硫酸軟骨素應用于骨修復材料中的研究進展

張 茜，王 暢，梁 琛，曲星源，劉 悅，閆寶君，王 雷

組織工程學和生物材料學被認為是發展再生移植修復骨缺損的重要方式。組織工程學意在將生物材料、細胞以及生物活性分子結合起來，恢復或改善受損或病變組織的生物功能[1]。在組織工程學中，為了提高細胞活力、附著、增殖和歸巢、成骨分化、血管化、宿主整合和承重[2]，人們研究了大量的支架材料，發現了硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)在骨再生修復中具有潛在的功效。CS是一類硫酸化的陰離子酸性黏多糖，具有多種生物學特性，本文擬就CS的生物學特性、在成骨修復中的作用及在骨組織工程中的應用作一綜述。

1 硫酸軟骨素的生物學特性

CS由D-葡糖醛酸(glucuronic acid，Glc A)和N-乙酰-D-氨基半乳糖(N-acetyl-D-galactosamine hydrate，Gal NAc)通過β-1，3糖苷鍵重復連接而成，一般含有50～70個二糖單位[3]，廣泛分布于組織細胞外基質和細胞表面，在生物體內多以蛋白多糖的形式存在，是構成動物軟骨、腱、氣管、喉骨、皮膚等結締組織的重要組成部分[4]。根據硫酸鹽基團在N-乙酸基-D-氨基半乳糖中位置不同， 可分為硫酸軟骨素O、A、C、D、E等，即CS-O、CS-A、CS-C、CS-D、CS-E等[5]。除了硫酸鹽基團位置的可變性外，不同的硫酸鹽基團也具有明顯不同的生物活性，例如巖藻糖基硫酸軟骨素的硫酸化巖藻糖殘基有抗炎、刺激造血等多種活性[6]。CS具有重要的生物學特性，研究表明，CS具有促進軟骨再生、抗炎[7]、抗氧化[8]等功效。CS發揮作用主要依靠兩種方式：一是自身帶電荷的離子基團與其他物質發生作用；二是調節信號通路中的生物分子進而引發機體反應。

1.1 電荷相互作用

由于CS是一類硫酸化的陰離子酸性黏多糖，帶負電荷的它具有吸引離子的潛力，其磺酸基和羧酸鹽基可與帶正電荷的基團，如鈣離子，通過離子鍵發生強烈反應，形成共價鍵，從而能夠在礦化中心分離鈣離子，并控制骨組織鈣化時的晶體生長[9]。此外，研究表明，CS還可通過離子相互作用與蛋白質共價結合，例如與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的各種生長因子和成分結合，而其中一些蛋白質可能具有致敏和(或)不耐受能力，能夠引發機體免疫反應，并賦予CS抗氧化特性，減少骨破壞、軟骨細胞死亡和基質成分的分解[10-12]。

1.2 調節信號分子

研究發現，CS可以作為可溶性配體的共同受體，參與Wnt信號通路(Wnts)，與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，FGFs)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和其他細胞因子相互作用，調節細胞形態發生，參與成骨[5，13]。Korotkyi等[14]將CS應用于骨關節炎(osteoarthritis，OA)，發現CS抑制軟骨細胞和滑膜細胞中核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)亞基1的激活和核轉位。 NF-κB是一種關鍵的調節因子，調控許多參與組織炎癥和細胞募集的病理生理學的基因表達[15]。由此推斷，CS可調節炎癥通路，降低炎癥因子水平，減少軟骨細胞損傷，從而調節軟骨下骨的改建。

2 硫酸軟骨素的促進成骨修復作用

骨的生成是一系列復雜的生物化學發展過程，可分為骨細胞的增殖、細胞外基質的聚集和骨組織的礦化三個時期[16]。在此過程中，ECM分子在組織生長和細胞分化過程中起著關鍵作用， 而CS是ECM分子的重要組成部分。研究發現，CS可以通過包括調節成骨分化、免疫調節、促進細胞增殖和生物礦化在內的多種途徑促進骨的修復和新骨形成[17-18]。

2.1 調節成骨分化

在成骨分化過程中，細胞因子的表達起關鍵作用。研究發現，CS與BMP-2協同促進干細胞成骨分化，促進堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)和Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，COLⅠ)的表達[17]。ALP是成骨細胞基質成熟的生物標志物，OCN是一類維生素K依賴的鈣結合蛋白，這兩者是參與成骨分化和ECM礦化過程的重要成分[19]。此外，CS還可以通過Smad1-Smad5-Smad8途徑發出信號，以增加與Runt相關的轉錄因子2(runt-related transcription factors 2，Runx2)的表達[20]。Runx2是成骨細胞分化過程中的重要轉錄因子，在間充質和其他干細胞成骨分化開始時具有重要意義，它作用于下游信號，促進重要成骨細胞蛋白的表達[21]。此外，Elango等[22]基于成骨細胞對破骨發生的旁分泌研究發現，CS可下調破骨細胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand， RANKL)的表達，減少破骨的發生，促進新骨生成。由上可知，CS通過促進成骨標志物和/或降低破骨因子的表達來調節成骨。

