MAGEA4和MAGEC1基因在肝細胞癌組織中表達變化及潛在轉錄調控機制的生物信息學分析

梁子謙，黃李浩赟，孫浩嘉，吳曉娜，蘇顏雄，賀菽嘉

1 廣西醫科大學臨床醫學系，南寧 530021；2 廣西醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室；3 廣西高校生物分子醫學研究重點實驗室

肝細胞癌（HCC）是全球惡性腫瘤相關死亡的第三大原因。目前HCC 的治療手段包括手術、射頻消融、經肝動脈化療栓塞以及酪氨酸激酶抑制劑、免疫檢查點阻斷治療等，然而患者的預后仍不理想。深入探討HCC 發生發展的相關分子機制，有助于發現HCC 潛在的治療靶點，對改善患者預后具有重要意義。黑素瘤相關抗原（MAGE）是一類重要的癌—睪丸抗原，該家族中的部分成員在多種類型惡性腫瘤中呈高表達，而在正常組織中限制性低表達，是腫瘤免疫治療的潛在靶標［1］。MAGEA4和MAGEC1屬于Ⅰ類MAGE家族成員，與腫瘤的關系十分密切，其中MAGEA4 在非小細胞肺癌、乳腺癌、子宮內膜癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達［2-4］，MAGEC1 在乳腺癌、結直腸癌、HCC 組織中存在異常表達［5-7］。然而既往研究中樣本例數較少、來源不同等因素的影響，MAGEA4 和MAGEC1 表達在HCC 發生發展中的作用目前尚不明確。2021 年3 月—2022 年3 月，本研究通過檢索、收集、統計處理HCC 相關數據集，通過大樣本量的數據分析綜合探究MAGEA4 和MAGEC1 在HCC 和癌旁正常肝組織中的表達水平、預后意義及潛在轉錄調控機制，以期為HCC 的診斷治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數據信息來源 從TCGA 數據庫下載TCGA-LIHC 數據集的RNA 測序數據（包含HCC組織407 例，癌旁正常肝組織58 例），數據形式為FPKM；利用R 軟件（4.1.0）將FPKM 矩陣轉化為TPM 矩陣，利用R 軟件包limma 將表達矩陣標準化。同 時 從GEO 數 據 庫 下 載GSE10143、GSE20140、GSE87630、GSE107170 4 個RNA 芯片數據集，分別包含HCC 組織80、35、64、173 例，癌旁正常肝組織307、34、30、116 例。共納入HCC 組織759 例，癌旁正常肝組織545例。

1.2 MAGEA4、MAGEC1 在HCC 組織中的表達分析 利用GraphPad Prism 8 軟件繪制散點圖分析MAGEA4、MAGEC1 在HCC 與癌旁正常肝組織中的表達差異，并分析在HCC 組織中MAGEA4 與MAGEC1表達的相關性。

1.3 MAGEA4、MAGEC1 區分HCC 和癌旁正常肝組織的能力評估 繪制受試者工作特征（ROC）曲線，以中位數區分MAGEA4 和MAGEC1 的高表達和低表達，依據曲線下面積（AUC）評估MAGEA4 和MAGEC1 表達區分HCC 和癌旁正常肝組織的能力。AUC 0.5～＜0.7 提示低區分能力，0.7～＜0.9 提示中等區分能力，≥0.9提示高區分能力。

1.4 MAGEA4、MAGEC1對HCC預后影響的分析 利用TCGA-LIHC 隊列的隨訪數據，使用Kaplan-Meier 生存曲線分析MAGEA4 和MAGEC1 與HCC 預后的影響。使用Cox 回歸分析計算風險比（HR），HR＞1提示為預后危險因素，＜1提示為預后保護因素。

