苦杏仁油微膠囊制備工藝優化及氧化穩定性研究

韓金承，孟 鑫，吳慎威，閆伊狄

（錦州醫科大學食品與健康學院，遼寧 錦州 121000）

苦杏仁油是一種富含不飽和脂肪酸的新型食用油，其油酸含量比肩橄欖油，由此也決定了苦杏仁油易發生氧化劣變[1]。油脂氧化是指油脂受氧氣、高溫等因素影響，使油脂中脂肪酸發生氧化分解的過程。油脂氧化首先會形成游離脂肪酸、過氧化物等初級產物，過氧化物會進一步分解成醛、酮等次級產物，并產生“哈喇味”，此時油脂具有潛在毒性，不適宜食用[2-3]。油脂氧化無時無刻不在發生，如果不提高油脂的抗氧化能力，則會造成極大的經濟損失。

目前常用的提高油脂抗氧化能力的手段主要有改變貯藏環境、添加抗氧化劑、微膠囊化等。改變貯藏環境主要是將油脂置于避光或低溫的環境中，盡管該方法簡單有效，但對環境及設備的要求較高[4]。添加抗氧化劑主要是向油脂中添加特丁基苯二酚（TBHQ）、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）等化學物質，但目前對于此類化學物質的安全性尚存在爭議[5]。微膠囊化是指利用一些兩親類物質為壁材將油脂包埋起來，再通過干燥技術干燥后得到結構類似膠囊的顆粒，可以隔絕氧氣、光照等不利條件，從而延長油脂的保存周期。目前微膠囊技術廣泛應用于食品、醫藥等行業，是一種極具發展潛力的加工技術[6-7]。

為提高苦杏仁油微膠囊包埋率，并了解微膠囊化對提高油脂抗氧化能力的作用，本研究首先通過響應面法對微膠囊制備工藝進行優化，再使用該條件下所得的微膠囊進行加速氧化試驗，比較微膠囊化前后苦杏仁油中過氧化值、碘值、酸價、皂化值、共軛二烯烴值的變化，同時利用傅里葉紅外光譜進行掃描分析，從而判斷微膠囊化對減緩油脂氧化進程的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

苦杏仁：購于錦州中藥材市場；堿性蛋白酶：酶活2×106U/g，購自南寧龐博生物工程有限公司；β-環狀糊精：食品級，河南萬邦實業有限公司；大豆分離蛋白：食品級，河南興源化工產品有限公司；改性大豆磷脂：食品級，武漢曙爾生物科技有限公司。

韋氏試劑（I∶Cl=1∶1）：上海麥克林生化科技有限公司；溴化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、無水乙醇、環己烷、硫代硫酸鈉、碘化鉀、石油醚（沸程30～60℃）、氫氧化鉀、異丙醇、酚酞、異辛烷、鹽酸：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

UC-9600型超聲波清洗機：深圳市朗杰超聲電器有限公司；PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；H01-2A型磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；TDL-5-A型離心機：上海安亭科學儀器廠；GJB2000-25型均質機：常州市超力均質泵廠；TF-FD-27S普通型真空冷凍干燥機：上海田楓實業有限公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；FTIR-850型傅立葉變換紅外光譜儀：天津港東科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦杏仁的預處理

采用超聲波脫苦法去除苦杏仁中的苦杏仁苷[8-9]。將苦杏仁投入沸水中保溫10 min，取出脫皮，按照料液比1∶12（g/mL）的比例加入蒸餾水，超聲處理60 min（55℃，300 W），取出后于100℃鼓風干燥箱中干燥至恒重。

1.2.2 苦杏仁油的提取

將預處理過的苦杏仁粉碎后，過40目網篩，按照料液比1∶8（g/mL）的比例加入體積分數為20.5%的乙醇溶液混勻，調節溶液pH為9.5，向溶液中加入3.5%的堿性蛋白酶并混勻，于45℃條件下以750 r/min磁力攪拌酶解147 min，結束后將溶液置于90℃水浴鍋中水浴滅酶并揮發乙醇10 min，滅酶后的溶液于4 000 r/min條件下離心15 min，吸出油層[10]。

1.2.3 苦杏仁油微膠囊的制備

壁材溶液：選擇具有兩親性質的β-環狀糊精和大豆分離蛋白為壁材來包埋更多的苦杏仁油，按照3∶1（g/g）的比例將二者混合后加入16倍質量的蒸餾水，于60℃、800 r/min的條件下磁力攪拌至壁材溶解均勻。

