活性的變化

2.4 貯藏年限對白三葉種子呼吸關鍵酶活性的影響

隨貯藏年限的增加，白三葉種子COX，MDH，ICDH活性呈下降趨勢(圖3)。其中，貯藏0年的種子COX，MDH，ICDH活性顯著高于貯藏2～5年的(P<0.05)，貯藏1年的種子COX，MDH，ICDH活性顯著高于貯藏4～5年的(P<0.05)，貯藏2～3年的種子COX，MDH，ICDH活性無顯著差異，貯藏5年的種子COX，MDH，ICDH活性顯著低于其他各貯藏年限(P<0.05)(圖3A,圖3B,圖3C)。白三葉種子APA活性隨貯藏年限的增加呈先上升后下降的趨勢，在貯藏1年時達到最大值，之后逐漸下降，其中1～5年貯藏期內，白三葉種子APA活性表現為各貯藏年限差異顯著(P<0.05)(圖3D)。

圖3 不同貯藏年限白三葉種子呼吸關鍵酶活性的變化

2.5 綜合分析

本試驗采用隸屬函數法，以發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、芽長等15項指標作為評價指標，綜合評價不同貯藏年限白三葉種子的質量。貯藏6年下白三葉種子的平均隸屬函數值在0.00～0.96(表2)。根據平均隸屬函數值進行排序，得出貯藏6年下的白三葉種子質量由高到低依次為：貯藏1年>貯藏0年>貯藏2年>貯藏3年>貯藏4年>貯藏5年。

表2 不同貯藏年限下白三葉種子各指標隸屬函數值及綜合評價

3 討論

3.1 貯藏年限對白三葉種子萌發的影響

種子老化是貯藏過程中影響種子質量和活力的主要原因之一，在種子貯藏過程中，保持較高水平的種子質量和活力至關重要[12]。發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數代表種子活力的高低，同時也是衡量種子質量的重要指標[26]。隨著貯藏時間的延長，種子逐漸老化，表現為種子發芽率、發芽勢等相關萌發指標逐漸下降[27-28]。本試驗結果顯示，白三葉種子貯藏0～2年發芽率和發芽勢無顯著差異，白三葉種子貯藏1～5年發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數隨貯藏時間的延長呈下降趨勢。這表明白三葉種子在自然環境和自身生理生化指標等因素的共同作用下，老化程度加深，種子活力逐漸降低，這與許美玲等[29]研究結果一致。

3.2 貯藏年限對白三葉幼苗生長的影響

植物的生長指標可以較直觀地表現出其受影響程度。貯藏多年的種子在室內做發芽試驗時可以萌發，而在田間條件下很難出苗，或出苗不正常，這類種子雖然有生命力，但其活力較低，逆境條件下不能成為正常苗，在農業生產上失去了種用價值[30]。本研究以貯藏0～5年的白三葉種子為試驗材料，研究結果表明貯藏年限對白三葉幼苗的生長產生抑制作用，其原因可能與因貯藏年限增加導致種子活力下降有關，這與張熙穎[31]的研究結論基本一致。辛慧慧等[32]也發現了貯藏年限的延長會降低紫羊茅和葦狀羊茅幼苗長度和胚根長度，進一步證明了貯藏年限越長，幼苗長勢越弱。

3.3 貯藏年限對白三葉種子相對電導率及抗氧化酶活性的影響

長期貯存會使種子老化，使細胞膜的完整性降低，酶促抗氧化系統遭受損傷，從而引起膜脂過氧化，加劇種子劣變程度，造成種子活力下降[33]。種子浸提液的相對電導率可反映種子內溶性物質的滲透程度，而滲透程度又可間接地反映出細胞膜的完整性[34]。SOD，POD和CAT共同構成了酶促抗氧化系統，SOD能將超氧陰離子歧化并將其轉化為過氧化氫和氧氣，有效減少活性氧的危害，從而建立起植物的抗氧化屏障。然后，在POD的協助下，CAT將過氧化氫分解為氧氣和水，從而將活性氧的傷害降到最低[35]。本研究結果表明，隨貯藏年限的增加，白三葉種子的相對電導率逐漸升高，SOD，POD和CAT活性逐漸下降，即白三葉種子老化后，種子內部可溶性物質的滲出量不斷增加，使其細胞膜的完整性降低，從而破壞了酶促抗氧化系統，引發細胞膜脂過氧化，加劇種子退化，進而影響種子的活力，這與前人研究結果一致[36]。

3.4 貯藏年限對白三葉種子呼吸關鍵酶活性的影響

呼吸是所有生活細胞共同存在的一種生物行為，是植物新陳代謝過程中必不可少的一部分，為所有生物的生命活動提供了必要的的能量，對植物有著十分重要的意義[1]。在貯藏期間，種子的呼吸功能會逐步減弱，發芽率也相應地降低，并且在萌發能力完全喪失之前，表現出一種較為復雜的呼吸模式[12]。已有研究表明，經老化處理的種子，與呼吸有關的信號酶COX、MDH活性降低，線粒體的電子傳遞鏈還原性提高、呼吸控制比降低，氧化磷酸化進程受到抑制，使ATP合成基質供應減少，從而導降低種子的活力，最終失去萌發能力[37-39]。本研究結果顯示，COX,ACP,IDH,MDH活性整體上隨貯藏年限的增加而降低，即種子呼吸作用逐漸減弱，導致種子活力下降，與Xin等[37]研究結果一致。

4 結論

白三葉種子的萌發指標和幼苗生長指標隨貯藏年限的增加呈先上升后下降的趨勢，均在貯藏1年時達到最大值；隨貯藏年限的增加，種子相對電導率逐漸上升，抗氧化酶和呼吸關鍵酶活性逐漸下降。采用隸屬函數法對不同貯藏年限下的種子進行綜合評價，得出貯藏0或1年的白三葉種子種用價值較高，最適合農業實際生產使用。