1.5 調控MAGEA4、MAGEC1 表達的轉錄因子和miRNA 的預測 使用Cistrome DB 數據預測上游調控MAGEA4、MAGEC1 表達的轉錄因子，選擇score≥0.3 的轉錄因子并取交集。使用TargetScan Human v8.0 預測與MAGEA4、MAGEC1 具有靶向關系的miRNA，選擇score≤-0.2 的miRNA 并取交集。采用R 語言ggseqlogo 包繪制轉錄因子的序列圖，Cytoscape3.6.1 軟件繪制轉錄因子-miRNA-mRNA 網絡圖。使用JASPAR 數據庫尋找轉錄因子與MAGEA4、MAGEC1轉錄起始位點上游的結合位點。

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism5.0 軟件。計量資料以± s 表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，相關性分析采用Pearson 相關分析法。采用Log-Rank 檢驗比較兩組生存率的差異。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC與癌旁正常肝組織中MAGEA4、MAGEC1表達比較 在納入的5個HCC 數據集中，MAGEA4、MAGEC1 在HCC 組織中的表達水平均高于癌旁正常肝組織（P均＜0.05）。見表1、2。在TCGA-LIHC、GSE10143、GSE107170 數 據 集 中，MAGEA4 與MAGEC1在HCC組織中的表達均呈正相關（r分別為0.322、0.299、0.482，P均＜0.01），在GSE20140、GSE87630數據集中，MAGEA4與MAGEC1在HCC組織中的表達無明顯相關性（r分別為-0.139、0.186，P均＞0.05）。

表1 MAGEA4在HCC和癌旁正常肝組織中的表達 比較（± s）

表1 MAGEA4在HCC和癌旁正常肝組織中的表達 比較（± s）

注：與數據集內HCC組織比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

數據集TCGA-LIHC HCC組織 癌旁正常肝組織GSE10143 HCC組織 癌旁正常肝組織GSE20140 HCC組織 癌旁正常肝組織GSE87630 HCC組織 癌旁正常肝組織GSE107170 HCC組織 癌旁正常肝組織n 407 58 80 307 35 34 64 30 173 116 MAGEA4-1.733 ± 3.286-2.733 ± 1.761**9.914 ± 0.474 8.926 ± 0.716**7.188 ± 1.353 6.707 ± 0.070*2.660 ± 0.091 2.623 ± 0.059*3.185 ± 0.897 3.029 ± 0.134**MAGEC1 1.071 ± 5.078-2.485 ± 1.785**10.770 ± 1.114 8.825 ± 0.792**6.939 ± 0.479 6.699 ± 0.045**2.709 ± 0.130 2.619 ± 0.053**4.246 ± 1.443 3.597 ± 0.367**

2.2 MAGEA4、MAGEC1對HCC和癌旁正常肝組織的區分能力 ROC 曲線提示，MAGEA4 區分HCC 和癌旁正常肝組織具有輕到中度準確性（AUC=0.545～0.858），MAGEC1 區分HCC 和癌旁正常肝組織具有輕到高度準確性（AUC=0.613～0.931），見OSID 碼圖1。

2.3 MAGEA4、MAGEC1 表達對預后的影響 MAGEA4 高表達和低表達HCC 患者的5 年生存率分別為33.9%、54.4%，MAGEA4是HCC預后的危險因素（P=0.000 43，HR=1.97）。MAGEC1 高表達和低表達HCC 患者的5 年生存率分別為46.9%、51.6%，二者比較差異無統計學意義（P=0.300 00），見OSID碼圖2。

2.4 MAGEA4 和MAGEC1 潛在的轉錄調控因子 通過預測，與MAGEA4 和MAGEC1 均具有靶向關系的miRNA 為hsa-miR-1827。TargetScan Human v8.0分析發現，該miRNA 與MAGEA4 的3'-非翻譯區（3'-UTR）存在7mer-A1 的結合模式，與MAGEC1 的3'-UTR存在8mer的結合模式。見OSID碼圖3。進一步分析發現2個與MAGEA4和MAGEC1具有潛在調控關系的轉錄因子，即MYC 和TFAP2A，預測它們與MAGEA4、MAGEC1轉錄起始位點上游的結合序列見表2。

