二氫丹參酮Ⅰ灌胃對急性缺血性腦卒中大鼠神經功能改善作用及其機制

劉陳，吳文潔，李淑婷，蔡冰潔，楊家霖，張琪曼，沈建英，李韶菁

1 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；2 安徽中醫藥大學藥學院

缺血性腦卒中是世界第二大易致傷殘疾病，其致病因素復雜，發病率高，嚴重影響患者生存質量［1-2］。開發治療缺血性腦卒中的新藥迫在眉睫。中藥因其整體調控特點在缺血性腦卒中的治療中具有獨特優勢，二氫丹參酮Ⅰ（DT）是來源于傳統中藥丹參根中的一種親脂性二萜類化合物，具有抗腫瘤、心腦血管保護、抗炎、抗過敏、保肝等作用［3］。DT 納米顆粒還可以顯著改善大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制與保護神經細胞免受氧化應激和炎癥的影響有關［4］。無論抗氧化或抗炎作用研究，均從神經保護角度對DT 的抗缺血性腦卒中作用機制進行研究，而血管保護仍是目前中風治療最主要的手段，缺血性腦卒中患者的預后與缺血后血管新生、血管網絡重建息息相關。2022 年3 月—9 月，我們通過觀察DT 對MCAO 大鼠神經功能、腦梗死體積及缺血側腦血流灌注量、腦組織病理狀態的影響，從血管保護角度探討DT 改善缺血性腦卒中的作用機制，為進一步明確DT 抗缺血性中風作用機制提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠50只，體質量240～260 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2021-0006。本實驗經中國中醫科學院中藥研究所動物福利倫理委員會審核批準。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 DT（Med Chem Express）。胎牛血清（PAN）；DMEM 培養基（Gibco），SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（碧云天），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶），水合氯醛（國藥），CD31 單克隆抗體（Invitrogen），血管內皮生成因子（VEGF）單克隆抗體（Invitrogen），缺氧誘導因子1α（HIF-1α）多克隆抗體（Abcam），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（碧云天），TTC（索萊寶）。臺式高速冷凍離心機（H-1850R），酶標儀（SUNRISE），激光散斑血流儀（Perimed），熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 動物分組與模型制備 將50 只大鼠隨機分為假手術組、模型對照組及DT 高、中、低劑量組各10只。模型對照組和DT 高、中、低劑量組采用線栓法［5］制備MCAO 模型，剪開大鼠頸部皮膚，分離肌肉暴露頸總動脈和分叉，結扎頸總動脈下端，用動脈夾夾閉頸總動脈上部，用眼科剪將頸總動脈剪開一小口，插入線栓，打開動脈夾，將線栓插入頸內動脈至離分叉1.8 cm 的距離，固定線栓，縫合傷口。假手術組不插栓，僅暴露頸總動脈及埋線處理。

1.3 藥物干預方法 將DT 溶解于含2% DMSO 的生理鹽水中。造模后24 h，DT 高、中、低劑量組分別給予15、5、1.67 mg/kg DT 灌胃，假手術組和模型對照組給予含2% DMSO 的生理鹽水灌胃，每天1 次，連續7 d。

1.4 神經功能評估 于造模前和給藥7 d 后，采用Zea-Longa 五分制評分法［5］對所有大鼠進行神經行為學評分。0分：正常，無神經功能損傷。1分：左側前爪不能完全伸展，輕度神經功能損傷。2 分：行走時，大鼠向左側轉圈，中度神經功能損傷。3 分：行走時，大鼠身體向左側傾倒，重度神經功能損傷。4 分：不能自主行走，有意識喪失。

1.5 大鼠腦梗死面積測算 采用TTC 染色法。每組選取3 只大鼠，麻醉后取腦，去除小腦及嗅球，液氮速凍后切2 mm 厚切片。加入2% TTC 溶液，37 ℃孵育15 min。由于活細胞線粒體內的脫氫酶可以將TTC還原為紅色甲臢化合物，故白色即為梗死部分。使用PS軟件計算腦梗死體積，并將模型對照組腦梗死體積標準化為100%，假手術組標準化為0。梗死體積=梗死面積×2 mm。