芯材溶液：苦杏仁油中加入2%的改性大豆磷脂攪拌均勻后于60℃水浴鍋中烊化20 min。

將芯材按照1∶80（g/mL）的比例加入至壁材溶液中，于60℃、300W的條件下進行超聲乳化處理20min，然后于60℃、1 000 r/min條件下磁力攪拌30 min，結束后于25 MPa的條件下高壓均質，得微膠囊乳狀液；將所得乳狀液倒入冷凍干燥物料盤中，高度≤1 cm，于-18℃條件下保存12 h，取出后于-80℃、1 Pa的條件下冷凍干燥12 h，得苦杏仁油微膠囊[11]。

1.2.4 微膠囊包埋率計算

稱取微膠囊粉末于漏斗中，用適量石油醚反復濾洗3次后烘干至恒重，稱取濾洗后的苦杏仁油微膠囊，置于索氏提取裝置中進行抽提，得到微膠囊中包埋的苦杏仁油。按照下式計算苦杏仁油微膠囊的包埋率。

式中：m1為微膠囊制備前苦杏仁油的質量，g；m2為所包埋的苦杏仁油的質量，g。

1.2.5 響應面優化試驗設計

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken中心組合設計原則，以微膠囊包埋率為評價指標，選擇壁材料液比、乳化劑添加量、芯壁比為主要影響因素，進行三因素三水平的響應面優化分析，根據前期預試驗確定的響應面試驗因素水平見表1。

表1 微膠囊制備工藝響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test for microcapsule preparation process

1.2.6 傅里葉紅外光譜分析

掃描條件：范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數32次，采集背景為空氣[12]。將苦杏仁油直接滴加在KBr壓片上進行掃描；取2 mg微膠囊樣品與100～200 mg溴化鉀混合研磨均勻后壓成薄片進行掃描。

1.2.7 Schaal烘箱加速氧化試驗

取150 g苦杏仁油分裝于3個燒杯中，另取500 g微膠囊分裝于5個燒杯中，將燒杯敞口置于（60±1）℃的烘箱中進行連續21 d的加速氧化試驗，期間每24 h攪動一次[13]。在0、3、6、9、12、15、18、21 d時，分別參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》[14]中的滴定法、GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》[15]中的冷溶劑指示劑滴定法、GB/T 5532—2008《動植物油脂 碘值的測定》[16]、GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》[17]、GB/T 22500—2008《動植物油脂紫外吸光度的測定》[18]測定苦杏仁油中過氧化值、酸價、碘值、皂化值、共軛二烯烴（測定波長為232 nm）的變化?？嘈尤视臀⒛z囊各項指標檢測時先利用索氏提取法提取其中的苦杏仁油后再按照上述標準檢測。

1.2.8 數據處理

數據統計類的試驗均進行3次重復，使用SPSS 18.0軟件進行數據分析，結果以xˉ±s表示；折線圖采用OriginPro 9制作；傅里葉紅外光譜圖采用OMNIC 9.2.86軟件進行制作。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果

2.1.1 模型的建立與結果

以微膠囊包埋率（Y）作為響應值，分別將壁材料液比（A）、乳化劑添加量（B）、芯壁比（C）作為自變量，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken中心組合進行三因素三水平的響應面試驗設計，結果見表2。對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合，得到當前條件下微膠囊包埋率與各因素間的二次多項回歸方程為：Y=83.57+0.49A+1.68B+1.88C+0.81AB+1.01AC-0.25BC-2.45A2-6.01B2-1.89C2。

表2 微膠囊包埋響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment for microcapsule entrapment

方差分析結果見表3。由表3可知：模型P值小于0.000 1，表示模型極顯著，試驗方法可靠；失擬項的P值為0.088 8（＞0.05），表示模型差異不顯著，說明該方程與試驗失擬較小，結果能更好地反映試驗的真實性；微膠囊包埋率回歸模型的R2和R2adj分別為0.990 4和0.978 1，R2和R2adj值越接近1，表明模型呈線性回歸，擬合效果好，可用于分析與計算。由F值可知，各因素對微膠囊包埋率的影響順序為C＞B＞A。

表3 微膠囊包埋率二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic model for entrapment rate of microcapsules

