殼聚糖基微球在口腔組織病損治療中的研究進展

周華俊，丁榆德，楊 帆

殼聚糖是由自然界儲量豐富的幾丁質經酶處理或化學處理的方法，脫去部分乙酰基后得到的一種有機高分子材料。它具有生物相容性良好、抗菌等特性[1]。藥劑學上的微球(圖1)通常是指藥物溶解或分散在納米和微米尺度的球形或類球形物體。微球需使用微球加工技術制備而成，有更大的比表面積，利于細胞黏附和增殖，提高藥物的傳送能力，在藥物載體、組織工程學支架等應用方面具有一定優勢[2]。而殼聚糖的可塑性強，是目前制備微球的主要材料之一，可通過乳化交聯法、離子凝膠法、噴霧干燥法、凝聚沉淀法加工成殼聚糖基微球(chitosan-based microspheres，CBM)[3-6]。口腔作為一個特殊的“外環境”，局部用藥容易受進食以及唾液的影響，維持藥物足夠的緩釋時間往往是治療的難點。口腔組織缺損修復是一個周期性的過程，持續的藥物釋放對于組織反應的誘導作用更具有長效性。這就十分考驗口腔用藥載體的性能。CBM是一種易于加工，且具備良好載藥性能的藥物載體，同時，在口腔組織再生領域中還能起到支架的作用。目前，CBM在口腔臨床中的應用仍處于基礎研究階段，尚未真正應用于臨床。本文就目前國內外對于CBM在口腔頜骨組織缺損、牙周病損、牙體牙髓病變及神經組織損傷治療方面的研究進展作一綜述，為后續研究及最終實現臨床應用提供參考。

圖1 沉淀法制備的殼聚糖微球電鏡觀察

1 CBM在頜骨缺損修復中的作用研究

1.1 CBM搭載生長因子

用有機高分子材料作為骨再生支架，一直是頜骨缺損修復的研究熱點。殼聚糖良好的生物相容性、可降解性、無毒性及抗菌活性使其受到眾多學者關注和研究[7-9]。另外，微球可以負載蛋白類生長因子，并起到保護和緩控釋生長因子的作用[10]。骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是成骨生長因子之一，其骨誘導能力得到了動物學以及人類臨床研究的證實[11-12]。為了延長BMP-2的釋放時間，Xia等[13]采用離子凝膠法制備硫酸葡聚糖殼聚糖微球的載藥系統，相對于單純殼聚糖微球，陰離子硫酸葡聚糖先與BMP-2結合，再與陽離子殼聚糖攪拌成球，實現了更高的蛋白質包封率和加載比。同時，使得保持活性的BMP-2從該微球中持續釋放超過20 d。另一項動物實驗進一步研究了載BMP-2的CBM在雄性大鼠體內的異位成骨能力，證實殼聚糖/BMP-2微球系統顯著增強了BMP-2對異位成骨的誘導和促進作用[14]。這些研究結果均提示利用CBM搭載BMP-2在臨床修復骨缺損方面具有巨大的潛力。

但是，單純殼聚糖微球本身機械強度不足，單獨載藥使用時，無法有效維持骨增量空間。于是，學者們嘗試將殼聚糖復合其他材料，來提高骨增量過程中材料的機械性能，在調控載藥微球緩釋效率的同時，保證成骨過程的空間[15-16]。例如，Thangavelu等[15]通過離子交聯微球技術對現有植骨材料的再加工，混合雙相磷酸鈣，來提高CBM的力學性能，并證明其相較單純CBM具備更佳的骨傳導性能。Sobhani等[16]制備了一種新型磷酸鈣/聚磷腈多孔支架，與采用乳液離子法制備且載有BMP-2的CBM結合，研究其在骨缺損修復中的效果。研究發現，與單獨支架相比，載有BMP-2的支架既增加了細胞的成骨分化潛能，又克服了單純殼聚糖微球作為成骨材料強度不足的缺點，還改善了微球搭載BMP-2突釋的問題，為最終實現CBM搭載生長因子的臨床應用提供了新方式。

1.2 CBM增強屏障膜強度

在骨缺損修復中，屏障膜也是必不可少的材料之一。在骨缺損區填充骨材料后，表面覆蓋的屏障膜起到阻止成纖維細胞長入的作用，使得成骨細胞有充足的時間長入成骨材料之間進行骨組織重建。但是，現在使用的膠原屏障膜經常存在強度不足的問題，在骨引導再生(bone guided regeneration，GBR)過程中無法維持良好的成骨空間。而CBM在復合加入屏障膜的結構中后，不僅可以作為屏障膜中的藥物載體，同時也大大提升了膜的強度。有學者將納米羥基磷灰石/CBM加入殼聚糖膜中，發現它的抗斷裂強度是單純殼聚糖膜的3倍[17]。可見這種屏障膜在引導骨再生的應用中具有一定的前景。可以推測，CBM的添加，使得屏障膜的強度得到提升，可減少臨床技術敏感性，使骨增量的療效更具可預期性。

