臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在親緣單倍型造血干細(xì)胞移植治療難治性重型再生障礙性貧血中的應(yīng)用

袁芳芳，宗上綱，李明會，馬楠，王勇奇，李鋼蘋，李子夜，符粵文，王莉

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 血液科，河南 鄭州 450000；2.河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)研究和轉(zhuǎn)化中心，河南 鄭州 450000)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一種以全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)的獲得性骨髓衰竭性疾病，其治療選擇取決于疾病嚴(yán)重程度、供者可及性和患者年齡[1-2]。有人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)相合同胞供者的年輕重型再生障礙性貧血(severe aplastic anemia，SAA)患者首選異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic stem cell transplantation，Allo-HSCT)，總生存率>80%[3-4]，而無HLA相合同胞供者的年輕患者和年齡>40歲的患者，首選免疫抑制治療(immunosuppressive therapy，IST)。但IST治療長期應(yīng)答率較低，約25%的患者在IST治療后仍不能脫離輸血，血象及骨髓象仍符合SAA診斷標(biāo)準(zhǔn)，稱為難治性SAA[5-6]。對于無同胞全相合供者的難治性重型再生障礙性貧血(refractory severe aplastic anemia，RSAA)患者，可選擇替代供者如非血緣供者(matched unrelated donor，MUD)、親緣單倍型供者(haploidentical donor，HID)進行Allo-HSCT[7-9]。然而，RSAA患者多病史較長，輸血較多且長期口服免疫抑制劑，存在鐵過載、器官功能損傷，大大增加了移植風(fēng)險。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是多能的非造血祖細(xì)胞，可支持造血，增強HSCT植入，并降低移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的發(fā)病率[10-12]。相比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSCs)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)體外增殖更快，更易獲得，免疫原性更低且具有更強的免疫抑制作用[13-16]。因此，本研究采用UC-MSCs與單倍型供者干細(xì)胞共同輸注以改善單倍型造血干細(xì)胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，Haplo-HSCT)治療RSAA的效果。現(xiàn)對18例應(yīng)用該方案進行Allo-HSCT的患者進行回顧性分析并報告如下。

1 病例與方法

1.1 納入病例本回顧性研究納入2016年1月至2020年12月在鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受HID造血干細(xì)胞聯(lián)合UC-MSCs共移植的18例RSAA患者，均為首次移植。所有患者均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]。患者的供者來自其父親或同胞，采用高分辨基因分型檢測方法，分別檢測供受者的HLA-A、B、DR、DQ、Cw共10個位點。所有供者均符合捐獻條件且自愿捐贈造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 預(yù)處理方案所有患者均接受以免疫抑制為主的減低劑量預(yù)處理方案，以氟達(dá)拉濱+抗胸腺細(xì)胞球蛋白+環(huán)磷酰胺±低劑量全身照射±白消安，5例患者加用2～3 Gy全身照射，3例患者加用白消安。

1.3 HSC動員、采集和回輸所有患者均有UC-MSCs的聯(lián)合輸注，UC-MSCs來自山東省臍血庫/山東省齊魯干細(xì)胞工程有限公司，輸注前常規(guī)進行細(xì)胞活性、細(xì)胞表型及內(nèi)毒素檢測，于HID干細(xì)胞輸注前4 h進行輸注，劑量為(1～2)×106kg-1，每例患者均從單個供體獲得UC-MSCs。對單倍型供者每日皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rh-G-CSF)5 μg·kg-1進行HSC動員，連續(xù)5～6 d，父供者于第5天時采集供者骨髓5～8 mL·kg-1(以受者體質(zhì)量)，第6天應(yīng)用費森尤斯血細(xì)胞分離機采集供者外周血干細(xì)胞(peripheral blood stem cells， PBSC)，同胞供者于第5天采集PBSC。UC-MSCs回輸后4 h輸注供者骨髓或供者PBSC。采集后的干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀進行MNC、CD34+細(xì)胞計數(shù)。

