抗磷脂綜合征患者血清Tim-3、Gal-9與輔助性T淋巴細胞因子水平相關(guān)性分析

姚奇岑，陳維飛，林嬌麗，楊潔

1 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，海口 571100；

2 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

抗磷脂綜合征（APS）是一種以抗磷脂抗體（APL）介導(dǎo)的系統(tǒng)性自身免疫病，主要表現(xiàn)為反復(fù)動靜脈血栓形成、病態(tài)妊娠等，根據(jù)APS典型的臨床特點可分為血栓性APS（TAPS）和產(chǎn)科APS（OAPS）。既往認(rèn)為，APS 的發(fā)病機制是APL 介導(dǎo)的凝血和纖溶系統(tǒng)失調(diào)，尤其免疫炎癥極少參與TAPS 的發(fā)病。但隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明CD4+T 淋巴細胞亞群介導(dǎo)的免疫炎癥參與了APS血栓形成及不良妊娠的發(fā)生［1-2］。CD4+T 淋巴細胞在抗原的刺激和相應(yīng)細胞因子作用下可分化為多種細胞亞群，包括輔助性T（Th）細胞、調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞和濾泡性T 輔助細胞。其中Th 細胞又可分為Th1、Th2、Th17，Th1細胞可分泌γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子，Th2 細胞可分泌白細胞介素（IL）-4，Th17 細胞可分泌IL-17［3］。T 細胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子3（Tim-3）是一種負(fù)性共刺激分子，屬于T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子家族一員。Tim-3 主要表達在活化的Th1/Th17 等免疫細胞表面，與天然型配體半乳糖凝集素9（Gal-9）結(jié)合參與適應(yīng)性負(fù)性免疫調(diào)節(jié)［4］。新近研究顯示，Tim-3/Gal-9 信號通路通過負(fù)性調(diào)節(jié)機制參與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等病態(tài)妊娠和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）合并APS 等自身免疫性疾病的發(fā)病［5-6］，但具體機制尚未明確，研究推測可能通過調(diào)節(jié)CD4+T 淋巴細胞的分化、凋亡等方式參與發(fā)病。本研究通過觀察APS患者血清Tim-3、Gal-9 水平，并分析其水平與Th 細胞相關(guān)因子TNFα、IL-17、IL-4 的相關(guān)性，初步探討Tim-3、Gal-9 在APS發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年1 月—2022 年1 月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科、介入科、產(chǎn)科及山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診或住院的APS患者65例，男16例、女49例，年齡16～40歲、平均27.5 歲。患者均符合2006 年悉尼國際APS 會議修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)［7］，其中OAPS 35 例（OAPS 組）、TAPS 30例（TAPS 組）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并蛋白C、蛋白S 和抗凝血酶Ⅲ缺陷癥、血栓性血小板減少性紫癜、纖溶異常、腎病綜合征、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、白塞病、口服避孕藥相關(guān)的血栓、糖尿病血管病變、血栓閉塞性脈管炎等疾病；②合并染色體異常、藥物等其他原因繼發(fā)的妊娠并發(fā)癥；③有慢性支氣管、支氣管哮喘以及支氣管擴張等呼吸系統(tǒng)疾病；④合并感染、腫瘤、嚴(yán)重腎功能損害和心功能不全。另選擇同期健康查體者30例作為對照組，男8例、女22例，年齡16～42歲、平均26歲。本研究通過海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（批號LW2020378），受試者均簽署知情同意書。

1.2 血清Tim-3、Gal-9、TNF-α、IL-17、IL-4 檢測采集受試者空腹靜脈血5 mL，分離血清，-80 ℃保存待測。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測Tim-3、Gal-9、TNF-α、IL-17 及IL-4，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗計量資料是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的以±s表示，兩組之間連續(xù)性變量的比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的以M（Q1，Q3）表示，首先進行方差齊性檢驗，如結(jié)果滿足方差齊性，則采用單因素方差分析或t檢驗方法，如不滿足方差齊性，則采用秩轉(zhuǎn)換檢驗方法。相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清Tim-3、Gal-9 及TNF-α、IL-17、IL-4 水平比較 三組血清Tim-3 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；與對照組比較，OAPS、TAPS 組血清Gal-9、TNF-α、IL-4水平均升高，TAPS組血清IL-17水平升高（P均＜0.01）；與OAPS 組比較，TAPS 組血清TNF-α、IL-4水平升高（P＜0.05或＜0.01）。見表1。

