雷帕霉素灌胃對糖尿病大鼠視網膜的保護作用及機制

哈利，王琴，楊燁

1 深圳市龍華區中心醫院急診內科，廣東深圳 518110；

2 新疆醫科大學第二附屬醫院老年病科干部病房

糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的并發癥之一，主要表現為微血管病變，是糖尿病患者致盲的潛在危險因素之一。研究顯示，罹患2 型糖尿病8 年后，50%的患者會發生DR，20 年后則有超過77%的患者發生DR［1］。目前DR 的治療方法多為控制血糖、降低血脂、激光治療等，雖然對視力損害起到一定治療作用，但仍缺少根治DR 的特效藥物。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是調控細胞自噬的重要信號通路，在細胞生長、增殖、分化和凋亡過程中具有非常重要的作用［2］。研究顯示，PI3K/AKT/mTOR 信號通路在糖尿病及其并發癥中起關鍵作用［3］。雷帕霉素是mTOR 特異性抑制劑，對癌癥、代謝性疾病均具有一定的藥理作用［4］。本研究通過建立2 型糖尿病大鼠模型，使用雷帕霉素進行干預治療，以PI3K/AKT/mTOR 信號通路為靶點，觀察雷帕霉素對糖尿病大鼠視網膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SPF 級SD 大鼠50 只，體質量180～220 g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供。動物使用許可證SCXK（新）2016-0002。飼養于SPF 級實驗室，室溫21～23 ℃，濕度50%～60%，12 h/12 h 光暗周期循環。本實驗嚴格遵守動物福利與倫理要求，并通過新疆醫科大學動物實驗中心倫理委員會批準（批號20190531-08）。

1.1.2 主要試劑與儀器 雷帕霉素、鏈脲佐菌素（STZ）由北京索萊寶科技有限公司提供；二甲雙胍為中美上海施貴寶制藥有限公司產品；兔抗PI3K/AKT/mTOR 一抗為Abcam 公司產品；山羊抗兔HRP標記二抗、GAPDH 內參蛋白為Bioswamp 公司產品。低速冷凍離心機（KDC-2046）、高速冷凍離心機（HC-3018R）、酶標儀（Varioskan Flash）、血糖儀及配套試紙（拜安捷2）。

1.2 動物分組與糖尿病模型制備 將大鼠隨機分為正常對照組10 只和模型組40 只。正常對照組給予普通飼料喂養。糖尿病組給予高脂高糖飼料喂養4 周后，腹腔一次性注射35 mg/kg STZ，注射后第3 天采集空腹尾靜脈血，以隨機血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L、食量及飲水量增加、尿量增多為造模成功。

1.3 藥物干預方法 取造模成功的30 只大鼠，隨機分為模型對照組、陽性對照組、雷帕霉素組各10 只。陽性對照組給予二甲雙胍20 mg/（kg·d）灌胃，雷帕霉素組給予雷帕霉素1 mg/（kg·d）灌胃，模型對照組與正常對照組給予同等體積純凈水灌胃，連續4周。

1.4 空腹血糖檢測 大鼠麻醉，采集空腹尾靜脈血，使用血糖儀檢測血糖水平。

1.5 視網膜病理檢查 采用HE 染色法。大鼠處死，取左側視網膜組織，4%多聚甲醛固定24 h，75%乙醇脫水，石蠟包埋，HE 染色，400 倍顯微鏡下觀察病理改變。每張切片隨機選取20個固定面積（不重疊視野），分別計數視網膜神經節細胞個數，取平均值，用來評價視網膜病變程度。

1.6 視網膜組織中PI3K/AKT/mTOR 表達檢測 采用Western blotting 法。取大鼠右側視網膜組織，加入裂解液制備組織勻漿，采用考馬斯亮藍法測定蛋白上清中總蛋白含量。加入1×PBS 和4×Loading Buffer 稀釋蛋白，100 ℃水浴20 min 使蛋白變性。使用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，然后將蛋白轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入兔抗鼠一抗（PI3K、AKT、mTOR、內參GAPDH 稀釋比例分別為1∶3 000、1∶200、1∶1 000、1∶3 000），4 ℃搖床孵育。TBST 洗膜，加入山羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶3 000）孵育2 h。TBST 洗膜，ECL 化學發光液顯色，Image Lab曝光條帶，Image J軟件分析目標條帶的灰度值。以GAPDH 作為內參，計算目標蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。采用Shapiro-Wilk法進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組用藥前后空腹血糖水平比較 各組用藥前空腹血糖水平比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。用藥后與正常對照組比較，模型對照組、陽性對照組及雷帕霉素組空腹血糖均升高（P均＜0.05）；與模型對照組比較，陽性對照組和雷帕霉素組空腹血糖均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組用藥前后空腹血糖比較（mmol/L， ± s）