1.3 改性CBM雙相載藥功能

殼聚糖還可通過接枝羧基改性，經氯乙酸醚化后，得到水溶性的殼聚糖衍生物，提高成球后的降解速率。微球在控釋藥物的方面具有可注射性、低毒、高效等優點，實驗發現在小鼠骨愈合過程中，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達在早期達到峰值，而BMP-2表達在后期達到峰值[18-19]。Dou等[20]采用乳液法并用香草醛交聯制備羧甲基殼聚糖微球，以微球和膠原分別載藥，構建了具有BMP-2和VEGF雙因子復合的二級結構緩釋系統，支架實現了雙因子的順序釋放，VEGF和BMP-2雙因子的支架比僅有BMP-2的支架組有更多的膠原蛋白組織和新血管形成，最終促進成骨作用。多因子的協同作用可以降低藥物使用劑量，增強療效。利用CBM載藥功能可達到多因子協同作用，為實現高效的骨再生提供了新方法。

2 CBM在牙周病損中的修復中的作用研究

2.1 CBM搭載抗菌藥物

牙周疾病中，牙周或種植體周的炎癥反應伴隨始終，疾病末期還會出現骨喪失的現象。臨床中的非手術治療手段包括牙周基礎治療和藥物治療，而針對牙周袋這種局部的感染，局部用藥往往能避免全身用藥并發癥，并獲得一定的療效[21-22]。但是，牙周袋內的局部用藥會受到口腔環境的影響，唾液的沖刷、稀釋作用都會導致藥效維持時間過短，無法獲得滿意的療效。而CBM所具有的載藥性能、黏膜黏附性能，正是牙周局部用藥所需要的特性[23]。Yadav等[23-24]先采用離子凝膠法載抗菌藥的CBM，后又改良加入海藻酸鈉，控制了微球突釋，延長了藥物釋放時間，都驗證了兩種微球在黏膜的黏附和釋藥作用，且擁有抗菌活性，為牙周今后的局部用藥研究提供了新的思路。

隨著種植體的廣泛使用，種植體周圍炎的發病率逐年增高。種植體周圍炎的抗菌治療與牙周炎的治療方式相似，但因為種植體特殊的納米表面特征，種植體周機械清創的效果比牙周差，更需要抗菌藥物的協同作用。Yoon等[25-26]進行了載米諾環素的殼聚糖-海藻酸鈉微球(chitosan-alginate，CA)用于比格犬種植體周圍炎和種植體黏膜炎的動物學實驗，發現該微球表現出了長而持久的抑菌效果。對于動物種植體周的炎癥治療，聚丙烯酸酯甘油微球(polyacrylate-glycerin，PG)組在第14天已無藥物殘留，CA組可以檢測到藥物。體外抗菌實驗中，CA組的抗菌時間為(7.0±5.7)d，而PG組為(1.2±2.6)d。說明CA在藥物緩釋時間和抗菌能力上更具優勢。該載藥系統在未來臨床上有希望成為重要的輔助治療手段。

2.2 CBM的支架作用

牙周炎發生后導致的牙槽骨吸收是臨床中最常見的并發癥。因此，牙周炎的治療不僅要對牙周的感染進行控制，臨床工作者更希望控制感染的同時，能對喪失的牙槽骨進行牙周組織的引導再生。關于牙周組織再生的文獻主要圍繞干細胞與其他支架展開相關研究，但CBM與牙周組織再生相關的研究報道較少。目前牙周再生目標是引導具有再生能力的細胞重新修復缺損區并建立新的牙周附著[27]。Inan?等[28]將人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)加載到殼聚糖-羥基磷灰石微球上后，發現其表現出一定的成骨分化潛能，并觀察到hPDLFs在體外誘導后能夠在二維和三維培養條件下進行成骨分化，因此認為在微重力生物反應器中的殼聚糖-羥基磷灰石微球可作為合適的三維環境來支持體外hPDLFs的成骨分化，該實驗驗證了CBM能夠作為支架，具有引導牙周組織再生的潛能。但目前的研究仍處于基礎階段，要實現牙周膜成纖維細胞的組織再生或建立牙周重新附著的目標還有很長的路要走。

3 CBM在牙體牙髓病損的治療中的作用研究

3.1 CBM搭載氟輕松和生長因子

牙齒發育有不同的階段，年輕恒牙期的牙根還未發育完全，但可能會因為外傷、齲病等原因，導致牙髓炎癥，甚至是根尖周炎。為了促使根尖繼續發育，解決牙根抗力差的問題，以氫氧化鈣為基礎的根尖誘導成形術是目前臨床廣泛使用的治療方法之一。但其治療周期長，需要多次換藥，從而有增加感染的風險[29]。研究已證明BMP-2能夠誘導牙乳頭細胞向成牙本質細胞分化，形成牙本質[30]。現有學者將CBM作為生長因子載體應用于牙本質誘導的研究。持續炎癥存在會影響骨形成，Niu等[31]基于此開發了一種共聚乳酸-CBM，它是由共聚乳酸-殼聚糖的納米球先包裹疏水性藥物氟輕松，再混合親水性生物分子BMP-2，由三聚磷酸鹽交聯成微球，并可同時抑制炎癥和促進牙體組織礦化相關因子的表達。該微球載藥平臺有望能控制年輕恒牙的感染和促進組織發育，為根尖發育不足的誘導治療提供了新思路，也是一種同時搭載疏水藥物與親水藥物的優良載體。