1.4 GVHD的預(yù)防、診斷和分級所有患者均接受環(huán)孢素A(cyclosporine，CsA)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)、短程甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)預(yù)防GVHD。具體用量：靜脈應(yīng)用CsA 2.5～3.0 mg·kg-1·d-1，-7 d始(以干細(xì)胞回輸當(dāng)天為第0天，回輸前為-，回輸后為+)至胃腸道功能恢復(fù)后，改為口服，血藥濃度維持在150～250 μg·L-1，口服至移植后 1 a逐漸減量。每12 h口服MMF 15 mg·kg-1，-7 d～+30 d，+31 d劑量減半，+60 d停用；短療程靜脈應(yīng)用MTX 15 mg·m-2+1 d，10 mg·m-2+3 d、+6 d、+11 d。當(dāng)出現(xiàn)Ⅱ度及以上的急性GVHD時，采用甲潑尼龍一線治療，必要時加用抗CD25單抗、蘆可替尼等免疫抑制劑治療。采用甲潑尼龍、CsA、蘆可替尼等治療慢性GVHD。急、慢性GVHD的診斷和分級分別依據(jù)西雅圖標(biāo)準(zhǔn)和NIH標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。

1.5 支持治療所有患者均入住百級層流病房，給予更昔洛韋預(yù)防病毒感染，預(yù)防性應(yīng)用抗真菌藥物。預(yù)處理過程中加強水化、堿化。+4 d始給予皮下注射rh-G-CSF及重組人血小板生成素，移植期間輸注的紅細(xì)胞及血小板均經(jīng)輻照處理。粒系植入后每周1～2次檢測巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)拷貝數(shù)，必要時應(yīng)用更昔洛韋、膦甲酸鈉抗CMV治療，應(yīng)用利妥昔單抗抗EBV治療。

1.6 植入標(biāo)準(zhǔn)及嵌合體檢測以外周血中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)>0.5×109L-1連續(xù)3 d的第1天為粒細(xì)胞植入，血小板計數(shù)>20×109L-1連續(xù)7 d且脫離輸注的第1天為血小板植入。采用DNA短串聯(lián)重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測嵌合體，移植后+28 d首次檢測嵌合體，供體細(xì)胞比例≥95%報告為完全供體嵌合狀態(tài)；供體細(xì)胞比例>5%且<95%報告為混合嵌合狀態(tài)；≤5%報告為完全患者嵌合狀態(tài)。

1.7 生存、隨訪及統(tǒng)計分析隨訪至2022年6月30日，總生存時間定義為干細(xì)胞回輸日至隨訪截止或死亡日期。應(yīng)用SPSS 25.0軟件繪制生存曲線，采用Kaplan-Meier法計算中位生存期。

2 結(jié)果

2.1 病例特征18例患者中男10例，女8例，中位年齡15(6～32)歲，診斷至移植的中位時間為21.40(7.90～145.30)個月， SAA 6例， 極重型再生障礙性貧血(very severe aplastic anemia，VSAA) 2例，2例患者移植前存在活動性感染，18例患者移植前血清鐵蛋白均高于正常，中位血清鐵蛋白為3 517(948～13 460)μg·L-1。供受者HLA相合情況：15例供者為HLA 5/10相合，2例為6/10，1例為7/10。15例為父供，其余3例為同胞供者。ABO血型相合移植12例，不合移植6例。所有患者回輸骨髓和PBSC總的MNC和CD34+細(xì)胞中位數(shù)分別為10.40(5.13～25.93)×108kg-1、4.80(2.31～18.42)×106kg-1。18例患者臨床資料見表1。

表1 18例RSAA患者臨床特征及供者情況

2.2 植入情況所有患者均獲得粒系植入，粒細(xì)胞植入的中位時間為13(11～23)d，+30 d粒系累積植入率為100.00%，17例患者血小板植入，血小板植入的中位時間為14(12～26)d， +100 d巨核系累積植入率為94.40%，1例患者于巨核系植入前死于顱內(nèi)出血。+28 d首次檢測嵌合體，18例患者均達(dá)到完全供者嵌合。18例患者植入及嵌合情況見表2。

表2 18例RSAA患者臨床轉(zhuǎn)歸

表2(續(xù))