表1 各組用藥前后空腹血糖比較（mmol/L， ± s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05。

組別正常對照組模型對照組陽性對照組雷帕霉素組n 10 10 10 10空腹血糖用藥前5.06 ± 0.87 5.19 ± 0.98 5.24 ± 1.12 5.30 ± 1.05用藥后5.54 ± 1.25 21.08 ± 5.46*18.27 ± 4.60*#16.15 ± 5.05*#

2.2 各組視網膜組織病理形態比較 正常對照組視網膜形態無明顯病理改變；模型對照組視網膜形態改變，細胞水腫嚴重，神經節細胞核染色質深染加重，可見大量空泡變性的細胞，外層和內層結構紊亂，界限模糊不清，視網膜全層明顯變薄；陽性對照組視網膜細胞水腫，核質染色深染，各層結構紊亂，視網膜全層變薄；雷帕霉素組視網膜細胞輕度水腫，厚度稍變薄，神經節細胞層內外層排列稍紊亂，細胞間隙增大，有少量核固縮，染色加深，大量節細胞空泡變性，細胞數量稍微減少。

2.3 各組視網膜神經節細胞計數比較 正常對照組、模型對照組、陽性對照組、雷帕霉素組視網膜神經 節 細 胞 數 分 別 為（24.56 ± 1.66）、（17.40 ± 1.06）、（19.07 ± 1.03）、（20.13 ± 0.96）個。與正常對照組相比，模型對照組、陽性對照組及雷帕霉素組視網膜神經節細胞計數均降低（P均＜0.05），與模型對照組相比，陽性對照組及雷帕霉素組視網膜神經節細胞計數均升高（P均＜0.05），雷帕霉素組高于陽性對照組（P＜0.05）。

2.4 各組視網膜PI3K、AKT、mTOR 表達水平比較 與正常對照組相比，模型對照組、陽性對照組及雷帕霉素組PI3K、AKT表達水平降低，mTOR表達水平升高；與模型對照組相比，陽性對照組與雷帕霉素組PI3K、AKT 表達水平升高，mTOR 表達水平降低；與陽性對照組相比，雷帕霉素組AKT 表達水平升高、mTOR表達水平降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組視網膜PI3K、AKT、mTOR蛋白表達比較（± s）

表2 各組視網膜PI3K、AKT、mTOR蛋白表達比較（± s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05。

組別正常對照組模型對照組陽性對照組雷帕霉素組n 10 10 10 10 PI3K 0.751 ± 0.105 0.454 ± 0.086*0.544 ± 0.082*#0.587 ± 0.099*#AKT 0.843 ± 0.134 0.223 ± 0.067*0.425 ± 0.060*#0.632 ± 0.082*#△mTOR 0.371 ± 0.058 0.724 ± 0.037*0.635 ± 0.059*#0.582 ± 0.064*#△

3 討論

DR是糖尿病主要的眼部并發癥，按照病變嚴重程度可分為早期非增殖性DR 和中晚期增殖性DR。目前全世界已有9 300萬DR患者，其中1 700萬為增殖性DR［5］。DR 的發病機制目前尚不明確，AGEs 聚集、蛋白激酶C信號通路阻礙、多元醇通路代謝異常等對DR 的發生發展均有促進作用［6］。目前治療DR的方法主要針對晚期階段的增殖性DR，且效果有限。雷帕霉素是一種具有廣泛抑制增殖作用的大環內酯類抗生素，可特異性抑制mTOR，用于癌癥、代謝性疾病的治療已取得一定效果。抑制mTOR 活性是雷帕霉素改善2型糖尿病胰島素抵抗并降低血糖的機制之一。動物實驗顯示，雷帕霉素可降低糖尿病小鼠的血糖水平，提高小鼠對胰島素的敏感性［7］。mTOR/S6K1 可被胰島素信號激活，通過增加IRS-1絲氨酸殘基磷酸化，促使IRS-1 與胰島素受體解離，引起胰島素抵抗［8］。本研究結果顯示，給予雷帕霉素治療4周后，糖尿病大鼠血糖明顯降低，表明雷帕霉素能夠對糖尿病大鼠的血糖起到一定的控制作用。