表1 三組血清Tim-3、Gal-9及TNF-α、IL-17、IL-4水平比較（pg/mL± s）

表1 三組血清Tim-3、Gal-9及TNF-α、IL-17、IL-4水平比較（pg/mL± s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與OAPS組比較，#P＜0.05。

組別OAPS組TAPS組對照組n 35 30 30 Tim-3 227.4（189.0，290.2）253.1（180.1，413.2）265.2（188.9，311.2）Gal-9 36.0（31.1，54.3）*43.8（36.7，64.0）*23.1（16.8，29.0）TNF-α 24.0（18.9， 36.8）*37.4（28.1，155.9）*#13.5（10.4， 19.4）IL-17 21.9（18.3，23.9）23.4（22.5，24.4）#20.7（17.8，24.2）IL-4 12.6（11.3，13.2）*13.8（13.2，14.4）*#10.9（10.5，13.2）

2.2 APS 患者血清Tim-3、Gal-9 與TNF-α、IL-4、IL-17的相關(guān)性 APS患者血清Tim-3與Gal-9水平呈正相關(guān)（r=0.536，P＜0.01）。血清Gal-9 與TNF-α 水平呈正相關(guān)（r=0.210，P＜0.01），與IL-17、IL-4水平無明顯相關(guān)性（r分別為0.013、0.009，P均＞0.05）；血清Tim-3 與血清TNF-α、IL-17、IL-4 水平均無明顯相關(guān)性（r分別為0.187、-0.080、-0.125，P均＞0.05）。

3 討論

APS是一種自身抗體介導(dǎo)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，免疫炎癥在其發(fā)病機制中具有重要作用，包括由APL 介導(dǎo)的血小板、單核細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、促炎細胞因子、補體的激活和黏附分子的改變、組織因子上調(diào)等［12］。CD4+T 淋巴細胞亞群及相應(yīng)的細胞因子穩(wěn)態(tài)在自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其中Th1 和Th17 分泌的TNF-α、IL-17 為促炎因子，而Th2 參與分泌的IL-4 對Th1 和Th17 具有拮抗作用。在正常妊娠過程中，CD4+T 淋巴細胞亞群的穩(wěn)態(tài)對維持正常妊娠至關(guān)重要，CD4+T 淋巴細胞亞群失衡可導(dǎo)致病態(tài)妊娠的發(fā)生［9-10］。Th 細胞參與的免疫炎癥與APS 的血栓事件和病態(tài)妊娠的發(fā)病機制相關(guān)，但其具體機制尚未明確。

研究表明，TNF-α、IL-17等促炎因子與APS血栓事件密切相關(guān)［11-13］。TNF-α是由Th1細胞和巨噬細胞釋放的細胞因子，參與局部和全身炎癥，其通過促炎作用參與APS的發(fā)病機制［14-15］。BECAREVIC等［16］報道，TAPS 患者TNF-α 表達升高。XIAO 等［17］報道，原發(fā)性APS 患者IL-17 表達上調(diào)，其機制可能與血栓、血小板減少有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，OAPS、TAPS 組血清TNF-α 水平高于對照組，且TAPS 組高于OAPS組；TAPS 組血清IL-17 水平高于OAPS 組和對照組。這提示CD4+T 淋巴細胞亞群分泌的細胞因子參與APS患者血清炎癥反應(yīng)，其中發(fā)生血栓事件的APS患者血清TNF-α、IL-17 水平更高，TNF-α、IL-17 等促炎因子參與APS的發(fā)病，以TAPS更為顯著。

