肉芽腫性炎組織中結核分枝桿菌檢出方法的對比分析及應用價值

李江偉，尹翠翠，李振乾，秦慧，黃培，雷旭

(鄭州大學第一附屬醫院 a.病理科;b.呼吸內科，河南 鄭州 450052)

肉芽腫性炎是臨床病理檢查中常見的病理改變，雖然多種致病因素都可導致肉芽腫性炎的形成，但以結核分枝桿菌感染更為多見。據世界衛生組織發布的最新版全球結核病報告顯示，我國2020年新發結核病患者約82.4萬人，估算發病率約為59/10萬人，在30個結核病高負擔國家中我國預計病例數排第2位，僅次于印度[1]，結核病已經成為我國的重大公共衛生問題之一。

臨床上結核病的檢查方法有多種，而任何一種方法都不完善，均不能單獨地明確診斷結核病。組織病檢直接取材于結核病灶，相較于其他檢材，更有一定的針對性，對病檢組織進行常規的結核分枝桿菌的檢測，有助于臨床醫生及時判斷病情和治療。本研究對373例肉芽腫性炎石蠟包埋組織進行常規的抗酸染色和結核分枝桿菌DNA(MycobacteriumtuberculosisDNA，TB-DNA)檢測，比較兩者在組織中的檢出效能的差異，并分析它們與其他實驗室檢測指標的關聯，以期對結核病的早期診斷和治療有所幫助。

1 材料與方法

1.1 標本來源2022年1—5月鄭州大學第一附屬醫院送檢的各種類型組織標本373例，病理均初診為“肉芽腫性炎，結核不除外”，或“需要特殊染色和TB-DNA協診”。入圍病例中，男202例，女171例，年齡2～85歲，平均(49.39±17.02)歲，中位年齡53歲。送檢標本中肺組織標本(包含肺活檢和肺部分切除)174例，胸腔積液沉渣細胞塊35例，淋巴結組織標本35例，胃腸和腎組織各12例，頸部腫物組織12例，胸膜組織(包括胸膜活檢和切除)11例，輸尿管活檢組織標本6例，縱隔組織4例，其他組織標本包括支氣管、肝、皮膚、宮內膜、腦、聲帶、關節滑膜組織等共72例。

1.2 試劑與儀器抗酸染色試劑盒為Baso公司產品；DNA提取試劑盒為Omega公司產品，TB-DNA熒光定量試劑盒為凱基公司產品，使用ABI 7500型PCR儀進行定量擴增。

1.3 DNA的提取組織蠟塊5 μm切片，將切片卷起裝入1.5 mL EP管中，每切取1個蠟塊，即用體積分數為75%的酒精清潔消毒刀位周圍，防止組織之間污染。短暫離心，將組織切片離心于管底。用二甲苯脫蠟2次，使用無水乙醇漂洗2次，然后在EP管中放置晾干。之后按照Omega DNA提取試劑盒說明書的過程操作，最后洗脫DNA，保留DNA洗脫液的離心管。使用Nanodrop測量DNA濃度和A260/A280。

1.4 PCR擴增從試劑盒中取出TB PCR反應液、Taq酶和UNG酶，融化后離心10 s，按照試劑盒說明書的方法，計算各試劑的使用量，配制40 μL反應體系，包括37.8 μL TB PCR反應液，0.2 μL Taq酶，0.06 μL UNG酶，2 μL DNA樣本(包括待測樣本、強陽性對照和陰性對照)，使用ABI 7500熒光定量PCR儀擴增，循環條件設置如下：37 ℃，5 min；94 ℃，1 min；40個循環；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。結果判定：強陽性對照樣本、陽性樣本檢測時有明顯的S形曲線，陰性對照和陰性樣本則沒有；檢測樣本的CT值為40，0和無數值時，檢測結果為陰性；檢測樣本CT值≤37時，檢測結果為陽性；檢測樣本CT值>37的樣本需要復檢，復檢結果CT值<40者，檢測結果仍為陽性，否則為陰性。

1.5 抗酸染色按照Baso抗酸染色試劑盒說明書的要求，所有待測石蠟包埋組織蠟塊3 μm切片，70 ℃烤片，二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，石炭酸復紅液染色30 min；酸性酒精分化液分化至無染料脫出；亞甲藍染色30 s；梯度酒精和二甲苯脫水透明，中性樹膠封片。

1.6 其他實驗室檢測結果回顧及判斷標準回顧查驗抗酸染色或TB-DNA陽性病例的病歷資料和其他相關的實驗室檢查結果，收集數據，分析組織抗酸染色或TB-DNA檢測與它們之間的關聯。本研究以臨床確診結核/肺外結核病為判斷標準，敏感度為真陽性標本數/確診陽性總例數，特異度為真陰性標本數/確診陰性總例數，一致符合率為(共同陽性+陰性符合數)/總例數。CT影像和抗酸染色陽性的判斷標準依據《痰涂片鏡檢查標準化操作及質量保證手冊》和文獻報道執行[2-4]，均經2位有經驗的醫生復驗確定。