DR 是糖尿病慢性并發癥之一，以視網膜屏障通透性增加、血管內皮細胞和周細胞減少、血管基底膜增厚、毛細血管閉塞、視網膜神經元和膠質異常為主要病理改變。在高血糖狀態下，視網膜神經細胞極易受到損傷，導致視網膜神經保護作用受損。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組視網膜病理改變嚴重，神經節細胞數量下降明顯，而與模型對照組相比，陽性對照組及雷帕霉素組視網膜雖同樣出現病理改變，神經節細胞數量下降明顯，但較模型組更輕，與陽性對照組相比，雷帕霉素組視網膜病理改變則更輕。王菲菲［9］對高眼壓模型SD 大鼠使用雷帕霉素滴眼液后，發現雷帕霉素降低了大鼠的眼壓，同時減弱了大鼠視網膜組織及視網膜神經節細胞損傷，結合本次研究結果可見，雷帕霉素大鼠的視網膜組織及視網膜神經節細胞確有一定的保護作用，同時能夠對DR 大鼠起到一定的治療作用。

PI3K/AKT 是重要的細胞內傳導通路，具有控制細胞生長、增殖與凋亡的作用。PI3K/AKT 廣泛存在于細胞中，在糖尿病的發生發展過程中發揮重要作用［10］。研究顯示，糖尿病時的低氧和低血糖可以誘導血管內皮生長因子過度表達，通過fms 樣酪氨酸激酶受體和胎肝激酶受體這兩個酪氨酸激酶家族的特異性受體，激活PI3K 信號通路，引起過度的血管生成，從而導致DR 和糖尿病腎病［1］。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型對照組視網膜組織中PI3K、AKT 表達水平均下降；與模型對照組相比，陽性對照組和雷帕霉素組PI3K、AKT 表達水平均升高，其中雷帕霉素組AKT 表達水平高于陽性對照組，表明糖尿病與PI3K/AKT 信號通路受到抑制存在一定的關聯，而雷帕霉素可能通過上調AKT 表達水平改善糖尿病大鼠血糖水平及視網膜受損程度。

mTOR 是PI3K/AKT 信號通路下游重要的絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶，AKT可以直接磷酸化mTOR，激活mTOR 及下游信號通路，發揮生物學功能，其主要功能為促進物質代謝、參與細胞凋亡、自噬的功能等，在2 型糖尿病、肥胖、癌癥等疾病的發生發展過程中發揮重要作用［11-12］。研究顯示，mTOR在胰島素代謝過程中具有重要作用，mTOR 可以反饋性調節胰島素敏感性，保護胰島β 細胞［13］。呂相川等［14］報道，mTOR在2型糖尿病大鼠肝臟和肌肉的表達水平較正常大鼠明顯升高，認為其可能參與了2 型糖尿病的發病。INOKI 等［15］發現，糖尿病腎病小鼠足細胞中mTORC1 的激活是誘導糖尿病腎病的關鍵。INOKI 的另一項研究則提出，TSC/mTOR 信號在調節細胞生長和生存控制中起關鍵作用，TSC/mTOR通路失調可能導致代謝紊亂，如糖尿病及其并發癥［16］。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型對照組視網膜組織中mTOR 表達水平明顯升高；與模型對照組相比，陽性對照組及雷帕霉素組mTOR 表達水平明顯下降；與陽性對照組相比，雷帕霉素組mTOR 表達水平明顯降低。雷帕霉素能夠結合哺乳動物mTOR，并通過抑制mTOR 的活化而進行細胞生長和代謝的調節。陳玨等［17］觀察雷帕霉素對糖尿病腎病大鼠足細胞的作用，發現雷帕霉素可減輕糖尿病腎病大鼠的蛋白尿癥狀。肖堂利等［18］研究雷帕霉素對糖尿病腎病小鼠腎小球足細胞自噬和損傷的影響，以及對糖尿病腎病的改善作用，發現雷帕霉素可以減輕腎小球病理改變和足細胞損傷。結合本研究結果，雷帕霉素抑制mTOR 表達后，PI3K 和AKT表達也出現了一定的變化，推測抑制mTOR 可能成為DR 的潛在治療方式。通過觀察視網膜神經節細胞計數和視網膜病理變化，雷帕霉素組視網膜損傷較其他兩組明顯減輕，更加證實了這一推測，提示雷帕霉素能夠對2型糖尿病大鼠的視網膜組織起到一定的保護作用。

綜上所述，糖尿病大鼠給予雷帕霉素后，空腹血糖得到了一定的控制，視網膜神經節細胞及病理改變程度均得到不同程度的改善，其機制可能與雷帕霉素對PI3K/AKT/mTOR 信號通路的抑制有關。mTOR可能成為未來DR治療的一個新的靶點。