母胎界面免疫系統(tǒng)的精確調(diào)節(jié)對正常妊娠至關(guān)重要，IL-4 水平是維持正常妊娠的重要免疫調(diào)節(jié)因子。既往研究表明，正常妊娠早期和中期孕婦的血清IL-4水平高于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者，而后者的TNF-α/IL-4 比值升高［10］。因此，Th1/Th2 或Th17/Treg 細胞失衡可能會導(dǎo)致APS 不良妊娠事件（如復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等）的發(fā)生。研究顯示，早期妊娠的孕婦母胎界面蛻膜NK 細胞表面IL-4 表達升高，而TNF-α 表達下調(diào)［12］。本研究結(jié)果顯示，TAPS、OAPS 組血清IL-4 水平均高于對照組，且TAPS 組高于OAPS 組。結(jié)合本研究OAPS 患者TNF-α、IL-17 和IL-4 水平均低于TAPS，提示OAPS 炎癥等致病因素可能與母胎界面的免疫細胞密切相關(guān)。

Gal-9 是一種多面免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛分布于肝、小腸、胸腺、腎、脾臟、肺、心臟和骨骼肌。Tim-3 主要表達于Th1、Th2 和母胎界面的NKT 等免疫細胞表面與Gal-9 結(jié)合后發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用［4］。研究顯示，Gal-9 信號通路通過結(jié)合細胞表面的Tim-3參與自身免疫的調(diào)節(jié)功能，分別通過調(diào)節(jié)巨噬細胞表面Fcγ 受體的表達、下調(diào)效應(yīng)T 細胞和上調(diào)Treg細胞的數(shù)量發(fā)揮抗炎作用，Tim-3、Gal-9 誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞衰竭或凋亡，調(diào)節(jié)Treg 細胞、單核—巨噬細胞、樹突狀細胞及自然殺傷細胞的活性［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3、Gal-9 表達失調(diào)可引起系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病、妊娠并發(fā)癥。VAN DEN HOOGEN等［20］報道，APS和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清Gal-9水平升高，且與疾病活動度存在一定相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，APS 患者血清Gal-9 水平高于對照組，而OAPS、TAPS 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；APS 患者血清Tim-3 水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；相關(guān)性分析顯示Gal-9 與Tim-3 呈正相關(guān)。分析其原因可能是Tim-3 在患者血清中不升高，Gal-9 可能通過與CD4+T淋巴細胞表面的Tim-3調(diào)控CD4+T淋巴細胞凋亡或活化等方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。此外，本研究中APS 患者血清Gal-9 與TNF-α 呈正相關(guān)，表明負(fù)性調(diào)節(jié)因子Gal-9代償性升高與TNF-α水平升高有關(guān)，提示Tim-3/Gal-9 信號通路與Th 細胞相關(guān)的細胞因子TNF-α與APS患者的免疫炎癥機制相關(guān)。需指出的是，TNF-α 與IL-17 同為促炎因子，在APS 患者血清中升高，但與IL-4 水平無明顯相關(guān)性，可能存在其他的作用通路影響，尚無從得知。

綜上所述，APS 患者血清Gal-9 水平升高，血清促炎因子TNF-α、IL-17 水平升高，尤其TNF-α 在血栓性APS 患者中升高更為明顯；血清Gal-9 水平與Th 細胞因子水平存在一定的相關(guān)性。本研究尚存在一定的局限性：首先，隊列中的樣本量較小，且僅局限于血清學(xué)層面，未測定外周血或母胎界面免疫細胞的Tim-3 表達。其次，APS 存在諸多爭議性，譬如我們的研究未納入標(biāo)準(zhǔn)外自身抗體和非標(biāo)準(zhǔn)介導(dǎo)的APS 患者。未來我們將進一步深入研究，以闡明Tim-3/Gal-9 信號通路是否通過調(diào)節(jié)CD4+T 淋巴細胞亞群的穩(wěn)態(tài)來參與APS的發(fā)病機制。