1.6 大鼠缺血側局部腦血流灌注量檢測 每組選取3 只大鼠，于麻醉后進行MCAO 手術前15 min，將大鼠兩耳連線中點至顱定皮膚剪開，棉簽蘸取生理鹽水搓掉顱骨上筋膜，直至露出顱骨。在兩頂骨靠近矢狀縫位置取2 mm×2 mm 區域用磨杵磨薄。將大鼠轉移至激光下，調整顱骨位置距掃描頭13 cm左右，記錄數據，待血流基本穩定后可停止記錄，取血流穩定的一段監測值作為平均血流灌注量（TOI），對大鼠進行造模。造模完成后，監測記錄造模后局部腦血流灌注量，縫合頭皮傷口。給藥7 d后，打開傷口，監測腦缺血側局部腦血流灌注量，根據公式計算局部腦血流灌注量變化率。局部腦血流灌注量變化率=［（給藥后TOI-造模后）/（造模前TOI-造模后TOI）］×100%。

1.7 大鼠缺血側海馬區病理形態觀察 采用HE染色法。每組選取3只大鼠，心臟灌注后取腦組織，放入4%多聚甲醛中固定24 h。將組織包埋于石蠟中，切0.5 μm 厚切片，脫蠟水化處理。按照說明書進行HE染色，光鏡下觀察。

1.8 腦組織HIF-1α、VEGF、CD31 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。每組選取4 只大鼠，取缺血側腦組織，提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。制備SDS 凝膠板，每孔上樣50 μg 蛋白，以電壓80 V電泳30 min后轉120 V電泳1 h；以電流200 mA將凝膠上的蛋白轉至PVDF 膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h。TBST 清洗，加入HIF-1α、VEGF、CD31 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃過夜孵育。TBST清洗，加入二抗（稀釋比例為1∶1 000）常溫孵育1.5 h，TBST 清洗。滴加ECL 發光顯影液顯影拍照，用Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。采用Shapiro-Wilks 法對數據進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經行為學評分比較 給藥前，模型組及DT 各劑量組神經行為學評分均較假手術組升高（P均＜0.01）；給藥7 d后，與模型組比較，DT高、中劑量組神經行為學評分均降低（P＜0.01），低劑量組無明顯變化，其中高劑量組神經行為學評分低于低劑量組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組神經行為學評分比較（分 ± s）

表1 各組神經行為學評分比較（分 ± s）

注：與假手術組比較，#P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.01。

組別假手術組模型對照組DT高劑量組DT中劑量組DT低劑量組n 10 10 10 10 10神經行為學評分給藥前0.00 ± 0.00 2.60 ± 0.52#2.70 ± 0.48#2.70 ± 0.48#2.70 ± 0.48#給藥7 d后0.00 ± 0.00 2.67 ± 0.52#1.33 ± 0.52*△1.83 ± 0.41*2.33 ± 0.52

2.2 各組缺血側腦梗死體積比較 假手術組、模型對照組以及DT 高、中、低劑量組缺血側腦梗死體積分別為0% ± 0%、100% ± 5%、41% ± 13%、67% ± 6%、84% ± 5%。與假手術組比較，模型組梗死體積增加；與模型組比較，DT 中、高劑量組梗死體積減小，低劑量組無明顯變化，高劑量組缺血側梗死體積小于低劑量組（P均＜0.01）。

2.3 各組腦缺血側局部腦血流灌注量變化率比較 假手術組、模型對照組以及DT高、中、低劑量組缺血側局部腦血流灌注量變化率分別為0% ± 0%、15.30% ± 4.34%、47.22% ± 21.32%、40.42% ± 8.21%、24.05% ± 5.40%。與假手術組比較，模型組腦血流灌注量變化率降低（P＜0.01）；與模型組比較，DT 中、高劑量組腦血流灌注量變化率均增加（P＜0.05 或P＜0.01），低劑量組無明顯變化；高劑量組腦血流灌注量變化率高于低劑量組（P＜0.05）。

2.4 各組腦缺血側海馬區細胞形態比較 假手術組海馬區細胞排列整齊，細胞核位于中央，細胞膜完整；模型對照組細胞排列紊亂，細胞腫脹破裂，細胞核萎縮；DT 不同劑量組海馬區細胞形態均有不同程度的改善，其中DT 高劑量組改善最為明顯。見圖1。

圖1 各組腦缺血側海馬區細胞形態比較（HE染色，200×）

2.5 各組缺血側腦組織VEGF、CD31、HIF-1α 蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型對照組腦組織VEGF、HIF-1α 蛋白表達水平升高（P均＜0.01），CD31 表達水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，DT中、高劑量組VEGF、CD31、HIF-1α 表達水平均升高（P均＜0.01），其中DT高劑量組高于DT低劑量組（P均＜0.01）。見表2。