1.7 統計學分析定性資料率的比較用R×C列聯表的χ2檢驗或配對資料的χ2檢驗等統計方法分析，當樣本數n<40或理論頻數T<1或有1≤T<5的格子數大于格子總數的1/5時，則使用Fisher’s exact test法檢驗，所有數據均使用SPSS 19.0統計軟件分析，P<0.05(雙側)為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗酸染色和TB-DNA在各肉芽腫性炎組織中的陽性率肺活檢、胸腔積液沉渣細胞塊、淋巴結活檢、胃腸活檢、腎組織、頸部腫物、胸膜活檢、輸尿管活檢、縱隔活檢和其他組織等各類型組織抗酸染色、TB-DNA的陽性表現如圖1所示。在373例各類型組織標本中，共檢測到抗酸染色陽性73例，總陽性率為19.57%(73/373)；TB-DNA陽性102例，總陽性率為27.35%(102/373)。見表1。各類型組織抗酸染色的陽性率差異無統計學意義(χ2=9.139，P=0.425)，而各類型組織TB-DNA陽性率的差異有統計學意義(χ2=31.239，P<0.001)。

A為組織樣本抗酸染色呈陽性(40×)，鏡下見紅色桿狀細菌；B為FQ-PCR檢測組織樣本TB-DNA呈陽性，見“S”型曲線，紅紫色曲線為陽性對照。

表1 373例各類組織標本抗酸染色和TB-DNA檢測結果

2.2 抗酸染色和TB-DNA在肉芽腫性炎組織中檢測結核分枝桿菌的效能對比分析在檢測的373例組織標本中，58例抗酸染色和TB-DNA均為陽性，抗酸染色陽性而TB-DNA陰性的有15例，抗酸染色陰性而TB-DNA陽性的有44例，兩者均為陰性的有256例，兩種檢測的一致符合率為84.18%(314/373)；抗酸染色的檢驗效能低于TB-DNA的檢驗效能，差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。本研究中，檢測到117例組織抗酸染色和(或)TB-DNA呈陽性，查閱臨床病歷資料，其中106例確診為肺結核病或肺外結核病。抗酸染色在106例確診病例組織中的陽性率為60.38%，即抗酸染色的敏感度和特異度分別為60.38%、96.63%；TB-DNA在這些組織中的陽性率為94.34%，即TB-DNA的敏感度和特異度分別為94.34%、99.25%，兩者比較，TB-DNA檢測有更高的敏感度(χ2=34.902，P<0.001)和特異度(χ2=4.548，P=0.033)。見表3。

表2 兩種檢測方法檢出結核分枝桿菌的對比分析

表3 兩種檢測方法敏感度和特異度

2.3 TB-DNA與CT影像和其他實驗室檢測項目比較分析在確診為肺結核病或肺外結核病的106例病例中，99例患者有其他相關的影像或實驗室檢查資料。在有CT影像檢查資料的97例中，82.47%(80/97)病例的肺部CT有陽性發現，TB-DNA的陽性檢出率高于CT影像的陽性檢出率，差異有統計學意義(χ2=5.968，P=0.015)。31例病例同時進行了痰或其他體液的涂片抗酸染色，但僅有6.45%(2/31)的病例涂片呈陽性，FQ-PCR在檢出結核分枝桿菌方面要優于體液涂片的抗酸染色(χ2=43.658，P<0.001)。50例病例進行了T-SPOT.TB檢驗，96.00%(48/50)的病例呈陽性，TB-DNA和TB-SPOT.TB在篩選結核病例時差異無統計學意義(P>0.999)；10例病例進行了γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay, IGRAs)，80.00%(8/10)的病例呈陽性；17例病例進行了TB特異性細胞免疫反應實驗，82.35%(14/17)的病例呈陽性反應，TB-DNA、IGRAs和TB特異性細胞免疫反應在陽性率方面差異無統計學意義(P=0.474、0.227)，即三者在檢出結核病例方面效果相當，但要優于體液涂片的抗酸染色，也要優于CT影像檢查。