2.3 GVHD發(fā)生情況移植后100 d內(nèi)共8例患者發(fā)生aGVHD，中位aGVHD發(fā)生時間為28.0(15.0～91.0)d，Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD、Ⅲ度急性GVHD、慢性GVHD發(fā)生率分別為38.89%(7/18)、5.56%(1/18)、23.53%(4/17)，17例患者移植后生存超過100 d，其中4例(23.50%)發(fā)生cGVHD，3例為局限型，1例為廣泛型，中位發(fā)生時間為8.3(4.3～16.0)個月。1例Ⅲ度aGVHD患者及1例廣泛型cGVHD患者累及皮膚、腸道、肝臟、中樞，應(yīng)用激素、抗CD25單抗、CsA、糞菌移植等治療無明顯改善，最終死于aGVHD及感染，其余急、慢性GVHD患者經(jīng)治療后均得到控制。

2.4 移植后感染及其他并發(fā)癥18例患者中有6例(33.30%)移植后出現(xiàn)CMV再激活，無CMV病發(fā)生，給予更昔洛韋、膦甲酸鈉、靜注人免疫球蛋白等治療后CMV感染控制。共有8例(44.40%)患者移植后出現(xiàn)EBV再激活，其中5例為自限性，其余3例[其中1例移植后淋巴組織增生性疾病(post-transplantation lymphoproliferative disorders，PTLD)]經(jīng)利妥昔單抗治療后好轉(zhuǎn)。共有10例患者移植后發(fā)生出血性膀胱炎，經(jīng)水化、堿化、抗病毒等支持治療均好轉(zhuǎn)。共5例(27.77%)患者移植后合并細(xì)菌和/或真菌感染。無患者出現(xiàn)肝靜脈閉塞病、閉塞性細(xì)支氣管炎、移植相關(guān)性血栓性微血管病等移植相關(guān)并發(fā)癥。

2.5 生存情況移植后中位隨訪時間32.97(1.60～63.67)個月，18例患者中3例死亡，其中2例死于GVHD合并重癥感染，1例死于出血并發(fā)癥，15例生存，3 a總生存率為(83.3±8.8)%，15例存活患者均脫離輸血依賴，血象恢復(fù)正常，生活質(zhì)量良好。18例患者生存曲線見圖1。

圖1 18例RSAA患者移植后生存曲線(K-M法)

3 討論

一線IST治療失敗的RSAA患者接受替代供者HSCT的預(yù)后顯著優(yōu)于接受二次IST治療(移植組FFS 83.9%，二次IST組FFS 9.5%)[20]，因此對于年輕的RSAA患者，應(yīng)及早行Allo-HSCT。Haplo-HSCT主要受限于植入失敗和GVHD的高發(fā)率[7,21-22]，總生存率為64.6%～89.0%[7-9]。MSCs是多能的非造血祖細(xì)胞，可從多種組織獲得，包括骨髓、臍帶、脂肪組織和胎盤，不同組織來源的MSCs具有不同的生物學(xué)特性。大量研究表明，MSCs通過調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的增殖和功能而具有免疫調(diào)節(jié)特性，例如，抑制單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞，改變樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞因子譜，導(dǎo)致調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的上調(diào)和炎癥細(xì)胞因子的下調(diào)，誘導(dǎo)原始T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的耐受表型，抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抑制NK細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。MSCs在單倍體造血干細(xì)胞移植中具有很高的應(yīng)用前景，相比于骨髓MSCs，UC-MSCs體外增殖更快，更易獲得，免疫原性更低且具有更強的免疫抑制作用[13-16]。本中心前期將UC-MSCs應(yīng)用于接受MSD/MUD HSCT的SAA患者，驗證了其療效及安全性[23-24]，因此自2016年以來開始探索將UC-MSCs應(yīng)用于接受HID-HSCT的RSAA患者。

植入失敗是Allo-HSCT的嚴(yán)重并發(fā)癥，非惡性血液病患者的發(fā)生率比惡性血液病患者高3倍[25]，相比同胞全相合Allo-HSCT，接受無關(guān)供者移植及親緣單倍體移植的SAA患者更容易發(fā)生植入失敗。在動物模型中，MSCs與造血干細(xì)胞的共同移植改善了移植效果，因此研究者推測MSCs有助于造血干細(xì)胞植入[26-27]。Noort等[26]研究證明在非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠中，MSCs和CD34+細(xì)胞共同輸注可促進人造血干細(xì)胞植入。Ding等[28]采用單倍型造血干細(xì)胞與UC-MSCs共輸注治療25例成人SAA患者，粒系及巨核系中位植入時間分別為16.12和28.30 d。本研究中18例患者粒系及巨核系植入中位時間分別為13(11～23)d、14(12～26)d，僅1例患者于巨核系植入前因顱內(nèi)出血死亡，粒系累積植入率為100.00%，巨核系累積植入率為94.40%。