2.2 免疫調節

免疫調節在成骨過程中發揮重要作用，研究證實CS具有顯著的免疫調節功能，可以通過重塑局部免疫微環境、抑制纖維增生調節干細胞向成骨分化，上調成骨標志物表達，促進骨再生[17]。局部免疫微環境的改變離不開免疫細胞和調節因子的作用，而不同的淋巴細胞亞群及相關細胞因子在成骨過程中發揮了特定的作用。免疫細胞在骨損傷后立即進入骨破壞部位，并通過向損傷部位招募輔助細胞來促進愈合的初始階段。有證據表明，活化的T淋巴細胞可以通過可溶性因子(如RANKL)的產生促進成骨細胞的成熟，有利于骨的修復[23]。事實上，在骨損傷后，炎癥反應隨即發生。研究發現，炎癥細胞因子的積累可介導氧化應激損傷，促進破骨細胞增殖，增加骨吸收，從而導致骨質疏松癥[24]。 由此可見，如果可以減輕炎癥的發生發展，就可以減少骨組織的破壞，進而促進骨再生。Li等[2]發現，CS能調節巨噬細胞從M1向M2的表型轉換，促進白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10和TGF-β等修復細胞因子的表達，將局部免疫微環境狀態從致炎轉變為抗炎，促進干細胞募集、黏附和增殖，上調成骨標志物的表達，實現骨修復。此外，CS有效減少金屬蛋白酶-9 (metalloproteinase-9，MMP-9)、IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)等致炎因子水平的增加，減少炎癥的積累，為骨穩態的平衡提供了幫助[25]。顯然，這些炎癥分子的表達和(或)活性的降低可能解釋了CS發揮其免疫調節作用的機制。然而，免疫調節成骨是一個非常復雜的過程，需要局部免疫反應激活細胞成骨標志物表達，在信號的刺激下新骨形成[26]，而CS在此過程中的具體作用仍需進一步研究。

2.3 調節生物礦化

在骨再生過程中，生物礦化是硬化組織的一個重要過程。最常見的生物礦化物是鈣和磷酸鹽，它們與有機聚合物結合形成磷灰石晶體，為骨骼提供結構支持。CS作為非膠原蛋白聚糖之一，在調節軟骨和骨組織的生物礦化中起著至關重要的作用。Kim等[18]在研究中發現，利用CS作為成核位點，初始時可以有效吸收鈣離子，并吸引一些負離子，如磷酸鹽，進行鈣磷沉積，加速生物礦化過程。可見，CS具有積聚離子的潛力，可誘導細胞的生物礦化促進成骨。

2.4 促進細胞增殖

骨修復離不開骨細胞增殖。有學者發現，CS通過激活TGF-β/Smads通路，誘導細胞內鈣離子水平升高，影響細胞周期，對軟骨細胞產生增殖作用[27]；CS可影響生長因子和其他細胞因子的固定，并通過整合素或其他特定受體與骨細胞(如成骨細胞和破骨細胞)相互作用，直接或間接影響這些細胞的黏附、遷移、生長、增殖和分化[28]。

2.5 其他

除了上述作用，CS還具有選擇性蛋白結合抗性，可以降低血小板黏附，促進內皮細胞和間充質細胞的黏附[12]，進而促進細胞的分化，有利于骨的改建。

3 硫酸軟骨素在骨組織工程中的應用

CS作為一種資源豐富性能優異的生物分子， 因其顯著的骨修復作用而被廣泛用于骨組織工程醫學領域，尤其是在顱面和口腔醫學。骨組織工程是利用支架材料誘導周圍組織成骨， 或將支架材料作為植入骨細胞或其他藥物的載體或模板[29]。研究表明，CS被廣泛應用于細胞支架、表面涂層、生物黏合劑及藥物遞送系統等，形式多種多樣。Singh等[9]制備了CS與殼聚糖、納米生物玻璃結合的復合支架，發現CS促進COLⅠ的表達和生物礦化，增強ALP活性，證實了該復合支架促組織再生的潛力。Andrews等[13]制備了CS糖胺聚糖支架水凝膠，并研究其對重組人骨形態發生蛋白傳遞的適用性，證實了它可調節骨TGF-β1和BMPs信號，并介導臨界大小的骨缺損的再生，增強成骨細胞礦化。Ye等[19]制備神經生長因子——硫酸軟骨素/羥基磷灰石(neurogrowth factor-chondroitin sulfate/hydroxyapatite，NGF-CS/HA)復合鈦涂層，證明此涂層能夠顯著提高ALP活性，上調OCN和Runx2，對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞的分化有顯著的促進作用。Kong等[21]將CS和COLⅠ組裝到聚乳酸-羥基乙酸共聚物表面的仿生涂層，結果顯示其也能夠支持BMSCs的附著、增殖和成骨分化。除此而外，有學者將CS引入磷酸鈣水泥(calcium phosphate cement，CPC)中，發現CS-CPCs加速了纖維連接蛋白的優先吸附，上調了BMSCs中骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和ALP的表達，改善了BMSCs的黏附、增殖和成骨分化[28]。還有學者將硫酸軟骨素用于軟骨再生的ECM生物墨水，為BMSCs的軟骨分化提供了理想的化學和機械微環境[30]。越來越多的研究表明，CS可與高分子化合物和生物活性分子物質用于仿生材料復合物制備，證實CS在成骨修復中的作用。

4 展 望

在組織工程醫學中，CS仿生材料引起顯著的關注，其與基因治療相結合成為研究熱點。然而，由于CS種類繁多，應用形式多樣，材料各組分比例也會影響成效，CS促進成骨的具體機制仍需進一步研究。此外有學者發現，天然CS具有復雜的結構和不均勻的組成，導致其生理功能和應用受到明顯的限制[31]。近年來，天然CS在分子水平上已經為調控細胞行為提供了一種有效的策略，但如何合理設計和合成具有特殊成分和結構的CS仿生材料協同調控細胞成骨和成軟骨分化仍然是一個巨大的挑戰。因此，在未來的研究中，希望不僅關注CS仿生應用，還有CS在骨修復中的調控機制。同樣要指出的是，高性能CS的質量是制劑安全和有效的先決條件[32]。總之，已有研究證明了CS在骨再生修復方面的潛力和在組織工程學中廣闊應用的前景，在未來的應用中，CS應該是一種值得青睞的選擇。