3 討論

肉芽腫性炎是臨床病檢中常見的病理改變，也是結核病主要的病理變化。現階段，早期診斷和治療仍為阻斷結核病發展的有效措施，在病檢材料中檢出結核分枝桿菌是確診結核病的重要依據。目前，并沒有一種萬能的方法能單獨確診結核病，但結核病患者的病檢材料已不限于痰液，血液、體液和活檢組織等都可以用于檢測，相應的實驗室檢查方法有體液涂片或組織的抗酸染色、FQ-PCR技術檢測TB-DNA，以及基于γ-干擾素釋放和細胞免疫反應原理發展起來的T-SPOT.TB、IGRAs和TB特異性細胞免疫反應等相關技術，而結核分枝桿菌分離培養仍是確診結核病的金標準[4]。病原學和病理學檢查均是確診結核病的重要依據，活檢和手術切除標本直接取材于病灶部位，在診斷結核病方面有較其他病檢材料獨特的優勢。本研究選取了373例近半年來初診為肉芽腫性炎的病例為研究對象，意圖闡述在肉芽腫性炎組織中兩種結核分枝桿菌檢測方法的優勢，以及它們與其他實驗室檢測指標聯合應用的價值。

在本研究中，抗酸染色在送檢的肺、胸腔積液沉渣細胞塊、淋巴結、胃腸活檢等組織中的陽性率大致相當，盡管在病例少的組織中肉芽腫性炎中檢出率較低，但總體上差異無統計學意義；而TB-DNA的陽性率在以上組織中則變化明顯，主要表現在肺和腎組織中的陽性率較其余組織高，差異有統計學意義。筆者認為這主要與肺組織標本的送檢量比較大，肺外結核中腎結核的發病率高，而其他肺外結核的發病率、送檢量均較低有關。本研究結果與吳俊峰、郝穎華等[5-6]的報道結果接近，介于兩者之間。

抗酸染色法在檢測結核分枝桿菌方面有諸多優點，比如簡便、快速、價廉等，缺點是對樣本質量的依賴性大，不能區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，重要的是檢出率比較低，對結核病診斷的幫助有限。FQ-PCR技術檢測TB-DNA不僅可以檢測到結核分枝桿菌核酸的存在，而且可以判斷結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，已經廣泛地應用于臨床檢測。本研究中，TB-DNA的陽性率高于抗酸染色的陽性率，具有更好的靈敏度和特異度，與之前在痰標本中的報道結果[7]保持一致，而與孫林雍等[8]在骨組織中得到的TB-DNA陽性率略低于其抗酸染色陽性率的結果不同。這可能與樣本選取和骨組織的特殊處理方法(脫鈣)有關。TB-DNA和抗酸染色也有不一致的結果，原因是多方面的。少數情況下出現TB-DNA呈陰性而抗酸染色呈陽性，原因可能是抗酸染色不能分辨結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，特異度稍低，也可能由于結核分枝桿菌在組織中量少和分布不均，FQ-PCR檢測時切片中已無結核分枝桿菌。一般情況下，TB-DNA呈陽性而抗酸染色呈陰性，這是由于PQ-RCR檢測TB-DNA有較高的靈敏度和特異度。本研究中使用的TB-DNA檢測試劑盒，組織中有1～10個結核分枝桿菌時就可以檢測出來，而體液或組織中需有更多的結核分枝桿菌存在時[9]，抗酸染色才能檢測出來。多數情況下，抗酸染色和TB-DNA的檢測符合率較好，在臨床病理檢測中，兩種方法常聯合檢測，互相印證。本研究中兩種方法檢測的一致符合率達到84.18%，證明兩者在組織層面對結核病的診斷有相輔相成的重要價值。FQ-PCR技術檢測組織中TB-DNA已有較高的檢出率，但也有部分標本由于取材有限、組織中結核分枝桿菌較少、DNA提取或定量試劑盒的不同、使用抗結核藥物等因素，TB-DNA在肉芽腫性炎組織中檢測仍可能造成漏診，其中也有假陰性的問題。數字微滴PCR部分解決了這個問題[10]，據文獻報道，使用數字微滴PCR技術可以使TB-DNA的檢出率明顯提升，但該技術尚未應用于臨床。

本研究還比較了病例檢測組織中TB-DNA與其影像、其他實驗室檢查資料之間的關系。本實驗數據顯示，TB-DNA在檢出結核陽性病例方面要優于CT影像，但與T-SPOT.TB、IGRAs和結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應等實驗室檢查相比較，差異無統計學意義，與文獻報道的數據[11-12]略有不同，主要原因可能是樣本量的大小、標本種類和檢測方法的差異。盡管TB-DNA是病原學檢測，后三者是基于機體細胞免疫反應的不同免疫學檢測方法，但在臨床上分別為高度提示結核分枝桿菌感染的直接和間接證據，本研究為首次報道。

綜上所述，常規運用抗酸染色和PQ-PCR技術檢測TB-DNA在肉芽腫性炎組織中檢測結核分枝桿菌的存在，對結核相關疾病的早期診斷和治療有重要的價值，但由于存在的許多困難仍無法完全克服，開發和使用更先進的技術，聯合使用影像、多種實驗室檢查項目等，必會使結核病的早期診斷和規范化治療成為現實。