白花丹素對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的干預(yù)作用及其機(jī)制

孫銀雪，岳海云，葛可欣，張東升

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250013；2 解放軍第九六〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科

腺樣囊性癌（ACC）約占唾液腺腫瘤的10%，通常生長(zhǎng)緩慢，但術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高［1］。ACC 根據(jù)組織學(xué)形態(tài)可分為實(shí)性、腺樣或管狀型，實(shí)體型通常分化較差，更具有侵襲性［2］。ACC 的治療首選手術(shù)切除，但臨床上局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍較常見(jiàn)，通常輔以術(shù)后放化療。但ACC 對(duì)傳統(tǒng)化療敏感性不高，且毒性反應(yīng)較重，因此，尋找新的治療藥物對(duì)改善ACC 的療效具有重要意義。白花丹素（PLB）是從白花丹根葉中提取的天然萘醌衍生物［3］，具有抗炎、抗微生物、調(diào)節(jié)血脂及抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，PLB 在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用，包括乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等［5-7］。PLB 主要通過(guò)抗增殖、抗血管生成、抗侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期停滯以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡等發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［3，6-7］。但是PLB 對(duì)ACC 的作用及機(jī)制目前尚未闡明。2021 年5 月—2022 年10 月，我們觀察了不同濃度PLB 對(duì)ACC 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的干預(yù)作用，并探討其作用機(jī)制與線粒體氧化應(yīng)激的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞SACC-83（吉妮歐生物，廣州）。白花丹素（Sigma-Aldrich，上海）；胎牛血清（四季青，浙江）；DMEM（Gibco，美國(guó)）；青—鏈霉素、結(jié)晶紫染色液、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒、DCF-DA 染色試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、TMRE 試劑盒、RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、HRP 標(biāo)記的二抗、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天，上海）；TUNEL 染色試劑盒（羅氏，美國(guó)）；GAPDH、bcl-2、bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 抗體（萬(wàn)類生物，沈陽(yáng)）。二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher，美國(guó)）；高速離心機(jī)（Thermo Fisher，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取SACC-83 細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于5% CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%，按照1∶2傳代。

1.3 細(xì)胞分組與給藥處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為0、12.5、25、50 μmol/L PLB 組，分別加入含0、12.5、25、50 μmol/L PLB的DMSO培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè) 采用LDH 釋放法。取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清10 μL，加入LDH 反應(yīng)液孵育30 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)量450 nm處光密度（OD）值。加入RIPA裂解細(xì)胞，離心取上清，測(cè)量450 nm 處總吸光度B。LDH 釋放量=A/B×100%。以細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH含量表示PLB對(duì)SACC-83的細(xì)胞毒性作用。

1.5 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法，取各組細(xì)胞，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h。在酶標(biāo)儀上測(cè)量450 nm處的OD值。

1.6 細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，加入胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，每個(gè)小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液100 μL。在24 孔板下室加入600 μL 含20% FBS 的培養(yǎng)基，共同培養(yǎng)24 h。遷移細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL 染色法。取各組細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃下與TUNEL 反應(yīng)混合物孵育1 h，DAPI 復(fù)染15 min。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率=TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 細(xì)胞氧化水平檢測(cè) 采用熒光探針DCF-DA檢測(cè)活性氧（ROS）水平。將細(xì)胞以1×104/孔接種在96 孔板中，37 ℃避光條件下與10 mmol/L DCF-DA孵育30 min，使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）。采用微量法檢測(cè)MDA 含量。取各組細(xì)胞，裂解并進(jìn)行蛋白定量后，加入MDA 工作溶液，100 ℃加熱15 min；4 ℃下1 000 r/mim 離心10 min，收集上清。在酶標(biāo)儀上測(cè)量532 nm處吸光度值。