GVHD是SAA在HID-HSCT中的另一個重大挑戰(zhàn)，研究報道不同移植體系進行HID-HSCT時aGVHD的發(fā)病率(Ⅱ級)為12%～42%，cGVHD為20%～56%[29-31]。Xu等[9]進行的一項前瞻性多中心研究納入了101例接受Haplo-HSCT的難治性SAA患者，中位隨訪時間為18.3個月，Ⅱ～Ⅳ級aGVHD發(fā)生率為33.7%，cGVHD發(fā)生率為22.4%，3 a總生存率為89.0%。一項52例兒童SAA患者接受Haplo-HSCT治療的研究中，Ⅱ～Ⅳ級和Ⅲ～Ⅳ級aGVHD的累積發(fā)生率分別為(39.2±0.5)%和(13.7±0.2)%，cGVHD的累積發(fā)生率為(34.2±0.5)%，中位隨訪時間744.5個月，3 a總生存率和無失敗生存率分別為(84.5±5.0)%和(82.7±5.2)%[32]。

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)特性，可能調(diào)節(jié)針對同種異體抗原的免疫反應(yīng)，對GVHD的預(yù)防或治療可能是安全有效的[33-35]。Wu等[36]將培養(yǎng)擴增的第三方供體UC-MSCs共同移植到21例接受Haplo-HSCT的SAA患者中，Ⅱ～Ⅳ級aGVHD和cGVHD的發(fā)生率分別為42.8%和50.0%，2 a無疾病生存率為74.1%。一項多中心Ⅱ期研究納入了44例SAA患者接受MSC聯(lián)合haplo-HSCT，41例患者可評估，中位隨訪時間12個月，Ⅱ～Ⅳ級aGVHD(29.3%)和cGVHD(14.6%)的發(fā)病率較低，總生存率為77.3%[8]。近期一項meta分析也表明，MSC輸注降低了cGVHD的發(fā)病率[35]。本研究中18例患者Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD、Ⅲ度急性GVHD、慢性GVHD發(fā)生率分別為38.89%(7/18)、5.56%(1/18)、23.53%(4/17)，重度aGVHD及cGVHD發(fā)生率均較低。中位隨訪時間32.97(1.60～63.67)個月，3 a總生存率為(83.3±8.8)%，15例存活患者均脫離輸血依賴，血象恢復(fù)正常，生活質(zhì)量良好，對于RSAA患者而言，療效令人滿意。

CMV、EBV感染是allo-HSCT后的常見并發(fā)癥，是引起移植后非復(fù)發(fā)死亡的重要危險因素。移植后早期免疫重建不佳可能是患者移植后PTLD及CMV感染率高的危險因素[37]。鑒于MSCs非特異性免疫抑制的特點，對MSCs是否增加患者感染風(fēng)險仍存在爭論。Karlsson等[38]發(fā)現(xiàn)，MSCs對病毒誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)無明顯抑制作用，EBV特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)或與BM-MSCs培養(yǎng)的CMV特異性CTL保留增殖和產(chǎn)生干擾素的能力，在體外對病毒抗原作出反應(yīng)并殺死病毒感染的細(xì)胞。Xu等[9]報道接受HID-HSCT的SAA患者CMV、EBV再激活率分別為68.3%、17.8%。本研究中18例患者中僅6例(33.30%)移植后出現(xiàn)CMV再激活，且無CMV病發(fā)生。EBV再激活發(fā)生率較高(44.40%)，但多數(shù)為自限性，僅1例發(fā)生PTLD，且該患者病史長達(dá)10余年，長期應(yīng)用免疫抑制藥物，基礎(chǔ)條件較差，移植后免疫重建延遲。

此回顧性研究證實UC-MSCs在RSAA患者HID-HSCT中的應(yīng)用安全可行，可能有效提高植入率，降低重度GVHD和cGVHD的發(fā)生率。但本研究樣本量少，仍需大樣本量、隨機雙盲對照臨床試驗，以證實聯(lián)合MSCs在單倍型HSCT治療SAA患者的療效及安全性。