3.2 CBM搭載轉化生長因子

牙體組織缺損是臨床常見的疾病之一，醫生常使用的是氫氧化鈣和生物陶瓷作為蓋髓材料，保留牙髓組織，促進修復性牙本質形成。已有研究證明轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以作為蓋髓劑誘導修復性牙本質形成[32]。Li等[33]采用乳液交聯法制備含TGF-β1的CBM，且微球被雙層殼聚糖膜所包被，它由一側的致密膜和另一側的大孔海綿組成。其原理是使用致密的薄膜來阻止細菌入侵穿孔的牙髓，并使用含有TGF-β1的微球加載到多孔海綿進行緩釋。該動物實驗中觀察到含有TGF-β1的微球產生的修復牙本質厚度比不含TGF的商用Dycal或殼聚糖雙層膜厚3～6倍，具有更顯著的修復牙本質療效。因此，利用CBM包含TGF-β1的新型牙科材料有可能是實現牙髓組織再生的新選擇。

4 CBM在神經組織損傷修復中的作用研究

4.1 CBM搭載神經生長因子(nerve growth factor，NGF)

腮腺與面神經的解剖位置關系緊密，口腔頜面外科手術中，常因腮腺腫瘤的切除造成面神經功能障礙進而影響生活質量。目前，自體神經移植是治療周圍神經損傷的金標準，但仍有很多的局限性。所以人工神經移植物仍在研究中，而殼聚糖是人工移植物材料之一[34]。人工神經移植物也需要生長因子的幫助。NGF具有促進周圍神經修復、保護神經元、促進神經再生、引導軸突生長和營養作用[35]。Zeng等[36-37]采用乳液離子交聯法制備了載NGF的CBM，發現其具有7 d持續釋放NGF的能力。然后，將該CS微球加入具有縱向微通道的膠原-殼聚糖支架，其持續釋放生物活性NGF的時間提升至28 d。Zeng等[38]又進一步改良，制備了負載NGF的殼聚糖/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)復合微球，再一次延長緩釋時間，并在動物實驗中證實了殼聚糖/PLGA-NGF微球能促進大鼠坐骨神經再生并阻止了腓腸肌萎縮。在神經修復再生的研究領域中，CBM在控釋生長因子方面有一定的優勢，利用殼聚糖的載體作用，有可能推動該研究領域的進一步發展。生物3D打印機可以模擬人體組織微觀結構，通過3D打印技術制作的多孔纖維結構較傳統膠原類材料更利于細胞生長爬行，利于軟組織修復[39]。結合3D打印技術，載藥CBM結合生物支架將可能在神經修復再生領域有更優異的表現。

4.2 CBM負載促神經修復作用的中藥提取成分

口腔診療過程中，周圍神經的損傷發生率較高。神經損傷后的治療以營養神經和促進神經修復的全身藥物為主，但臨床療效不佳。川芎嗪在修復大鼠坐骨神經缺損方面有顯著作用[40]，并在神經性疼痛方面有療效[41]。趙紅斌等[42]通過乳液交聯法制備CBM加載川芎嗪，并與膠原蛋白混合制成神經導管，發現微球釋放的川芎嗪可以促進間充質干細胞增殖和神經元特異性烯醇化酶表達，為進一步的動物神經誘導實驗提供基礎，但對于臨床的適用性仍需要更多的研究和改良。

5 總結與展望

綜上所述，CBM擁有可靠的負載生長因子、抗菌藥等藥物的能力，并且有可調控的緩釋能力[43]。CBM還可以保護藥物，減少環境改變對藥物的影響，克服局部用藥的局限性，也可避免部分藥物并發癥。殼聚糖可以混合不同的材料，例如明膠、海藻酸鈉、PLGA等，并運用不同的技術制備出形態各異、功能不同的CBM。也因此，CBM的包封率相差較大，緩釋效果也有差別。在CBM的制作工藝上，大部分方法都使用了有毒的有機溶劑，以及納米級微球對人體可能存在潛在的毒害作用，且制備納米級微球往往需要用到復雜的設備，這都不利于大規模的生產和臨床應用。在口腔領域的基礎研究已有一定的成果，在臨床試驗前，試劑還需要進一步研究，使其安全且便捷。CBM緩釋系統中的藥物定量研究較少，精準控釋藥物會是未來的研究方向。相信在不久的將來，通過技術改良，試劑研發以及技術之間的交叉應用，各種困難將會被逐一克服。