2.1.2 響應面分析

響應面曲線圖反映兩個因素之間交互作用的變化幅度，如果兩個因素之間交互作用越明顯，則曲面越陡；等高線反映兩個因素之間交互作用的顯著情況，如果兩個因素之間交互作用顯著，則越趨近橢圓形。各因素交互作用的響應面圖與等高線圖見圖1。

根據圖1中各因素相互影響的曲面圖可以看出：各因素兩兩組合均產生較明顯的交互影響，兩個因素之間其中一個因素條件變化均會對另一個條件產生影響；根據等高線圖可以看出AB、AC兩組合之間的等高線呈現出橢圓形，說明兩個因素之間交互影響顯著（P＜0.05）。將圖中反映的情況與P值相結合可以看出，兩兩因素交互作用對苦杏仁微膠囊包埋率影響的顯著程度從大到小的順序為：AC＞AB＞BC。

2.1.3 最優條件的預測與驗證

結合回歸模型優化后得到微膠囊包埋最佳工藝條件為：壁材料液比1∶16.27（g/mL），乳化劑添加量2.07%，芯壁比1∶85.19（g/mL），預測包埋率為84.17%。結合實際操作的方便性將工藝條件調整為：壁材料液比1∶16（g/mL），乳化劑添加量2.1%，芯壁比1∶85（g/mL）。按照上述條件進行3次平行驗證試驗，得到微膠囊平均包埋率為84.07%±0.37%，與預測值接近。由此可見，以上模型參數準確可靠，具有實際應用價值。

2.2 壁材、芯材、微膠囊紅外光譜圖對比分析

傅里葉變換紅外光譜是一種記錄吸收紅外光輻射后能量發生改變的譜圖，根據譜圖中各官能團吸收峰的強度與波數分布情況可以推測出混合物的成分組成和變化?？嘈尤视?、壁材、微膠囊紅外光譜對比情況見圖2。

圖1 各因素間的交互作用對苦杏仁微膠囊包埋率影響的響應面圖與等高線圖Fig.1 The response surface diagram and contour map of the interaction between factors on entrapment rate of bitter almond microcapsule

圖2 壁材、芯材、微膠囊的傅里葉紅外掃描情況對比Fig.2 Comparison of FT-IR spectrum of wall materials,core materials and microcapsules

根據測試結果分析可知：壁材位于3 340 cm-1處出現氨基N-H振動吸收峰，而包埋成微膠囊后該峰偏移至3 366 cm-1處；壁材位于2 927 cm-1處出現烷烴C-H伸縮振動產生的單個吸收峰，芯材則位于3 006 cm-1、2 924 cm-1和2 854 cm-1處存在該官能團的3個吸收峰，而包埋成微膠囊后吸收峰則出現在2 926 cm-1和2 856 cm-1處；壁材位于1 416 cm-1和1 368 cm-1處含有烷烴C-H彎曲振動產生的吸收峰，芯材則是位于1 461 cm-1和1 374 cm-1處含有該峰，而包埋成微膠囊后該峰偏移至1 418 cm-1和1 367 cm-1處；壁材位于942 cm-1、758 cm-1和707 cm-1處含有烯烴C-H面外彎曲振動，芯材位于723 cm-1處含有芳烴C-H面外彎曲振動，而包埋成微膠囊后則偏移至940 cm-1、757 cm-1、706 cm-1處；芯材位于1 745 cm-1處出現羰基C=O伸縮振動產生的強吸收峰，而包埋成微膠囊后該峰則位于1 746 cm-1處且吸收強度減弱；壁材位于1 643 cm-1處存在烯烴C=C伸縮振動產生的吸收峰，而包埋成微膠囊后該峰偏移至1 644 cm-1處并出現峰值減弱的變化；壁材位于1 249 cm-1、1 157 cm-1、1 081 cm-1和1 028 cm-1處含有氨基C-N伸縮振動產生的吸收峰，芯材位于1 237 cm-1、1 164 cm-1和1 096 cm-1處存在芳香醚、脂肪醚等醚類物質的伸縮吸收峰，而包埋成微膠囊后則在1242cm-1、1157cm-1、1 082 cm-1和1 031 cm-1處形成特征性吸收峰；壁材位于579 cm-1和534 cm-1處存在的吸收峰與微膠囊位于578 cm-1和529 cm-1處存在的吸收峰可能是溴化鉀的存在導致的結果[19-20]。綜上，包埋后所形成微膠囊的吸收峰與芯材和壁材之間產生一定的偏移、減少或增加，表明微膠囊制備成功，可用作獨立分析。