表2 各組缺血側腦組織VEGF、CD31、HIF-1α蛋白表達 水平比較（-x ± s）

3 討論

缺血性腦卒中會引起線粒體功能障礙、酸中毒、炎癥等一系列有害反應，常導致患者出現身體殘疾、認知障礙等神經功能缺陷。目前臨床治療仍以靜脈溶栓為主，但受其治療時間窗的限制，全球僅有5%的缺血性腦卒中患者能在4.5 h 內接受靜脈溶栓治療并得到有效救治［6］。缺血性腦卒中后恢復與大腦重建神經血管網絡結構和功能的能力息息相關，藥物治療可以增強重建過程并恢復受損的大腦功能［7］。目前常見藥物有鈣通道拮抗劑、自由基清除劑、谷氨酸拮抗劑和細胞膜穩定劑等，但大多數僅在動物實驗中效果較好，尚未有相關藥物在臨床治療中顯示出較好的療效［8］。DT 分離自丹參根，據文獻報道，DT 可以通過誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡、改善藥物耐藥性、抑制病理性血管生成等途徑發揮抗癌作用，通過降血脂、抗血小板聚集等途徑發揮心腦血管保護作用，其心腦血管保護作用可能比國內臨床常用的丹參酮ⅡA 效果更好［3］。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型對照組神經行為學評分升高；與模型對照組比較，DT中、高劑量組給藥7 d 后神經行為學評分顯著降低，表明DT 能夠改善大鼠神經功能。與假手術組比較，模型組缺血側腦組織梗死體積增加，局部腦血流灌注量變化率降低；與模型組比較，DT 中、高劑量組給藥7 d 后缺血側腦組織梗死體積縮小，局部腦血流灌注量變化率顯著增加，表明DT 可以改善缺血側腦血流，減小MCAO 大鼠腦梗死面積，從而改善大鼠神經功能。

缺血性腦卒中會導致大腦皮層及海馬區域出現病變，如細胞形態改變及細胞間連接確實等，而海馬區變形會導致患者長期認知障礙［9-10］。本研究結果顯示，模型對照組細胞排列紊亂，細胞腫脹破裂，細胞核萎縮；DT不同劑量組海馬區細胞形態均有不同程度的改善，其中DT高劑量組改善最為明顯。這表明DT可以改善缺血性腦卒中后腦組織病理狀態，發揮腦神經保護作用。

血管保護是缺血性腦卒中研究的重要內容，內皮細胞增殖、遷移和形成管腔是血管生成的重要中間過程，血管生成可以增加腦血流，將代謝營養物質輸送至受梗死影響的大腦區域，從而改善缺血性腦卒中。VEGF 是具有促血管生成活性的代表性生長因子，對內皮細胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用［11］。VEGF與其同源受體2結合后，通過激活絲裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇3激酶、AKT 等信號通路促進內皮細胞增殖、尖端細胞絲狀足延伸及細胞外基質降解，從而促進血管出芽并啟動血管生成開關［12］；VEGF 信號還可以促進非肌肉肌球蛋白Ⅱ向表面的募集，通過肌動球蛋白的收縮性促進莖細胞形成管腔［13］。內皮細胞標志物CD31 是一種跨膜糖蛋白，表達于早期和成熟的血管內皮細胞，可響應剪切應力促進血管生成［14］。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型對照組CD31 蛋白表達水平下降，VEGF 蛋白表達水平增加，表明缺血性腦卒中后整體腦血管數量下降，存在血管再生趨勢；與模型組比較，中、高劑量DT給藥7 d后，VEGF、CD31蛋白表達水平均顯著增加，表明DT具有促進血管再生作用。

HIF-1α 是細胞核中的異源轉錄因子，對氧濃度高度敏感。缺氧刺激會促進HIF-1α 進入細胞核，與HIF-1β 形成二聚體，從而調節各種促血管生成因子的轉錄與表達［15］。VEGF 基因的5′末端存在缺氧反應元件，是VEGF 與HIF-1α 的結合位點，因此，在缺氧情況下，HIF-1α 在由VEGF 調節的血管生成中起重要作用［16］。銀杏內酯k 以及臨床常用抗缺血性腦卒中藥物丁基苯酞均可以通過HIF-1α/VEGF 通路促進中風后血管再生挽救腦組織［17-18］。

本研究結果顯示，與假手術組比較，模型對照組HIF-1α 表達增加；與模型對照組比較中、高劑量DT給藥7 d后，HIF-1α表達顯著增加，表明DT可能通過促進HIF1α表達發揮促血管再生作用。

綜上所述，DT 能夠促進大鼠MCAO 后腦血管生成，進而改善缺血側腦組織病理狀態，減少梗死體積，改善大鼠的神經功能。DT促血管生成作用可能與HIF-1α/VEGF 通路有關，這可能是其發揮神經保護作用的重要機制，為DT作為缺血性腦卒中治療新藥提供了實驗依據。