表2 轉錄因子與MAGEA4、MAGEC1轉錄起始位點上游 的結合序列（結合分數＞0.8）

3 討論

MAGE 家族是人類發現的第一個癌—睪丸抗原。研究顯示，多種MAGE 基因在HCC 組織中呈異常表達，并且與腫瘤臨床分期及患者總生存率相關；表達失調的MAGE家族成員可能通過參與G蛋白偶聯受體通路在信號傳導中發揮重要作用，從而影響HCC的發生發展［8］。MAGEA4和MAGEC1參與多種惡性腫瘤的發生發展，過表達的MAGEA4 在非小細胞肺癌中通過抑制Caspase-3 的活性從而抑制細胞凋亡，因而有利于腫瘤細胞的生長［9］；而過表達的MAGEC1 可抑制Caspase-9 和Caspase-12 的活性，發揮抑制骨髓瘤細胞凋亡的作用［10］。因此推測，MAGEA4 可能是T 細胞免疫治療一個有潛力的靶點［11-12］，MAGEC1 可能通過抑制細胞凋亡從而參與惡性腫瘤的發展。目前關于MAGEA4 和MAGEC1在腫瘤中表達的文獻較少，轉錄調控機制仍不清楚，因此我們借助公共高通量數據庫TCGA和GEO中的HCC 數據集，減少實驗條件的局限性，并排除人種、臨床分期、病理類型等腫瘤異質性帶來的偏倚，通過多中心大樣本分析，結果顯示MAGEA4 和MAGEC1在HCC 組織中呈高表達。進一步通過Pearson 相關分析，發現MAGEA4與MAGEC1在HCC組織中的表達呈正相關，提示二者可能共同參與了HCC 的發生發展。

MAGE 家族在腫瘤中的預后價值一直是學者的關注點。一項研究通過多因素Cox 回歸分析表明，MAGEA4 是非小細胞肺癌患者預后的獨立危險因素［9］。另一項研究顯示，MAGEC1 蛋白的表達與HCC 患者總生存期降低有關［6］。本研究通過生存分析發現，MAGEA4 是HCC 患者預后的危險因素，與HCC 患者總生存率降低相關；而MAGEC1與HCC 患者的預后無明顯相關，提示MAGEC1 可能具有與家族其他成員不同的生物學功能；抑或是MAGEC1 的基因表達與蛋白合成并不同步，在轉錄、轉錄后、翻譯和翻譯后可能受到不同的調控因子影響。

轉錄因子識別和直接結合特定DNA 序列后，可通過直接激活轉錄、募集RNA 聚合酶Ⅱ或結合增強子起到激活轉錄的作用；也可通過結合沉默子、募集阻遏物使轉錄抑制［13］。miRNA通過與mRNA的3'-UTR互補結合，使mRNA降解或抑制翻譯，在基因表達的轉錄后調控中發揮重要作用［14］。本研究推測hsamiR-1827 以 及轉 錄因 子MYC、TFAP2A 可能 調 控MAGEA4、MAGEC1 的表達，從而參與HCC 發生與進展的調控。有研究發現，環狀RNA hsa_circ_0003141 作為競爭性內源RNA 參與hsa-miR-1827/UBAP2 軸的調控［15］。轉錄因子MYC 通過靶向上調纖連蛋白FN1 的表達而促進HCC 的侵襲、發展［16］；轉錄因子TFAP2A 在HCC 中的作用仍不清楚，但已有文獻報道其可以通過miR-204-5p/TFAP2A 反饋環路促進宮頸癌細胞的增殖、遷移及上皮間充質轉化［17］。

綜上所述，本研究首次采用大樣本量綜合研究的方法揭示了MAGEA4 和MAGEC1 在HCC 組織中的高表達，且兩者的表達呈正相關，高表達的MAGEA4 與HCC 患者的不良預后有關。此外，本研究還對MAGEA4、MAGEC1 的轉錄調控機制進行了初步預測，發現hsa-miR-1827 以及轉錄因子MYC、TFAP2A 對MAGEA4、MAGEC1 具有潛在的轉錄調控作用。MAGEA4 和MAGEC1 可作為HCC 潛在的免疫治療靶點，具有廣泛的應用前景。