1.9 線粒體膜電位檢測(cè) 采用熒光探針?lè)ā⒓?xì)胞以1×104/孔接種在96 孔板中，37 ℃避光條件下與1 μmol/L TMRE試劑孵育30 min，使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為540 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為595 nm）。1.10 凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，裂解并蛋白定量后，進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別與GAPDH（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、Caspase-3/Cleaved Caspase-3（1∶500）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000）孵育1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目標(biāo)條帶強(qiáng)度，Image J 軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以Bcl-2/Bax、Cleaved Caspase-3/Caspase-3表示。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞毒性比較 對(duì)照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB 組細(xì)胞LDH 釋放量（OD 值）分別為0.073 ± 0.001、0.129 ± 0.005、0.410 ± 0.038、0.461 ± 0.030，PLB不同濃度組LDH釋放量均高于對(duì)照組，其中25、50 μmol/L PLB組高于12.5 μmol/L PLB組，50 μmol/L PLB組高于25 μmol/L PLB組（P均＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較 對(duì)照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB組細(xì)胞增殖OD值分別為0.610 ± 0.026、0.529 ± 0.027、0.125 ± 0.026、0.108 ± 0.003，PLB 不同濃度組細(xì)胞增殖能力均較對(duì)照組下降，其中25、50 μmol/L PLB 組低于12.5 μmol/L PLB 組（P均＜0.05），25 μmol/L PLB 組與50 μmol/L PLB組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 對(duì)照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB 組細(xì)胞遷移率分別為100.0% ± 4.5%、83.5% ± 5.7%、64.2% ± 10.1%、54.2% ± 3.5%，PLB 不同濃度組細(xì)胞遷移率均低于對(duì)照組，其中25、50 μmol/L PLB 組低于12.5 μmol/L PLB 組（P均＜0.05），25 μmol/L PLB組與50 μmol/L PLB組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況比較 對(duì)照組以及12.5、25、50 μmol/L PLB 組細(xì)胞凋亡率分別為5.6% ± 0.1%、22.0% ± 0.1%、52.1% ± 13.4%、70.1% ± 1.3%，PLB不同濃度組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，其中25、50 μmol/L PLB 組高于12.5 μmol/L PLB 組，50 μmol/L PLB組高于25 μmol/L PLB組（P均＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞氧化水平比較 25、50 μmol/L PLB組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平均高于對(duì)照組和12.5 μmol/L PLB 組，其中50 μmol/L PLB 組高于25 μmol/L PLB組（P均＜0.05）。25、50 μmol/L PLB 組細(xì)胞內(nèi)MDA水平均高于對(duì)照組，其中50 μmol/L PLB 組高于12.5、25 μmol/L PLB 組（P均＜0.05）。其他兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞ROS、MDA水平比較

表1 各組細(xì)胞ROS、MDA水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與12.5 μmol/L PLB 組比較，#P＜0.05；與25 μmol/L PLB組比較，△P＜0.05。

組別對(duì)照組12.5 μmol/L PLB組25 μmol/L PLB組50 μmol/L PLB組ROS 719 ± 220 1 040 ± 247 4 813 ± 562*#6 690 ± 919*#△MDA 0.229 ± 0.031 0.504 ± 0.076 0.841 ± 0.257*1.337 ± 0.397*#△

2.6 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較 對(duì)照組和12.5、25、50 μmol/L PLB 組細(xì)胞線粒體膜電位熒光強(qiáng)度分別為433 ± 84、351 ± 148、223 ± 18、166 ± 6，其中25、50 μmol/L PLB 組線粒體膜電位低于對(duì)照組，50 μmol/L PLB 組細(xì)胞線粒體膜電位低于12.5 μmol/L PLB 組（P均＜0.05），其他兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。

2.7 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 PLB不同濃度組Bcl-2/Bax 均低于對(duì)照組，Cleaved Caspase-3/Caspase-3 均高于對(duì)照組（P均＜0.05），12.5、25、50 μmol/L PLB 組間兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（ s）

表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（ s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組12.5 μmol/L PLB組25 μmol/L PLB組50 μmol/L PLB組Bcl-2/Bax 12.030 ± 1.724 0.419 ± 0.115*0.490 ± 0.055*0.021 ± 0.008*Cleaved Caspase-3/Caspase-3 0.305 ± 0.022 1.198 ± 0.074*1.475 ± 0.253*1.798 ± 0.174*