2.3 加速氧化試驗下苦杏仁油微膠囊化前后品質變化對比

過氧化值是判斷油脂品質的重要指標之一，同時也是油脂氧化過程中最早出現變化的指標。GB 2716—2018《食品安全國家標準 植物油》[21]中規定，將過氧化值≤0.25 g/100 g作為食用油品質的最低評判標準。碘值是判斷油脂飽和程度的指標，碘值越高，說明油脂不飽和程度越高。酸價是判斷游離脂肪酸含量的指標，如果酸價升高，說明油脂發生氧化分解產生游離脂肪酸。皂化值是判斷脂肪酸分子量大小的指標，主要用來反映脂肪酸氧化穩定程度。共軛二烯烴是油脂氧化產生的主要初級氧化產物[22-23]。在常溫環境中測試油脂氧化變化是一個漫長的過程，因此采用烘箱加速氧化法來了解微膠囊化前后苦杏仁油品質的變化情況，結果如圖3所示。

圖3 苦杏仁油與苦杏仁油微膠囊的氧化穩定性對比Fig.3 Comparison of oxidation stability between bitter almond oil and bitter almond microcapsule

根據測試結果（圖3）可見，苦杏仁油加速氧化期間，過氧化值的變化主要分為3個階段：第一階段是0～6 d，此時苦杏仁油的過氧化值變化不明顯，甚至在3 d時低于初始值，造成這一結果的原因可能是由于這一階段苦杏仁油中存在豐富的VE等抗氧化物質，抗氧化劑可以及時提供H+給自由基，從而抑制了苦杏仁油的氧化進程。6～9 d時，油脂中過氧化值呈現急劇升高的趨勢，可能是由于此時苦杏仁油中不飽和脂肪酸的碳鏈斷開，與此同時，VE本身也會發生不可逆的氧化分解，低劑量的抗氧化劑無法與新產生的氫過氧化物結合，從而形成大量的游離脂肪酸和初級氧化產物——過氧化物，導致油脂體中過氧化值明顯升高的變化；觀察酸價和皂化值的變化可以發現，從第6～9天開始苦杏仁油中酸價和皂化值逐漸升高，表明此時苦杏仁油中的脂肪酸發生氧化分解。12～21 d時過氧化值的升高趨勢開始變緩，且存在下降的變化趨勢，可能是由于過氧化物逐漸分解為次級氧化產物——醛、酮等羰基類化合物，新產生的過氧化物與被分解的過氧化物形成了一種動態平衡，從而使得此時油脂體中的過氧化值增加趨勢變得平緩，但此階段苦杏仁油的過氧化值已超過0.25 g/100 g。觀察共軛二烯烴值的變化則明顯看到0～15 d時，油脂中共軛二烯值的變化呈現平緩地波動變化，而第15天之后開始升高，說明此時油脂體中生成了大量羰基類化合物。儲藏期間苦杏仁油中碘值的變化幅度較小，15～21 d碘值略微降低可能是由于不飽和脂肪酸氧化分解，使得苦杏仁油中存在的飽和脂肪酸的絕對值升高，從而導致這一變化[24-25]。而苦杏仁油微膠囊在儲藏過程中各項氧化指標的變化整體呈現一種不易察覺的增長，可能是由于壁材的保護減少了所包埋的苦杏仁油與氧氣接觸，從而減緩了氧化進程。結果表明：隨著儲藏時間的延長，苦杏仁油的品質呈逐漸下降的趨勢，而微膠囊化處理后的苦杏仁油品質的改變程度較小，說明微膠囊化對于延長苦杏仁油的儲存周期具有一定的積極作用。

2.4 苦杏仁油和苦杏仁油微膠囊加速氧化期間的傅里葉紅外光譜分析結果

苦杏仁油是一類成分復雜的有機物，其氧化分解變化受到多種因素的影響，苦杏仁油在儲藏過程中過氧化值、碘值、酸價、皂化值、共軛二烯烴值均發生改變。為了解苦杏仁油氧化期間各官能團所發生的變化，采用傅里葉紅外光譜對樣品進行分析?？嘈尤视图翱嘈尤视臀⒛z囊加速氧化期間的傅里葉紅外光譜圖變化情況見圖4。