3 討論

植物中含有的一些天然活性產(chǎn)物可以抑制腫瘤細(xì)胞生物合成和有絲分裂，具有作為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的巨大潛力，已經(jīng)用于治療惡性腫瘤的如長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等［8］。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，人們通過(guò)基因修飾促進(jìn)天然藥物活性物質(zhì)積累，甚至生產(chǎn)異源重組蛋白，進(jìn)一步拓寬了植物來(lái)源抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)潛力。PLB是從中藥白花丹的根系中分離的一種天然萘醌化合物［9］，可調(diào)控NF-κB、AKT、MMP-9、VEGF、STAT3、MAPK 等多種信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤活性［3，10-12］，包括誘導(dǎo)DNA 和線粒體損傷［13］、凋 亡［6，14］和 自噬［12］、細(xì) 胞 周 期 停滯［14］、抗 血管 生成［11，15］和腫瘤轉(zhuǎn)移［15］等。研究表明，在乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中，PLB 可誘導(dǎo)ROS 生成及線粒體膜電位降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］；在胰腺癌細(xì)胞中，PLB 可通過(guò)損傷線粒體誘導(dǎo)應(yīng)激信號(hào)，并通過(guò)激活內(nèi)在凋亡信號(hào)誘導(dǎo)ROS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［16］；在人舌鱗癌SCC25細(xì)胞中，PLB可激活死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖［14］。然而，PLB 在涎腺腺樣囊性癌SACC-83 細(xì)胞中的抗腫瘤作用和機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，不同濃度PLB 培養(yǎng)SACC-83 細(xì)胞24 h后，細(xì)胞LDH釋放量均高于對(duì)照組，PLB濃度越高，LDH 釋放量越高，提示PLB 對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。不同濃度PLB 培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞的增殖和遷移能力均降低，凋亡率均升高，其中25和50 μmol/L PLB組的效果明顯強(qiáng)于12.5 μmol/L PLB 組。此外，不同濃度PLB 組細(xì)胞Bcl-2/Bax 均低于對(duì)照組，而Cleaved Caspase-3/Caspase-3 均高于對(duì)照組，提示抗凋亡信號(hào)減弱、促凋亡信號(hào)增強(qiáng)。因此認(rèn)為，PLB 可有效抑制腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

凋亡作為一種常見(jiàn)的程序性細(xì)胞死亡形式，可能是PLB發(fā)揮抗涎腺腺樣囊性癌增殖和遷移的重要機(jī)制。線粒體作為一種古老的細(xì)胞器，不僅通過(guò)多種代謝模式為生命提供動(dòng)力，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中也具有至關(guān)重要的作用［17-18］。在誘導(dǎo)線粒體凋亡時(shí)，線粒體外膜通透性增加可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其下游的凋亡信號(hào)通路涉及線粒體釋放的細(xì)胞色素C和隨后的Caspase活化［19］。因此，針對(duì)線粒體外膜通透性從而調(diào)控細(xì)胞死亡具有巨大的治療潛力。本研究結(jié)果顯示，25、50 μmol/L PLB 組相比12.5 μmol/L PLB組和對(duì)照組具有更高的ROS和MDA水平，提示中高濃度PLB可促進(jìn)腺樣囊性癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激。與對(duì)照組相比，25、50 μmol/L PLB 處理24 h 后，細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低，提示PLB 可能促進(jìn)腺樣囊性癌細(xì)胞線粒體應(yīng)激介導(dǎo)的ROS 生成，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。此外，線粒體在其他形式的程序性細(xì)胞死亡，包括壞死、鐵死亡和焦亡中可能也具有重要的作用［17］，提示PLB 可能存在基于線粒體調(diào)控細(xì)胞死亡的新的途徑，這將成為我們下一步的研究重點(diǎn)。

綜上所述，PLB 通過(guò)誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激以及ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，可促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和線粒體膜電位降低，激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。PLB有望被開(kāi)發(fā)為治療包括腺樣囊性癌在內(nèi)的多種腫瘤的天然活性藥物。盡管PLB具有廣泛的抗腫瘤活性，然而其用作抗腫瘤藥物仍存在一些困難：PLB作為天然活性物質(zhì)，其本身存在水溶性差、生物利用度低的問(wèn)題；PLB對(duì)動(dòng)物具有中等毒性，作為抗腫瘤藥物其安全性仍有待研究［20］。目前，研究者們已經(jīng)開(kāi)始著眼于研究和解決PLB 轉(zhuǎn)化所面臨的困難，針對(duì)PLB生物利用度低的問(wèn)題，有報(bào)道納米封裝可以提高PLB 的生物利用度，且不會(huì)削弱其抗腫瘤活性［21］。針對(duì)PLB 的生物毒性，有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠口服或腹腔注射PLB引起毒副作用的毒性劑量分別為8～65 mg/kg 和16 mg/kg［11］，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其發(fā)揮抗腫瘤作用的生物效應(yīng)劑量。然而B(niǎo)ELLO 等［22］研究表明，口服2.5 mg/kg PLB 即可誘導(dǎo)線粒體依賴性睪丸細(xì)胞死亡，導(dǎo)致精子數(shù)量和活力下降。因此，PLB 可能并不適用于具有生育需求的腫瘤患者。盡管PLB 展現(xiàn)出優(yōu)秀的潛在應(yīng)用前景，我們?nèi)孕鑼?duì)其效應(yīng)機(jī)制、毒性和安全性進(jìn)行更全面和深入的研究。