苦杏仁油3 006 cm-1附近吸收峰主要反映油脂中脂肪酸的不飽和程度，2 924 cm-1和2 854 cm-1附近吸收峰主要反映油脂中的飽和脂肪酸。圖4顯示：隨著儲藏時間的延長，苦杏仁油中不飽和脂肪酸的吸光度值逐漸下降，3 d時表現出較弱的上升趨勢，可能是由于油脂中某些物質揮發而使得不飽和脂肪酸的絕對值相應提高導致，當第21天測量時出現了比較明顯的升高趨勢，可能是過氧化物進一步氧化分解為醛、酮等次級氧化產物導致的，由此推測苦杏仁油中不飽和脂肪酸發生了氧化分解，使得其含量逐漸降低；苦杏仁油微膠囊的吸收峰呈現出了一種交替的變化規律，可能是由于苦杏仁油中抗氧化物質的存在延長了苦杏仁油氧化的過程。苦杏仁油中1 237、1 163、1 096 cm-1附近和苦杏仁油微膠囊1 157、1 081 cm-1附近處吸收峰主要與酯中C-O伸縮振動和脂肪酸族彎曲振動有關。根據試驗結果發現：第9天開始，苦杏仁油中該段吸收峰呈現下降的變化趨勢，說明此時苦杏仁油中的脂肪酸發生氧化；而苦杏仁油微膠囊此段峰值變化趨勢不明顯，說明苦杏仁油微膠囊發生的變化小。

圖4 苦杏仁油（A）和微膠囊（B）加速氧化期間的傅里葉紅外光譜圖變化情況Fig.4 Changes of FT-IR spectra of bitter almond oil(A)and microcapsules(B)during accelerated oxidation

苦杏仁油1 745 cm-1附近和苦杏仁油微膠囊1 747 cm-1附近吸收峰的變化主要與羰基碳氧雙鍵有關。觀察發現：苦杏仁油中該段吸收峰隨著儲藏時間的延長整體呈現逐漸減少的趨勢，說明隨著儲藏時間的延長，碳氧雙鍵結構氧化斷裂而產生吸收峰下降的趨勢，其中6～9 d之間出現了明顯的下降，可能是由于苦杏仁油中抗氧化物質減少導致油脂體抗氧化能力減弱，最后出現劇烈的下降趨勢，16～21 d之間出現明顯的先降低后升高的變化，可能是脂肪氧化生成其他化合物含量升高而使得整體含量升高，而通過觀察脂肪烯（1 675～1 640 cm-1）附近位置的變化發現，21 d時測量苦杏仁油中脂肪烯的含量顯著升高，說明可能是受到脂肪烯含量的改變而導致?？嘈尤视臀⒛z囊位于該段的吸光度值隨著儲藏時間的延長的變化情況，可能是由于微膠囊壁材的保護而使得油脂的氧化與抗氧化之間呈現了一種平衡狀態。

苦杏仁油1 460 cm-1附近的峰值變化可能和油脂中C=C雙鍵有關。由圖4可見：隨著儲藏時間的延長，C=C雙鍵的吸收峰逐漸下降，表明油脂發生分解；苦杏仁油微膠囊在儲藏期間該段峰值變化趨勢較微弱。723 cm-1附近峰值可能與油脂中烯烴值的變化有關。根據吸光度值的變化可知，隨著儲藏時間的延長，苦杏仁油的烯烴值也發生改變，儲藏21 d的樣品烯烴值比儲藏18 d的樣品明顯增大，說明此時產生了次級氧化產物[26-27]；苦杏仁油微膠囊中烯烴值的變化幅度不明顯，說明苦杏仁油微膠囊中油脂的氧化分解程度較低。綜上可以看出，微膠囊化有利于油脂的保存。

3 結論

采用響應面法優化苦杏仁油微膠囊制備工藝，最佳工藝條件為：壁材料液比1∶16（g/mL），乳化劑添加量2.1%，芯壁比1∶85（g/mL）。該工藝條件下制得的微膠囊平均包埋率為84.07%±0.37%，符合預測值。加速氧化試驗表明：當加速氧化6 d時，苦杏仁油開始發生氧化分解反應；當加速氧化12 d時，苦杏仁油中過氧化值超過了食用油最低限量標準（0.25 g/100 g）；微膠囊化后苦杏仁油的氧化周期明顯變長，表明微膠囊化有利于延長油脂的儲藏時間。油脂氧化是一個不可避免發生的變化，本文在延長苦杏仁油保存期方面提供了試驗基礎，為減少油脂資源浪費方面提供了理論依據。